SDS-PAGE--非还原性non-reduced和还原性等_精品文档.docx

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1.ＳＤＳ主要的作用有４：

去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。

所以不能断开二硫键。

　　ＤＴＴ：

还原剂，可以断开二硫键。

有些蛋白天然活性结构是二聚体或三聚体，如果加入β－巯基乙醇，它会还原多聚蛋白之间和内部的二硫键，这样，电泳的样品将会被完全还原成单体形式，不加的样品中则会保持聚体的形式，这时候样品在凝胶中的位置就会处于其2倍或3倍分子量的位置了。

2.SDS-PAGE有非还原性（non-reduced）SDS-PAGE和还原性（reduced）SDS-PAGE之分，均是变性条件下的电泳。

还原与非还原的区别是在样品处理时加或不加还原剂（如DTT或2-巯基乙醇等）。

非变性（non-denaturing）PAGE又称为天然（native）PAGE，操作的基本过程与SDS-PAGE相似，唯一不同的是在实验过程中尽可能保持蛋白质的天然完整性，包括避免使用任何还原剂、缓冲液中避免使用变性剂（如SDS）、样品的预处理以及电泳过程应在低温下进行等。

3.我现在经过多方面咨询，问了几个海龟和公司的技术顾问，已经搞明白了，就是这个抗体针对的位点含有二硫键，所以所有的western试剂中都不能含有还原剂（如DTT，巯基乙醇等，包括裂解液和上样缓冲液，有些裂解液如果是买公司的，可能公司会加入还原剂）。

因为还原剂会打开二硫键而变成巯基。

所以抗体就不识别了。

蛋白的样品处理方法有3种：

还原SDS处理，带有烷基化作用的SDS处理，非还原SDS处理。

还原SDS处理：

是常规的SDS—PAGE，在上样缓冲液中加入还原剂，DTT等，打开二硫键，SDS打开非共价键，所以使蛋白还原变性为椭圆形单体。

带有烷基化作用的SDS处理：

烷基可以永久并且牢固的保护巯基，维持单体形成，防止蛋白再次形成二硫键的空间结构。

非还原SDS处理：

样品中只加入ＳＤＳ，而不加ＤＴＴ还原剂，此时二硫键不能断裂，所以蛋白没有完全去折叠。

保持这一定的４级结构。

非还原ＳＤＳ处理因为二硫键的连接，可能会有几条多肽链连在一起，所以最后的分子量要比预期的大，可能是２倍或３倍。

　　　因为我的目的条带已经１００ＫＤ了，如果有多聚体，那么会２００－３００ＫＤ大小的蛋白，转起膜来还不累死我啊。

所以我已经换抗体了，换了个多抗，常规条件就可以做，方便多了，况且做ＷＢ的话，多抗完全可以。

哈哈，已经打电话给晶美换了。