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维生素C生产现状及应用研究

1引言

　　维生素C（简写为VC），又名L2抗坏血酸，化学名称为L232氧代苏乙糖醛酸内酯，CA登记号为50-81-7，分子式为C6H8O6。

VC是1种重要的维生素类药物，可用于预防、治疗疾病，还可作为强化剂和抗氧化剂大量用于食品行业中。

近些年，VC在饲料方面的应用发展也很迅速。

此外，VC在化学工业中可用作聚合物的促进剂及调节剂。

随着人们对VC研究的深入和对其新用途的开发，VC的需求量将会与日俱增。

2应用情况

2.1医疗上的应用

Vc是人体不能合成的维生素,也是人类生存不可缺少的营养要素之一。

Vc的作用较复杂，它参与人体内的氧化还原过程，参与氨基酸的代谢、神经递质合成和细胞间质胶原蛋白的合成。

它能增加组织中的环磷腺昔、环磷鸟昔的含量，增强机体的抗病能力和解毒功能，改善肝功能。

Vc还具有降血脂、加速血液凝固、抗组胺和阻止致癌物质亚硝胺生成的作用。

临床上Vc用途很多，可防治坏血病、细菌感染性疾病、病毒感染性疾病、动脉粥样硬化治疗高血压、克山病心源性体克、肝脏疾病、胆绞痛、贫血、特发性血小板减少性紫瘫、过敏性疾病和胶原病、银屑病、氟骨症、肤氨酸尿石症、剥脱性角质松解症、色素沉着、黄褐斑能促进骨折愈合、伤口愈合、防治癌症，还可用于甲亢、精神病、糖尿病等的辅助治疗。

目前Vc已被收入美、英、法、德、日等多国药典和欧洲、国际药典，中国药典1995年版也收载了Vc原料药和片剂，泡腾片、颗粒剂、注射液等四种制剂。

2.2食品中的用途

最近，一些科学家提出了“世纪营养新概念”，过去人们的膳食以预防营养不足为目标，而现在则应以预防疾病、强身建体为出发点。

美国保罗拉勒斯教授说：

由于外界因素，诸如辐射、吸烟、空气污染、过度劳累、微生物感染等原因，人体内部产生的“自由基”越来越多，这就需要富含抗氧化作用和含自由基消除剂的食品来阻止、抑制或结合那些致病因子，削弱自由基对人体的危害。

具体作法是补充更多Vc及Ve等维生素。

在西方国家中，Vc大量添加在各种食品和饮料中，用量很大。

如用于食品保鲜、贮藏、健康食品添加剂，人体营养剂，桔子汁、果冻、果酱的维生素强化剂及油脂的抗氧化等等。

美国1995年消费的Vc中,食品和饮料行业占35%,达到6000吨。

1992年日本Vc消费量的用在食品和饮料行业中，英国等国对饮料、罐头、面粉、面包、葡萄酒、饮料、牛奶制品等产品中添加Vc的量都作了详细规定。

3生产工艺进展

3.1_莱氏法

莱氏法是1933年德国化学家Reichstein等发明的最早应用于工业生产VC的方法。

该法以葡萄糖为原料，经催化加氢制取D-山梨醇，然后用醋酸菌发酵生成L-山梨糖，再经酮化和化学氧化，水解后得到2-酮基-L-古洛糖酸（2-KLG）,再经盐酸酸化得到VC。

莱氏法生产的VC产品质量好、收率高。

由于生产原料廉价易得,中间产物的化学性质稳定，至今仍是许多国外VC生产商,如Roche公司、BASF/Takeda公司和E.Merck公司等厂商采用的主要工艺方法。

但是莱氏法也存在不少缺陷,诸如生产工序多、劳动强度较大，使用大量有毒、易燃化学药品，容易造成环境污染等。

为此,自20世纪60年代起,各国学者一直致力于莱氏法的改进。

莱氏法化学合成工艺

莱氏法合成工艺线路

3.2二步发酵法

70年代初，我国首先研究出两步发酵法，其先进性得到世界公认，它是以生物氧化过程代替莱氏路线的部分化学合成过程，进而合成维生素C。

3.2.1发酵

二步发酵法的生物转化过程如下:

__其中，D-山梨醇转化为L-山梨糖是由黑醋酸菌完成的，该工艺在莱氏法中就已使用，由于工艺成熟且生物转化率高（98%以上），因此在二步发酵法中得以延用。

3.2.2提取工艺

二步发酵法两次发酵以后，发酵液中仅含8%左右的2-KLG，而残留菌丝体、蛋白质、多糖或悬浮微粒等杂质的含量却很高。

这给2-KLG的分离提纯带来了很大困难，致使后处理费用占总成本的比例较大。

目前，V工业生产中常用的2-KLG的分离提纯方法有加热沉淀法、化学凝聚法和超滤法。

①加热沉淀法

加热沉淀法是2-KLG分离提纯的传统工艺，分离手段较为落后。

此工艺通用氢型树脂，调pH至蛋白质的等电点后加热除蛋白。

采用此工艺会造成有效成分在高温下降解损失，且发酵液直接通过树脂柱，造成树脂表面污染，降低树脂的交换容量和收率。

两次通过树脂柱带进了大量水分，也增大了浓缩耗能。

②化学凝聚法

化学凝聚法是通过加入化学絮凝剂来除去蛋白质、菌体、色素等杂质，避免了加热沉淀时有效成分的损失。

季光辉等采用化学凝聚法对VC发酵液进行预处理，使2-KLG的滤液质量提高，提取前步收率提高5.2%，VC总收率提高2.5%以上。

以壳聚糖为主凝剂，聚丙烯酰胺为助凝剂，通过化学凝聚法除蛋白工艺。

提取收率由原来的76%提高到82%，古龙酸优级品率由原来的35%提高到60%,成本比原来降低20%。

但是化学凝聚法也存在许多不足，比如在处理后的发酵液离心后所得的上清液中任然存在一定量的蛋白，如果发酵液染菌则处理效果更不明显，上清液浑浊，严重影响了产品的品质和收率。

此外，化学凝聚法在操作过程中也会对环境造成污染。

③超滤法

超滤是一种新兴的膜处理技术，此法具有操作方便、节能、不造成新的环境污染等优点，因此在2-KLG的分离提纯中的应用日益广泛。

此法与加热沉淀法不同的是，可在常温下操作，可减少有效成分的损失；在用膜除蛋白的过程中，无任何新的化学物质加入，可减少对树脂的污染和损耗，降低酸碱用量，减少三废排放。

与化学凝聚法不同的是，在处理染菌的发酵液时仍可达到较好的处理效果。

我国的东北制药厂1995年从丹麦引进目前全国最大膜面积的平板超滤装置后，2-KLG的分离提纯成本比原先的化学凝聚法节约了600万元，其收率和生产的自动化、连续化程度也明显提高。

随着新型膜材料技术的开发，如陶瓷膜、不锈钢膜等的应用，超滤法的应用效果会有进一步的提高。

同时,国内外正在探索反渗透、纳滤等后序处理新工艺的应用,以完善工艺联结。

3.2.3转化工艺

无论是莱氏法还是二步发酵法制得的2-KLG，目前在生产上都是通过化学反应过程转化为VC。

根据所选试剂的不同，二步发酵法可分为酸转化法和碱转化法。

①酸转化法

VC化学转化生产，自莱氏法建立以来就采用浓盐酸催化2-KLG，一步制得VC。

国外有关学者对此法进行了许多研究。

印度AhmedbadTextile工业研究协会研究表明，在以饱和氯代烃（如CHCl3）、芳烃（如苯、甲苯）为溶剂,由2-KLG与浓盐酸在60~75℃下反应4~6h,可制得纯度为90%的粗VC。

美国学者YODICE等于1985年报道了2-KLG与浓盐酸在表面活性剂Me（CH2）5N+Me3Cl的甲苯溶液中反应，可制得纯度超过99%的VC。

酸转化法工艺简单，操作步骤少，但反应过程中选用浓盐酸对设备腐蚀严重。

另外，由于在反应体系中引入了惰性溶剂或表面活性剂，使后期的分离造成不便②碱转化法

我国VC生产厂家均采用碱法转化2-KLG生产VC。

东北制药总厂等生产单位将2-KLG与甲醇在浓硫酸催化下生成2-酮基-L-古龙酸甲酯，该酯在NaHCO3作用下发生内酯化反应生成VC钠盐。

该法避免了酸催化的上述缺点，且操作工艺简单，反应条件温和，适合于规模化生产，但是在生产中的反应周期过长，甲醇单耗高。

有些单位尝试用CH3ONa代替NaHCO3进行碱转化，转化率可高达92.6%，但产品质量较差，且甲醇钠价格贵，造成生产成本较高。

由VC钠盐制备VC所采取的主要方法是硫酸酸化法和树脂交换法。

硫酸酸化法操作简单，但需妥善控制甲醇的浓度和pH值,才能使硫酸钠与VC得以分离。

氢型离子树脂交换法设备庞大，操作复杂，且需经常再生树脂，增加了酸耗，酸液大量排放容易对环境造成威胁。

目前，人们正在积极探索使用双极性膜（BipolarMembraneElectrodialysis，BME）来代替传统的酸化工艺，其工作原理为：

在直流电场作用下，双极性膜中的水被离解成H+和OH-，H+替换VC钠盐中的Na+结合成离解度小的VC,原VC钠盐中的Na+在电场的作用下通过阳离子交换膜从VC钠盐中分离出来,并和OH-结合生成NaOH。

双极性膜电渗析法无需外加物料可将VC钠盐转化成VC，过程简单，能耗低，投资少，转化率高，其副产品和NaOH稀溶液也可被有效利用，对环境无污染，有望应用到实际生产中。

3.3葡萄糖直接发酵法

不能以葡萄糖作为直接发酵原料是二步发酵法的最大缺陷之一。

国外较早就开始了细菌串联发酵葡萄糖产生2-KLG的研究。

Sonoyama研究发现，欧文氏菌的突变株（Erwinia）可将D-葡萄糖氧化成为2，5-二酮基-D-葡萄糖酸,再经棒状杆菌属、短杆菌属、节杆菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属或葡萄球菌属等其中的某些菌株还原成2-KLG。

考虑若能将欧文氏菌和棒状杆菌相关的特性结合于一种微生物中,构建VC基因工程菌，就可实现从D-葡萄糖到2-KLG的一步发酵。

近年来，基因工程菌的研究已成为世界上热点课题之一，美国、瑞士、法国、日本等许多国家都着力开展了此方面的研究。

1985年，美国Genentech公司Anderson等人成功地分离纯化了棒杆菌（Corynebacteriumsp.）ATCC31090的2，5-DKG还原酶,并分析了该酶N-端的40个氨基酸序列，用原位杂交法从部分基因文库中筛选到一个基因片段，再以已知片段为探针得到了完整基因，最终该基因被重组到了另一株发酵生产菌草生欧文氏菌（E.herbicolaATCC21998）中,得以有效表达,从而实现了从D-葡萄糖到2-KLG的一步发酵。

该法的合成效率很低，只有5%左右，主要是由于合成2，5-DKG的3种关键酶D-3葡萄糖脱氢酶、D-葡萄糖酸脱氢酶、2-酮基-D-古龙酸脱氢酶（存在于周质中）与2，5-DKG还原酶（存在于胞质）在细胞中所处位置的较大差异造成。

后来Grindley等经过改进,将棒杆菌的2，5-DKG还原酶的基因在E.citreus上表达，将收率提高至49%。

所有这些都为最终构建基因工程菌打下了基础。

二步发酵法发酵条件优化

“二步发酵法”是在“莱氏法”一步发酵的基础上继续经过氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacteroxydans）（俗称小菌）和其伴生菌芽孢杆菌（Bacillusspp.）（俗称大菌）两种菌株的混合发酵[1-2]生产Vc的前体物质2-酮基-L-古龙酸（2-KLG）。

该方法在Vc生产中一直占据着主导地位。

本实验研究了混合菌系的发酵条件，优化混合菌系的发酵工艺。

1实验材料

1.1菌种

氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacteroxydans）（俗称小菌）,蜡状芽孢杆菌（Bacilluscereus）,巨大芽孢杆菌（Bacillusmegatherium）（俗称大菌）。

1.2培养基

种子培养基：

L-山梨糖1.5%，玉米浆0.3%，蛋白胨0.5%，尿素0.4%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O0.02%，CaCO30.03%，pH6.8~7.0,121℃灭菌30min。

一次投糖发酵培养基：

L-山梨糖8%，玉米浆1.5%，尿素0.01%，MgSO4·7H2O0.01%,消沫剂0.005%，酵母膏0.01%，（NH4）2SO40.01%，CaCO30.05%，pH6.5~6.7，121℃灭30min，分离培养基。

2实验方法

2.1种液的制备

用适量无菌水洗斜面，然后取少量混菌液接种到250mL三角瓶培养48h,涂布到分离培养基平皿上，培养4~5d后大小菌搭配，然后在（30±1）℃条件下茄子瓶斜面培养4d，经摇瓶扩大培养后，最后接到10L不锈钢种子罐中培养18~24h，即为生产用种液。

2.22-酮基L-古龙酸（2-KLG）浓度的测定

碘量法测定。

3实验结果与分析

3.1起始糖浓度对糖酸转化率的影响

起始糖浓度对糖酸转化率的影响

起始糖浓度/%

4

6

8

10

酸量/（mg/mL）

39.02

56.64

73.66

78.61

转化率/%

90.52

87.60

85.45

72.95

发酵培养基中不同的L-山梨糖起始浓度可以明显地改变菌系大小菌之间的数量比例，有效地调节混合菌系的产酸代谢。

表2中数据说明，当发酵培养基中L-山梨糖的起始浓度为10%时产酸量最高，但是糖酸转化率最低，这可能是因为过高的糖浓度会抑制菌体产酸。

起始糖浓度为4%时，转化率高达90.52%，但是在大生产中投糖量过低会造成其他资源的浪费，降低设备的有效利用率，提高发酵成本。

所以采用8%的起始糖浓度最为合适。

3.2微量元素对新菌系生长代谢的影响

微量元素对菌系酸量的影响

生长因子

VB1

VB2

VB1+VB2

产酸量/（mg/mL）

72.06

71.84

74.44

转化率/%

83.58

83.33

86.35

在发酵培养基中添加（VB10.01%，VB20.01%）混合后的VB1和VB2混合物要比添加等量的单一微量元素VB1（0.01%）或VB2（0.01%）对菌系产酸的影响大,使菌系对L-山梨糖的转化率达到86.35%。

这是因为它们可以提高混合发酵中大小菌之间的协调性，增强菌体代谢活力。

3.3起始pH值对菌系产酸量的影响

起始pH值对菌系产酸量的影响

pH

6.0

6.5

7.0

7.5

产酸量/（mg/mL）

72.12

73.34

70.23

68.84

时间/h

37.5

37.5

40.0

41.5

菌系发酵培养基起始pH值为6.5时菌体产酸量最高,发酵周期短。

但是pH6.7~7.6最有利于大菌的生长，pH7.3~8.6有利于小菌的生长，如果在发酵过程中根据大、小菌不同的生理特征进行分段调节pH值则会取得更好的发酵收率。

3.4通风量对菌系产酸的影响

通风量对菌系产酸

分析图中空白对照和调节溶氧量后的产酸变化曲线可以看出,在发酵到12h以前使其溶氧量控制在30%以下，有利于大菌快速生长。

12h以后调高通气量使溶氧量达到30%~40%之间，使小菌大量繁殖，较大的通气量可以缩短小菌的延迟期，促进混合菌系的产酸，缩短发酵周期。

但是过大的通气量，不仅造成生产上的浪费，而且严重影响了大小菌代谢的协调性。

这说明通风量的大小不仅影响大小菌之间的数量比例、生长状态和产酸量，而且也影响大小菌的生长周期。

3.5CaCO3浓度对菌系产酸的影响

图中的曲线显示，在发酵培养基中CaCO3浓度为0.05%时菌系产酸量最高，低于或高于该浓度时菌系产酸量都稍低，这是由于过低的CaCO3浓度不利于缓冲发酵液中的酸，造成酸的反馈抑制作用，而较高的CaCO3浓度又会导致发酵液pH的变化，降低菌系的代谢活力。

4结论

目前，在Vc二步混菌发酵合成2-KLG的工业化生产过程中，发酵培养基中合适的L-山梨糖起始浓度、碳酸钙浓度、氮源、微量元素、起始pH值、通风量等可以有效地调节2-KLG的产量，优化菌系的生理状态。

促进大小菌之间的协调，使其达到最佳发酵状态。

VC是我国自主知识产权开发的首批西药之一，也是我国最主要的出口创汇原料药之一。

二步发酵法是我国VC生产的主要工艺方法，然而该法不能直接以葡萄糖为发酵原料，且涉及二步发酵三种菌，工序繁琐。

采用基因工程等先进技术，选育直接以葡萄糖为发酵原料的优良菌株和优化发酵条件将是我国VC生产技术研究的主要方向。

此外，目前世界上很多国家正尝试以真核生物为研究对象，利用它们合成VC的代谢途径开发更加环保的生物合成方法。

从我国的二步发酵法推广后逐步取代莱氏法这一过程可以预测，随着生物技术的不断发展和更具优势的生物合成VC方法的不断涌现，生物法必将完全取代化学法在VC生产中的地位，为了保持我国在世界VC生产上的优势地位，必须加强VC生产的基础研究工作。

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