exosomes外泌体实验方案_精品文档.docx

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外泌体分离提纯草案

By朱旭峰

一、以超高速离心的方法来分离外泌体（细胞上清）

1.1细胞培养液（CM）是来自无菌的80%-90%的培植细胞，并用浓度比1:

1.000的蛋白酶抑制剂混合。

（sigma）

1.2快速地将CM用0.22μm的过滤筛（Millipore）过滤，来分离完整地细胞和残渣。

超速离心于120,000_g（SorvallWXULTRASERIES,rotorA-641）4℃.2小时

1.3用1mL冷的PBS重悬和清洗小囊泡，再次超速离心120,000_g（SorvallWXULTRASERIES,rotorA-641）4℃.2小时

1.4再用100μL冷的PBS重悬后转移到低粘附的管中

1.5快速地使用或置于-80℃中待用为检测外泌体的蛋白浓度，取2μL的样品置于卡上，用DirectDetect™（Millipore）

1

2材料

a）细胞培养液

b）蛋白酶抑制（Sigma）

c）过滤筛（Millipore）

d）冷的PBS

e）低粘附的管

f）DirectDetect™（Millipore）

二、以超高速离心的方法来分离外泌体（人血浆）

1.1在提取外泌体之前应该向血浆里添加1;500浓度比的蛋白酶抑制剂（Sigma）

1.2将上清液移至一个新的管中离心200*g20分钟4℃

1.3小心地再将上清液移至新的管中离心10000*g30分钟于4℃来去除较大的囊泡、

1.4此阶段的样品可以

1.5将样品用0.22μm的注射器滤筛（Millipore）过滤并且离心110000g（SorvallWXULTRASERIES,rotorF65L）2小时4℃

1.6用冷的PBS重悬后再次超速离心（110,000g,1h,4℃）.，

1.7将外泌体小心干燥并且用冷的PBS重悬

1.8外泌体应该立即使用或-80摄氏度冷藏

2.材料

a）蛋白酶抑制（Sigma）

b）过滤筛（Millipore）

c）冷的PBS

d）低粘附的管

e）DirectDetect™（Millipore）

三、ExoQuickTM化学沉淀法

1.1ExoQuickTM的使用要按照厂家提供的说明书来实行

1.2该试剂盒可以简单地提取CM,人血浆，和血清里的外泌体，只需用倒相管按照所指示的量来加入ExoQuickTM试剂盒里的溶液

1.3溶液孵化过夜，在4℃温和的摇晃

1.4在流式细胞仪缓冲液中洗涤

1.5试剂盒里的带荧光的免疫磁珠已经被绑定，用流式细胞仪鉴定即可（BDBiosciences）配合使用CellQuest的软件。

2材料

a）ExoQuickTM试剂盒

b）流式细胞仪

四、用METM分离外泌体

1.1样品（CM或人血清）要按照商品说明书（NewEnglandPeptide–NEP）稀释

1.2样品要事先处理好，17,000g7分钟来去除微粒物质

1.3然后用METM试剂来孵化样品（NEPpeptide）并且用旋转震荡在室温混合15分钟

1.4孵化完的样品要室温离心10000g7分钟

1.5所有的样品要用PBS洗三次

1.6最后小囊泡要用合适的KIT缓冲液重悬

五、抗体

以下的外泌体有关的一抗和二抗是用作：

WestenBlot，ELISA和FACS（流式细胞术）

1.1mAbaCD9,mAbaCD63,mAbaCD81,mAbaCD63-FITC,aCD81-PE,来自于BecktonDickinson,

1.2mAbaCD63-biotin（BioLegend）,

1.3mAbaAlix（SantaCruz）,

1.4mAbaTsg101（Abcam）,

1.5pAbaRab5（SantaCruz）,

1.6mrAbaRab5（Epitomics）,

1.7mAbaCalnexin（Abcam）,

1.8二抗是anti-Mouse和anti-RabbitHRP-conjugated（Dako）.专门的肿瘤外泌体（HBM1andHBM2）结合抗体由HansaBioMedR&Dteam.提供

六、用WestenBlot探测外泌体的蛋白

1.1将样品用合适容积的蛋白loadingBuffer（Lonza）重悬在合适的浓度下

1.2用SDS-page分离外泌体的蛋白质

1.3把蛋白转到硝酸纤维素膜上（GEHealthcare）

1.4一二抗体孵化

1.5信号要在暗室里用ECL附加

七、外泌体免疫捕捉和蛋白定量ELISA

1.1从已经加了不同抗体的96孔板（Nunc）里的细胞上清或者人血浆为免疫捕捉而筛选外泌体结合抗体（96孔板的抗体用碳酸氢盐缓冲液PH=9.6稀释，用0.5%BSA固定和1%的蔗糖稳定）

1.2PBS加入0.05%Tween-20（PBST）作为洗涤缓冲液，但如果有提示说明，应该用PBS稀释样品

1.3将外泌体样本，CM，人血浆样本加入96板孔内（最终容积为100μl），孵化4℃过夜或者室温2小时（可以使用商业化的exosomes捕捉平板（HansaBioMed））

1.4传统上的protocol包含使用主要的抗体（aCD9或aCD63）在样品缓冲液（0.5%BSAPBS）中稀释2小时于4℃。

1.5在大量的冲洗后，用辣根过氧化物酶二抗（BioRad），在需要的地方用样品缓冲液1小时于4℃。

基于BMBluePODSubstrate辣根过氧化物酶的底物（Roche）反应的光密度反应，在450nm的酶标仪下记录Infinite_M1000（TECAN）

a）QuantaBluFluorogenicPeroxidaseSubstrate（ThermoScientific）要用连续的激发光束在325/425nm

b）SuperSignalWestFemtoChemiluminescentSubstrate（ThermoScientific）要先孵化1分钟然后在酶标仪化学发光模式读数

2.材料

a）96孔板

b）碳酸氢盐缓冲液PH=9.6

c）BSAPBSTween-20蔗糖

d）辣根过氧化物酶二抗

e）辣根过氧化物酶的底物

f）酶标仪

八、磁珠捕获外泌体

1.商业化的预包裹的乳胶微球

1.1根据商品说明书（HansaBioMed）来分离外泌体

1.2每个样品先用1ml的PBS来稀释

1.3选用合适的珠子去孵化4℃过夜，旋转震荡。

1.4之后可以用离心的方法来分离（5000个，10分钟），再用PBST洗涤3次。

2.磁珠分离法

2.1比较了“1μm大小的链霉亲和素磁珠”（ThermoScientific,88816）和“亚显微大小的超磁力珠”（内部订购）

2.2先用PBST洗涤磁珠然后加入1.2μg的抗体（外泌体结合的同种抗体，CD9抗体（BecktonDickinson））

2.3生物素化的抗体用于链霉亲和素磁珠，然后用PBST洗三次，再用合适的固定剂固定（干酪素，BSA或人血清）室温1小时

2.4重悬于PBS，然后加入样品（CM或人血浆）

2.5为了最终可以富集磁珠到近108/ml，将其孵化过夜4摄氏度旋转rotation

2.6用电磁分离磁珠，在量化外泌体蛋白或提取外泌体RNA之前用PBST洗三次

2.7磁珠也会溶解于Laemmlibuffer，所以在做为westenbolt先将其煮沸

或者可以选择做bead-basedELISA

3.免疫珠分离法

3.1用主要的抗体孵化免疫磁珠2小时于室温，用ELISA缓冲液冲洗

3.2再加入二抗（辣根过氧化物酶）孵化1小时，然后大量的冲洗之

3.3为了可以被侦测到，需加入底物BMBluePODSubstrate（Roche），孵化10分钟为了终止反应，加入硫酸，并在450nm波长下读数

4.材料

a）商品化的磁珠

b）辣根过氧化物酶二抗

c）辣根过氧化物酶的底物

d）酶标仪

e）PBST