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分子实验设计
分子实验设计
——绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌中的表达
张评瑜2013141241157田晓震2013141241097
绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。
EGFP（EnhancedGFP）即增强型绿色荧光蛋白，它的27kDa的单体由238个氨基酸构成，本身就是一个生物发光系统，附带有激发后能发射生物荧光的发光色基。
其发光过程不同于其它生物发光组织，是不需荧光素酶参与的。
在紫外光激发下可发绿色荧光，常用作信号蛋白或报告基因。
将目的基因与EGFP基因插入载体重组表达后，可形成融合蛋白。
通过荧光显微镜、共聚焦显微镜或紫外灯观察，可直接在活细胞中检测其荧光信号，简易方便地定性检测目的基因的表达，以及进一步研究目的蛋白的定位与动态过程。
实验步骤：
目的基因的获取——基因表达载体的构建——转化——目的基因筛选与鉴定
1、质粒DNA的提取及琼脂糖电泳检测
1.1质粒DNA的提取
1.1.2方法：
碱裂解法
1.1.3原理：
pEGFP-N3质粒是一个用于在哺乳动物细胞系中表达EGFP融合蛋白的质粒，它编码了EGFP蛋白，是野生型绿色荧光蛋白（wtGFP）经技术改造而成的遗传突变体;pet原核表达质粒是最有效的原核表达系统之一。
目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译信号控制；表达由宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导。
宿主菌带有受lacUV5控制的T7RNA聚合酶基因，可以通过IPTG来启动表达。
充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50％以上。
分离质粒DNA的方法一般包括三个基本步骤：
培养细菌使质粒扩增、收集和裂解细菌、分离和纯化质粒DNA。
50mmol/L葡萄糖、10mmol/EDTA-Na、25mmol/LTris-HCl（pH8.0）分散细胞，其中螯合金属离子使酶失活，防止DNA的降解；0.4mol/LNaOH和2%SDS临用前1：
1配制，使细胞裂解，蛋白质与染色体DNA发生变性；60ml5mol/L醋酸钾、
11.5ml冰醋酸、28.5ml双蒸水使DNA在酸性条件下复性，留在上清液，大肠杆菌DNA和蛋白质-SDS复合物等发生沉淀。
1.1.4实验用品：
1.1.4.1仪器：
恒温摇床，高压灭菌锅，超净工作台，10、100、1000μL微量移液器各一支，台式高速离心机，制冰机，混合漩涡器。
1.1.4.2材料:
含质粒pET-28a和pEGFP-N3菌液、.5ml塑料离心管、EP管架、微量取液器和取液器吸头、常用玻璃器皿（如三角瓶、量筒、试剂瓶）等
1.1.4.3试剂：
LB培养液:
胰蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeastextract）5g，NaCl5g，琼脂（固体培养基）15g，用1NNaOH调pH7.5。
溶液Ⅰ：
50mmol/L葡萄糖，10mmol/EDTA-Na，25mmol/LTris-HCl（pH8.0）；溶液Ⅱ：
0.4mol/LNaOH，2%SDS，临用前1：
1配制；溶液Ⅲ：
5mol/L醋酸钾60ml，冰醋酸11.5ml，双蒸水28.5ml；卡纳霉素（50mg/mL）；抽提液（饱和酚：
氯仿：
异戊醇=25：
24：
1）；无水乙醇；70%乙醇；TE缓冲液或ddH2O
1.1.5步骤：
1.1.5.1将含pET-28a质粒的大肠杆菌，含pEGFP-N3质粒的大肠杆菌分别接种在液体培养基中（加卡那霉素50μg/mL），37℃培养过夜。
1.1.5.2取培养菌液1.5mL置Eppendorf小管中，10000rpm离心2min，弃上清液。
1.1.5.3加入100μL溶液I，漩涡器上充分混匀，在室温下放置10min。
1.1.5.4加入200μL新配制的溶液Ⅱ，轻轻翻转2~3次，使之混匀，冰上放置5min。
1.1.5.5加入150μL冰冷的溶液Ⅲ，盖紧后，温和颠倒3-5次使混匀，产生白色絮状物，冰上放置15min。
1.1.5.610000rpm离心5min，取上清液于另一干净的离心管中。
1.1.5.7向上清液中加入等体积（约400μL）酚：
氯仿/异戊醇（25：
24:
1，v/v），振荡混匀，10000rpm离心10min，将上清液转移至新的离心管中。
1.1.5.8加入等体积（约370μL）氯仿/异戊醇（24:
1），混匀，离心2min,取上清液于新离心管中。
1.1.5.9向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，-20℃放置1h。
1.1.5.1012000rpm离心5min，倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。
1.1.5.11加800μL70%乙醇，12000rpm离心1min，倒尽上清液，室温自然干燥30min。
1.1.5.12加30μLddH2O，-20℃保存备用。
1.1.6注意事项：
）
1.1.6.1饱和酚（取下层）单独吸200μL，氯仿：
异戊醇（24：
1）吸200μL。
1.1.6.2制备质粒过程中，所有操作必须缓和，不要剧烈振荡（特别是加入溶液II和III），以避免机械剪切力对DNA的断裂作用。
1.1.6.3在取各种试剂的过程中，一定注意移液器吸头的更换，避免污染。
1.2琼脂糖电泳检测
1.2.1方法：
琼脂糖电泳
1.2.2原理：
DNA的琼脂糖凝胶电泳可以分离长度为200bp至近50kb的DNA分子。
DNA的迁移率（U）的对数与凝胶浓度（T）之间存在反平行线性关系。
因此，要有效地分离不同大小的DNA片段，选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常重要的。
在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：
线性DNA、开环DNA、闭环超螺旋DNA。
当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA泳动速度：
闭环超螺旋〉线状〉开环。
但有时也有也会出现相反情况，因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及核酸染料含量有关。
1.2.3实验用品：
1.2.3.1材料和仪器
电泳仪，电泳槽，样品槽模板（梳子），有机玻璃内槽，微波炉，水平仪，10、100、1000μL微量取液器各一支，凝胶成像系统，提取的pET-28a和pEGFP-N3质粒，琼脂糖，锥形瓶，一次性手套，胶铲，封口膜，剪刀，取液器吸头。
1.2.3.2试剂
Goldview（DNA染料）；0.5×TBE缓冲液：
Tris10.88g、硼酸5.52g、EDTA·Na2·2H2O0.74g，定容至200ml，使用时稀释10倍；6×上样缓冲液：
溴酚蓝0.25％、蔗糖40%；DNAmarker。
1.2.4步骤：
1.2.4.1琼脂糖凝胶板的制备
称取0.3g琼脂糖，置于锥形瓶中，加入30mL0.5×TBE缓冲液，微波炉加热直至琼脂糖溶解。
待胶液冷却到65℃（不烫手为宜），加入1μLGoldview混匀，排除气泡,缓慢倒入事先准备的制胶有机玻璃槽（插入样品槽模板梳子）内。
静置30min左右，轻轻晃动拔出梳子。
1.2.4.2加样
胶板放入电泳槽中（样品孔位于负极），注入0.5×TBE缓冲液淹没过胶板5mm，用取液器将提取的质粒DNA5μL与1μL6×上样缓冲液混匀，加入胶板的样品小槽内。
1.2.4.3电泳
将电泳槽与电泳仪接通，调节电压为100V左右，直至缓冲液的蓝色指示剂移动到距离胶板边沿约1~2cm处，停止电泳。
1.2.4.4观察和拍照
将胶板小心取出，放入凝胶成像系统中，调节位置居中，波长为254nm的紫外灯下，观察凝胶中DNA存在处显示出荧光条带。
1.2.5实验结果预测：
正常情况下会出现两条条带（闭环和开环质粒）。
2、基因表达载体的构建
1、DNA限制性内切酶酶切
1.1方法：
DNA限制性酶切
1.2原理：
生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。
由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶（简称限制酶）。
pet原核表达质粒是最有效的原核表达系统之一。
目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译信号控制；表达由宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导。
宿主菌带有受lacUV5控制的T7RNA聚合酶基因，可以通过IPTG来启动表达。
充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50％以上。
酶切位点：
BamHI
NotI
1.3实验用品：
1.3.1材料：
实验一提取的质粒pEGFP-N3和pET-28a，0.2mlEP管，取液器吸头，一次性手套
1.3.2试剂：
NotI,BamHI,ddH2O，10×buffer，琼脂糖，Goldview
1.3.3设备：
移液器，台式高速离心机，凝胶电泳系统，凝胶成像系统，恒温培养箱
1.4步骤：
1.4.1分别去两支0.2mlEP管做上记号：
如①②
1.4.2两个EP管中分别配置下列的30μL体系：
①号管
②号管
BSA
3μl
3μl
10xBuffer
3μl
3μl
NotI
2μl
2μl
BamHI
2μl
2μl
质粒
pET-28a：
20μl
pEGFP-T1：
20μl
1.4.3将两只EP管混匀后瞬时离心，放入恒温培养箱370C酶切3h。
1.4.4取5μL①②EP管的酶切反应液，同时取5μL原质粒溶液作对照，进行电泳检测酶切结果。
1.4.5按照回收试剂盒步骤切胶回收所需酶切产物片段
2、连接重组
2.1方法：
DNA连接重组
2.2原理：
图3-1DNA连接酶连接作用的分子机理
连接的DNA分子具备的条件：
具有相同粘性末端（同种酶切的片段）的DNA分子比较容易连接在一起，因为相同的粘性末端容易通过碱基配对氢键形成一个相对稳定的结构。
连接反应温度：
理论上讲，连接反应的最佳温度是370C，此时连接酶的活性最高。
但370C粘性末端分子形成的配对结构极不稳定，因此，人们找到了一个最适温度，即12~160C。
此时既可最大限度地发挥连接酶的活性，又有助于短暂配对结构的稳定。
本实验选择160C。
2.3实验用品：
2.3.1材料：
酶切后的EGFP和pET-28a，0.2mlEP管，取液器吸头，一次性手套
2.3.2试剂：
T4DNA连接酶,ddH2O，T4DNA连接酶buffer
2.3.3设备：
移液器，台式高速离心机，PCR仪
2.4步骤：
2.4.1在EP管中分别配置下列的体系：
0.2mlEP管
10xbuffer
2μl
酶切后的pET-28a
Xμl
没切后的EGFP片段
Yμl
T4DNA连接酶
2μl
X：
Y=1:
3～10，用水补足20μL。
2.4.EP管中液体混匀后瞬时离心，放入培养箱160C反应过夜后，-200C下保存用于转化。
3.重组DNA的转化及重组子的鉴定
3.1重组DNA分子的转化
3.1.2方法：
热转化法
3.1.3原理：
细菌处于容易吸收外源DNA的生理状态叫感受态。
转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA分子导入细菌的过程。
其原理是细菌处于00C，在有CaCl2存在的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。
转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经420C短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。
将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型（在本实验中为卡那霉素抗性）得到表达。
在含Kana的选择性培养基上进
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