微生物实验9.docx

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微生物实验9

微生物实验报告

微生物的生理生化实验

刘欣怡201100140057

生物科学基地班

组别：

周一下午三组

同组者：

曹平平，周楠，

刘艺，刘希伟

实验完成时间：

2012年12月3号

一、实验目的

1、证明不同微生物对各种有机大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。

2、掌握进行微生物大分子物质水解试验的原理和方法。

3、了解糖发酵的原理，掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。

4、了解吲哚和甲基红试验的原理以及其在肠道细菌鉴定中的意义和方法。

5、熟习生理生化反应培养基的配制原理和一般方法步骤。

6、巩固无菌实验操作。

二、实验器材

1、菌种：

枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、变形杆菌、铜绿假单胞菌（大分子水解实验）；

大肠杆菌、变形杆菌（糖发酵实验）；

大肠杆菌、产气杆菌（吲哚实验）；

大肠杆菌、产气杆菌（甲基红实验）；

2、培养基：

（1）固体淀粉培养基，固体油脂培养基（淀粉和油脂的大分子水解实验）；

（2）葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基试管每组各5支，而且内装有倒置的德汉氏小管（糖发酵实验）；

（3）蛋白胨水培养基（吲哚实验）

（4）葡萄糖蛋白胨水培养基（甲基红实验）

3、溶液和试剂：

卢戈氏碘液，乙醚，吲哚试剂，甲基红试剂，蒸馏水，去离子水、氢氧化钠溶液、中性红试剂、溴甲酚紫乙醇溶液等

4、仪器或其他用具：

成套培养皿，试管，玻璃棒、酒精灯，烧杯，德汉氏小管，接种环、吸管、滴管、洗耳球、无菌操作台、量筒、试管架等

三、实验原理

1、总述：

微生物的生理生化反应原理：

在所有生活细胞中存在的全部生物化学反应称之为代谢。

代谢过程主要是酶促反应过程。

许多细菌产生胞外酶，这些酶从细胞中释放出来，以催化细胞外的化学反应。

各种细菌由于具有不同的酶系统，致使它们能利用不同的底物，或虽然可以利用相同的底物，却产生不同的代谢产物，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别细菌。

微生物代谢重要特征之一，就是代谢类型的多样性，因此使得微生物在自然界的物质循环中起着重要的作用，同时也为人类开发利用微生物资源提供更多的机会与途径。

在所有生活细胞中存在的这些化学反应被称为生理生化反应（酶促反应）。

2、大分子的水解实验：

微生物对大分子物质如淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须依靠产生的胞外酶将大分子物质分解后，才能被微生物利用。

胞外酶主要为水解酶，通过加水裂解大分子物质为较小化合物，使其能被运输至细胞内。

如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精、双糖和单糖，脂肪酶水解脂肪为甘油和脂肪酸，蛋白酶水解蛋白质为氨基酸等，这些过程均可通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实。

如淀粉遇碘液会产生蓝色，但细菌水解淀粉的区域，用碘液测定时，不再产生蓝色，表明细菌产生淀粉酶。

脂肪水解后产生脂肪酸可改变培养基的pH，使pH降低，加入培养基的中性红指示剂会使培养基从淡红色转变为深红色，说明细胞外存在脂肪酶。

在淀粉固体培养基上接种细菌，培养两天以后，再往培养基中加碘液染色，若该细菌能分泌胞外淀粉酶，则能利用其周围的淀粉，淡然在染色后，其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈。

3、糖发酵实验：

糖发酵实验是常用的鉴别微生物的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要，绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源，但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异，有些细菌能分解某种糖产生有机酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢气、加完、二氧化碳等），有些细菌只产酸不产气。

例如，大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；伤寒杆菌分解葡萄糖产酸不产气，不能分解乳糖；普通变形杆菌能分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。

发酵培养基含有蛋白胨、指示剂（溴甲酚紫）、倒置的德汉氏小管和不同的糖类。

当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色（pH6.8）转变为黄色（pH5.2）。

气体的产生可由倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。

4、吲哚实验：

IMViC是吲哚（indol）、甲基红（methylredtest）、伏-普（Voges-Prokauertest）和柠檬酸盐（citratetest）四个实验的缩写，主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌，多用于水细菌学检查。

硫化氢试验也是检查肠道杆菌的生化试验。

大肠杆菌虽非致病菌，但在饮用水中超过一定数量，则表示受粪便污染，产气肠杆菌也广泛存在于自然界中，因此检查水时要将两者分开。

吲哚实验是用于检测吲哚的产生，某些细菌可产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸。

对二甲基氨基苯甲醛遇吲哚形成玫瑰吲哚（红色）。

但并非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，因此吲哚试验可以作为一个生物化学检测的指标。

色氨酸水解反应：

吲哚与对二甲基氨基苯甲醛反应：

大肠杆菌吲哚反应阳性，产气肠杆菌为阴性。

5、甲基红实验：

甲基红实验是用来检测由葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。

当细菌代谢糖产生酸时，培养基就会变酸，使加入培养基中的甲基红指示剂由橙黄色（pH6.3）转变为红色（pH4.2），即甲基红反应。

尽管所有的肠道微生物都能发酵葡萄糖产生有机酸，但这个试验在区分大肠杆菌和产气肠杆菌上仍然是有价值的。

这两个细菌在培养的早期均产生有机酸，但大肠杆菌在培养后期仍能维持酸性pH4，而产气肠杆菌则转化有机酸为非酸性末端产物，如乙醇、丙酮酸等，使pH升至大约6，因此，大肠杆菌为阳性，产气肠杆菌为阴性。

四、实验内容

利用本实验中提供的五种细菌，即枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、变形杆菌、铜绿假单胞菌以及产气杆菌，配制各自适合的培养基并进行一系列微生物的生理生化实验，即大分子淀粉和油脂的水解实验、糖酵解实验（葡萄糖和乳糖两种糖酵解）、吲哚实验以及甲基红实验，各培养基均放置在37℃恒温条件下培养2天，然后进行观察、记录和分析。

五、实验步骤

（一）培养基的合成、灭菌及准备无菌操作台

1、淀粉培养基（制备固体平板，每组2个平板）:

换算---称量---先将淀粉溶解再溶解其它成分---调pH值---装入500毫升三角瓶中---加棉塞---包扎---待灭菌。

2、油脂培养基（制备固体平板，每组2个平板）：

换算---称量---油和琼脂及水先加热---调好pH后再加入中性红---装入500毫升三角瓶中---加棉塞---包扎---待灭菌。

3、葡萄糖发酵培养基（液体培养基，每组5支试管）：

换算---称量---溶解---调pH值---加溴甲酚紫指示剂---分装小试管30支---加棉塞---包扎---待灭菌。

4、乳糖发酵培养基（液体培养基，每组5支试管）：

换算---称量---溶解---调pH值---加溴甲酚紫指示剂---分装小试管30支并加入灌满培养基的德汉氏小管---加棉塞---包扎---待灭菌。

5、蛋白胨水培养基（液体培养基，每组5支试管）:

换算---称量---溶解---调pH值---分装大试管30支---加棉塞---包扎---待灭菌。

6、葡萄糖蛋白胨水培养基（液体培养基，每组5支试管）:

换算---称量---溶解---调pH值---分装大试管30支---加棉塞---包扎---待灭菌。

7、灭菌：

将所有包扎好的含有培养基的试管和培养皿放入灭菌锅中进行灭菌。

8、准备无菌操作台：

将无菌操作台的电源打开，通入无菌风并打开紫外灯进行灭菌准备工作，紫外灯约照射20min，并且关闭两侧的玻璃门。

20min后，关闭紫外灯，打开日关灯，放入酒精灯并点燃，准备进行实验操作。

（二）倒平板、接种、培养及观察分析

A．大分子水解试验

1．淀粉水解试验

（1）固体淀粉培养基灭菌后取出，待培养基冷却至50℃左右，无菌操作制成平板，冷却凝固并倒置。

（2）用记号笔在平板底部划成四部分。

（3）无菌操作台上，在酒精灯旁无菌操作用接种环将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、变形杆菌和铜绿假单胞菌分别在平板的不同部分进行点种（如下图所示），尽量接种面积要小，而且注意在平板的反面的对应部分分别写上菌名进行标记，以防弄混。

（4）接种好后，将平板倒置，在37℃温箱中培养两天。

（5）两天后，观察平板上不同区的各种细菌的生长情况，打开平板盖子，滴入少量卢戈氏碘液于平板中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板，然后观察菌苔颜色变化。

如若菌苔周围出现无色透明圈，说明淀粉已被水解，细菌为阳性，否则细菌为阴性。

而且透明圈的大小可用来初步判断该菌水解淀粉能力的强弱，即产生胞外淀粉酶活力的高低（以“+”、“—”表示有无透明圈）。

2．油脂水解试验

（1）固体油脂培养基灭菌后取出，待培养基冷却至50℃左右，无菌操作制成平板，冷却凝固并倒置。

（2）用记号笔在在平板底部划成四部分，并且分别在四部分上标记菌种名称，以防弄混。

（3）无菌操作台上，在酒精灯旁无菌操作用接种环将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、变形杆菌和铜绿假单胞菌分别划十字线（如下图所示）接种于平板相对应部分的中心，可以让接种面积大一些，但是不要太大。

（4）将平板倒置，在37℃温箱中培养两天。

（5）两天后，取出平板，加入中性红试剂，观察菌苔颜色。

如果出现红斑点，说明脂肪水解，为阳性反应。

B．糖发酵试验（葡萄糖和乳糖两种培养基）

（1）液体培养基灭菌后取出，用记号笔在各试管外壁上分别标明发酵培养基的名称或者在试管上粘贴记号标签标明发酵培养基名称，冷却。

（2）无菌操作台上，取葡萄糖发酵培养基试管5支，分别接入大肠杆菌2支试管、变形杆菌2支试管，第5支试管不接种，作为空白对照。

另取乳糖发酵培养基5支，同样分别接入大肠杆菌2支试管、变形杆菌2支试管，第5支不接种，作为空白对照，并且及时用记号笔或者标签在试管上做好标记，区分试管中接种的菌以及是否接种菌。

（3）将接过种和作为空白对照的10支试管均置37℃中培养两天。

（4）两天后取出试管，观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡。

而且，培养后各发酵管与空白对照相比，若接种培养液保持原有颜色，其反应结果为阴性，表明该菌不能利用该种糖，记录用“－”表示；如培养液呈黄色，反应结果为阳性，表明该菌能分解该种糖产酸，记录用“＋”表示。

培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，表明该菌分解糖能产酸并产气，记录用“＋”表示；如杜氏小管内没有气泡为阴性反应，记录用“－”表示。

C．吲哚试验

（1）液体培养基灭菌后取出，冷却，无菌操作台上，将大肠杆菌、产气肠杆菌分别接入2支蛋白胨水培养基，并有一支试管什么都不接种，作为空白对照，5支试管均置于37℃恒温培养两天。

（2）在培养两天后取出试管，观察结果时，在培养液中加入乙醚约1毫升（使呈明显的乙醚层）。

充分振荡，使吲哚溶于乙醚中，静置片刻，待乙醚浮于培养液上面时，沿管壁慢慢加入吲哚试剂10滴。

如吲哚存在，则乙醚层呈玫瑰红色（注意：

加入吲哚试剂后，不可再摇动，否则红色不明显）。

以“+”、“—”表示有无红色的玫瑰吲哚。

D．甲基红试验

（1）液体培养基灭菌后取出，冷却，无菌操作台上，将大肠杆菌、产气肠杆菌分别接入2支葡萄糖蛋白胨水培养基，并有一支试管什么都不接种，作为空白对照，5支试管均置于37℃恒温培养两天。

（2）培养两天后，将每支葡萄糖蛋白胨水培养基培养物内加入2～3滴甲基红指示剂，注意沿管壁加入，仔细观察培养液上层，若培养液上层变成红色，即为阳性反应；若仍呈黄色，则为阴性反应，分别用“＋”或“－”表示。

六、实验结果

（一）大分子的水解实验

（1）淀粉水解试验:

表1.淀粉水解试验结果（“+”表示阳性，“—”表示阴性）

菌种

阴/阳性

结论

大肠杆菌

-

不可以水解淀粉

枯草芽孢杆菌

+

可以水解淀粉

变形杆菌

-

不可以水解淀粉

铜绿假单胞菌

-

不可以水解淀粉

（2）油脂水解试验:

表2.油脂水解试验结果（“+”表示阳性，“—”表示阴性）

菌种

阴/阳性

结论

大肠杆菌

-

不可以水解油脂

枯草芽孢杆菌

-

不可以水解油脂

变形杆菌

+

可以水解油脂

铜绿假单胞菌

+

可以水解油脂

（二）糖发酵实验

（1）葡萄糖发酵培养基：

表3.葡萄糖发酵试验结果（“+”表示阳性，“—”表示阴性）

样品

大肠杆菌

普通变形杆菌

空白

试管1

试管2

试管3

试管4

试管5

颜色变化

紫色

黄色

紫色

是否产气

否

是

否

阴/阳性

-

+

-

结论

实验失败

普通变形杆菌能分解葡萄糖，同时产酸产气。

对照组

正确的结果应该是：

接种大肠杆菌的两支试管都变为黄色而且产气，即大肠杆菌能分解葡萄糖，而且同时产酸产气。

（2）乳糖发酵培养基:

表4.乳糖发酵试验结果（“+”表示阳性，“—”表示阴性）

样品

大肠杆菌

变形杆菌

空白

试管1

试管2

试管3

试管4

试管5

颜色变化

紫色

紫色

紫色

是否产气

否

否

否

阴/阳性

-

-

-

结论

实验失败

普通变形杆菌不能分解乳糖，故不产酸不气。

对照组

正确的结果是：

接种大肠杆菌的两支试管都变为黄色而且产气，即大肠杆菌能分解乳糖，而且同时产酸产气。

（三）IMViC试验

（1）吲哚试验:

表5.吲哚试验结果（“+”表示阳性，“—”表示阴性）

样品

大肠杆菌

产气杆菌

试管1

试管2

试管3

试管4

是否产生红色环状物

否

否

阴/阳性

-（失败）

-

吲哚实验中，正确的结果应是接种大肠杆菌的试管在加入了相关试剂后能看到红色环状物。

（2）甲基红试验:

表6.甲基红试验结果（“+”表示阳性，“—”表示阴性）

样品

大肠杆菌

产气杆菌

试管1

试管2

试管3

试管4

颜色变化

变红

变黄

阴/阳性

+

-

结论

大肠杆菌在培养期仍维持酸性pH

产气肠杆菌转化有机酸为非酸性末端产物

大肠杆菌

产气杆菌

七、实验结果分析

1、大分子的水解实验：

微生物对大分子物质如淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须依靠产生的胞外酶将大分子物质分解后，才能被微生物吸收利用。

胞外酶主要为水解酶，通过水裂解大分子物质为较小化合物，使其能被运输到细胞内。

淀粉遇碘液会变蓝，细菌周围遇碘液不变蓝色，说明细菌周围淀粉被细菌分泌的淀粉水解酶水解，可以通过观察每种菌周围透明环的有无和大小来判断细菌有无分解淀粉的能力及能力的强弱；脂肪水解后产生的脂肪酸可以改变培养基的pH，使pH降低，培养集中的中性红指示剂会使培养基从淡红色转变为深红色，说明细胞外存在脂肪酶。

从实验结果中可以看出，枯草芽孢杆菌周围有明显的透明圈，即淀粉水解试验阳性，其余三种菌为淀粉水解试验阴性；铜绿假单胞菌和变形杆菌在加入中性红后菌苔上有红斑出现，即油脂水解试验阳性，其余两种菌为油脂水解阴性。

2、糖酵解实验：

绝大多数的细菌都能以糖类作为碳源，但是其分解糖类物质的能力有很大的差异，有些细菌在分解糖类时可以产生有机酸和气体，有些只产酸或气体，或有的不产气不产酸。

可通过这些菌种的生理特征来对其进行分类和坚定。

当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色转变为黄色，若产生气体可由德汉式小管记录。

正确的实验结果应该是大肠杆菌对葡萄糖发酵产气产酸且产气量比普通变形杆菌多，大肠杆菌对乳糖发酵也产气产酸只是产气量少于其的葡萄糖发酵；变形杆菌对葡萄糖发酵产酸产气，但对乳糖发酵不产气也不产酸。

但是本实验的结果只能说明变形杆菌对葡萄糖发酵而且产酸产气，而接种了大肠杆菌的试管通过和空白试管进行对比发现没有变化，既没产酸也没产气，而且整个实验室所有小组的有关大肠杆菌的糖酵解试管都没成功，所以经分析失败的原因应该是大肠杆菌这个菌种有问题。

3、吲哚实验：

吲哚试验是用来检测吲哚的产生，有些细菌产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸，产生吲哚和丙酮酸。

吲哚对二甲苯氨基酸甲醛结合，形成红色的玫瑰吲哚。

但并非所有微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，因此吲哚可以作为一个生化检测的指标。

本次实验中，未能在加入相关试剂后观察到红色环状物质。

正确的实验结果应该是接种了大肠杆菌的试管在加入乙醚和吲哚试剂后，能在乙醚和液体培养基的交界面上产生红色环状物质，大肠的吲哚试验显阳性，即大肠杆菌可以分解色氨酸为吲哚。

吲哚试验失败分析：

一个可能的原因是乙醚加量太少，影响实验现象的观察；另一个可能的原因是大肠杆菌菌种有问题，因为整个实验室的所有小组都没有成功，并且之前有关大肠杆菌的其他实验也没能获得成功。

4、甲基红实验：

甲基红试剂是用来检测由葡萄糖产生的有机酸。

当细菌代谢产酸时，培养基变酸，加入培养集中的甲基红指示剂由橙黄色（6.3）转变为红色（4.2），即甲基红反应。

本次实验结果显示，大肠杆菌甲基红试验阳性，即大肠杆菌在培养期仍维持酸性pH。

尽管所有肠道微生物都能产酸，且大肠杆菌和产气杆菌在早期均能产生有机酸，但是大肠杆菌在培养后仍能维持酸性4，而产气杆菌则转化为，非酸性末端产物。

因此，大肠杆菌为阳性，产气肠杆菌为阴性。

八、实验注意事项

1、淀粉水解实验中，观察各种细菌生长情况时，滴入少量卢戈氏碘液于平板中，应轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板。

2、淀粉水解实验中，菌种点种在平板上，尽量接种面积小。

3、油脂水解实验中，制备固体油脂培养基时，应充分摇荡，使油脂均匀分布。

4、油脂水解实验中，在平板上划十字接种大肠杆菌和变形杆菌，十字可以接种面积大些，但是不要太大。

5、实验中，注意每个小实验中要接种的菌是什么，不要漏掉或弄错。

6、接种前要用记号笔做好标记，接种时要对号接种。

7、糖发酵实验中，接种后要轻缓摇动试管，使其均匀，防止倒置的小管进入气泡。

否则会造成假象，得出错误的结果。

8、糖酵解实验中，要先将小管装满后在导致放入盛有培养基的试管中。

9、糖酵解实验中，试管中液体培养基要没过倒置的小管的底部。

10、糖酵解实验中，注意不要弄混葡萄糖发酵培养基和乳酸发酵培养基。

11、液体培养基接种时，将沾有菌的接种环插入液体培养基中轻轻振荡让菌体从接种环上脱落下来。

12、吲哚实验中，注意加入3~4滴乙醚，摇动数次，静置1min，待乙醚上升后，再沿试管壁徐徐加入2滴吲哚试剂。

否则就会观察不到在乙醚和培养物之间产生的红色环状物。

13、注意：

加入吲哚试剂后，不可再摇动，否则红色不明显.

14甲基红实验中，应该注意甲基红试剂不要加得太多，以免出现假阳性。

15、油脂培养基配制中要注意不能使用变质油；油和琼脂及水先加热；调好pH后再加入中性红；分装时，需不断搅拌，使油均匀分布于培养基中。

16、本实验中，配制糖酵解培养基时，直接将葡萄糖或者乳糖加入培养基中，不用配成溶液和培养基分开灭菌。

注意要加的糖量的计算！

17、注意，糖酵解培养基中的一种成分是溴甲酚紫乙醇溶液，而不是溴甲酚紫水溶液，否则影响培养基。

18、实验结束后，整理实验仪器，小管洗净回收在一起。

九、实验思考题

1．你如何解释淀粉酶是胞外酶而非胞内酶？

答：

（1）淀粉是大分子物质，进入细胞十分困难，甚至需要触及高耗能的胞吞作用。

因而通过胞外酶的作用，将淀粉水解为葡萄糖后运入细胞，较方便高效。

（2）试验中出现透明圈，说明培养基内淀粉被水解，可推测是细菌产生的胞外的淀粉酶起的作用。

2、配置各种生理生化培养基时,分别应当注意什么事项?

答：

（1）配制糖蛋白胨水培养基时，所用的蛋白胨最好含色氨酸较高，如用胰蛋白酶水解酪素得到的蛋白胨中色氨酸含量较高。

（2）葡萄糖蛋白胨水培养基中含有葡萄糖，因葡萄糖高温易分解，为了减少葡萄糖的损失要115℃灭菌20分钟。

（3）硫化氢实验培养基需加硫代硫酸钠，其易分解，所以115℃灭菌。

另外将蛋白胨琼脂溶解后，稍冷却再加入其成分。

（4）硝酸盐还原实验培养基使为了检测某些细菌能将硝酸盐还原为亚硝酸盐，所以KNO3要分离纯化，不能含杂质。

（5）柠檬酸盐培养基注意先调pH值再加入溴麝香草酚蓝指示剂，并注意加指示剂后培养基的颜色，以浅绿色为宜。

（6）富氏明胶培养基配制时将液体煮沸后先加入明胶，搅拌待其溶解后再加入其他成分。

（7）制淀粉培养基时先将淀粉溶解再溶解其它成分。

3、配培养基时，为什么要先调好pH值在加指示剂？

答：

大部分指示剂时有机复合物显示一定的酸碱性，若先加指示剂再调节指示剂酸碱性会影响培养基的pH。

4、不利用碘液，你能否证明淀粉水解的存在?

答：

由于淀粉水解生成葡萄糖，即多羟基醛，因此可利用醛的性质进行检验，如银镜试验，费林试验等。

5、假如某些微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵试验应该出现什么结果？

答：

微生物有氧代谢葡萄糖产气不产酸，因此发酵结果是小管中生气泡但是溶液不变黄

6、讨论IMViC试验在医学检验上的意义。

答：

可以鉴别某些疾病是由大肠杆菌还是产气肠杆菌引起的。

7、解释在细菌培养中吲哚检测的化学原理，为什么在这个试验中用吲哚的存在作为色氨酸酶活性的指示剂，而不用丙酮酸？

答：

化学原理：

有些细菌产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸，产生吲哚和丙酮酸。

吲哚与对二甲基氨基甲醛结合，形成红色的玫瑰吲哚。

但并非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，因此吲哚试验可以作为一个生物化学检测的指标。

因为丙酮酸是生物体呼吸作用的产物，无论是有氧还是无氧，都会产生丙酮酸，因而无法作为色氨酸酶活性的指示剂进行区分。

同时吲哚能通过有明显颜色变化的化学反应观测到，而丙酮酸不能，所以试验中用吲哚的存在作为色氨酸酶活性的指示剂，而不用丙酮酸

8、为什么大肠杆菌是甲基红反应阳性，而产气杆菌为阴性？

答：

当细菌代谢糖产生酸时，培养基就会变酸，使加入培养基中的甲基红指示剂由橙黄色（PH6.3）转变为红色（PH4.2），即甲基红反应。

而大肠杆菌和产气肠杆菌在培养的早期均产生有机酸，但大肠杆菌在培养的后期仍能维持酸性PH4，而产气肠杆菌则转化有机酸为非酸性末端产物，如乙醇、丙酮酸等，使PH升至大约6。

因此，大肠杆菌为阳性，产气肠杆菌为阴性。

十、实验小结

本次实验中，我学会了很多有关微生物生理生化的知识以及鉴定方法，而且锻炼了很多技术，我相信本次实验对以后的实验会有很大的帮助。

在进行实验时要认真按照步骤进行操作，如大分子水解试验中，滴加少量卢戈式碘液后要轻轻旋转平板使碘液均匀分布；在制作固体油脂培养基时，要注意充分摇晃并且按照顺序进行配制；在糖发酵试验接种中应轻轻摇动试管使其均匀防止倒置的小管进入气泡；吲哚试验中要注意等加入乙醚后并待其上升后再沿壁徐徐加入吲哚试剂；在甲基红试验中注意甲基红试剂不能添加太多。

否则将会对实验产生很大影响。

另外，在进行大分子水解试验时还要注意培养基不同区域的划分和标记，以免相混。

蛋白胨水培养基，所用蛋白胨最好用含色氨酸高的，这样现象会比较明显。

下面进行一些实验分析。

淀粉酶是胞外酶，因为微生物对大分子营养物质无法吸收到胞内进行利用，如果是胞内酶，则首先应该先将淀粉吸收到胞内，而微生物却不具有那种能力，因此必须先释放出胞外淀粉酶将淀粉水解为微生物可以吸收的大小，才能使微生物成长。

如果不使用碘液，则可以延长培养的时间来进行观察，时间长了以后，菌落依然扩展的应该就为能释放淀粉胞外酶的菌种了。

如果某些微生物为有氧代谢葡萄糖，则进行试验时，依然可以观察到气泡，但却应该观察不到颜色的变化了，因为颜色的改变源于酸性的增强。

IVMiC试验主要功能为检查饮用水中的大肠杆菌和产气肠杆菌的有无及数量的多少，对饮用水达标很有作用。

同时，在治疗时，可以使用这个试验对病人的肠道提取物进行试验，以此来分析肠道微生物成分进而分析病因。

色氨酸分解后产生的吲哚，与对二甲基氨基苯甲酸反应后能产生显红色的玫瑰吲哚，易