张静中学高考生物专项第十单元.docx
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张静中学高考生物专项第十单元
张静中学高考生物专项第十单元
1．涵盖范围
本单元包括选修1全部内容——微生物技术；酶技术；食品加工技术；植物组织培养；蛋白质的提取和分离；PCR技术。
2．考情分析
考查力度：
本单元考查分值相对固定。
考查内容及形式：
（1）微生物的培养与应用多以简答题形式考查；
（2）酶的研究与应用，常与必修1中酶的本质、特性等知识有机结合考查；
（3）植物组织培养常与植物有效成分提取相结合考查；
（4）传统发酵技术及实践应用多以简答题形式考查；
（5）酶的研究、DNA和蛋白质提取技术多以选择题形式考查。
3．复习指导
（1）复习线索
①以转基因——微生物培养——酶生产——酶应用为线索，系统复习微生物培养技术、酶的研究和实践应用。
②以技术手段、技术流程为主线，复习发酵、组织培养、有效成分及DNA、蛋白质提取有关知识。
（2）复习方法
①列表比较法——DNA、蛋白质的提取与分离。
②实践联系——发酵技术、植物有效成分提取技术。
③实验联系——植物组织培养、微生物培养实验过程。
第42讲 微生物技术
[考纲要求] 1.微生物的分离和培养。
2.某种微生物数量的测定。
3.培养基对微生物的选择作用。
考点一 培养基对微生物的选择作用
1．培养基判断
（1）据物理状态的不同，培养基只有液体培养基和固体培养基两种类型（ × ）
（2）培养基中一般都含有水、碳源、氮源和无机盐四种成分（ √ ）
（3）在配制培养基时，除满足营养需求外，还应考虑pH、O2及特殊营养物质的需求
（ √ ）
2．无菌技术的相关连线（连一连）
3．制备固体培养基的流程
→
→
→
→
→
→
→
4．菌落中的微生物是同一类型的，可以看做一个种群，菌落的特征是进行菌种鉴定的重要依据之一。
5．常见的选择培养基
（1）加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。
（2）加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。
（3）无氮源培养基可以分离固氮微生物。
（4）以石油是唯一碳源的培养基，可以分离能消除石油污染的微生物。
（5）将培养基放在高温环境中培养，分离耐高温的微生物。
易错警示
（1）自养微生物与异养微生物所需的营养物质不同
①自养微生物所需的碳源、氮源来自含碳、含氮的无机物，而异养微生物需要的碳源、氮源来自含碳、含氮的有机物，因此可根据培养基中营养物质判断微生物的代谢类型。
②含氮无机物不但能给自养微生物提供氮源，也能作为能源物质，提供能量，如NH3既作为硝化细菌的氮源也作为能源。
（2）配制牛肉膏蛋白胨固体培养基的注意事项
①倒平板的适宜温度是50℃左右，温度过高会烫手，过低培养基又会凝固。
②平板需倒置，这样既可使培养基表面的水分更好地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
1．分析下面培养基的配方：
KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、尿素、琼脂。
请完成下列问题：
（1）在该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是______和______。
（2）想一想这种培养基对微生物是否具有选择作用？
如果具有，又是如何进行选择的？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案
（1）葡萄糖 尿素
（2）有选择作用。
因为此配方中尿素是唯一氮源，因此，只有能够利用尿素的微生物才能够生长
解析 碳源是提供碳元素的物质，氮源是提供氮元素的物质。
所以碳源是葡萄糖，氮源是尿素。
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，所以这种培养基对微生物有选择作用。
选择的原则是只有能够利用尿素的微生物才能够生长。
选择培养基筛选微生物的原理：
人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。
1．微生物和动植物营养要素的比较
项目
碳源
氮源
能源
无机盐、水
动物
糖类、
脂肪等
蛋白质或其降解物
同碳源
都需要，种类及功能基本相同
微生物
异养型
糖类、脂肪、醇、
有机酸等
蛋白质或其降解物、
铵盐、硝酸盐、N2等
同碳源
自养型
CO2、碳
酸盐等
NH3、铵盐、硝酸盐等
氧化无机物或利用光能
绿色植物
铵盐、硝酸盐
光能
2．培养基的营养构成
（1）各种培养基的具体配方不同，但一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。
（2）不同培养基要满足不同微生物对pH、特殊营养物质及氧气的需求。
3．消毒和灭菌比较
比较项目
理化因素的作用强度
消灭微生物的数量
芽孢和孢子能否被消灭
消毒
较为温和
部分生活状态的微生物
不能
灭菌
强烈
全部微生物
能
考点二 微生物的纯培养
1．实验原理
微生物的分离与纯化就是将待检测微生物样品通过划线或涂布接种在固体培养基上，样品中的每一个细胞或孢子都可以生长繁殖形成单个菌落。
将单个菌落接种到斜面培养基上，经培养后，即可得到一个微生物的纯种。
2．操作方法
（1）平板划线分离法：
细菌的分离和稀释过程发生在接种环在固体平板表面上的移动划线过程中。
在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成纯种的单个菌落。
（如下图）
（2）涂布分离法
①系列稀释操作（如下图1）
a．将分别盛有9_mL水的6支试管灭菌，并按101～106的顺序编号。
b．用移液管吸取1_mL培养的菌液，注入101倍稀释的试管中。
用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸3次，使菌液与水充分混匀。
c．从101倍稀释的试管中吸取1mL稀释液，注入102倍稀释的试管中，重复b步混匀操作。
以此类推，直到完成最后1支试管的稀释。
②涂布平板操作如图2所示：
易错警示
（1）平板划线时，第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环，在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环。
在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线，以免接种环温度太高，杀死菌种。
（2）涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。
应从操作的各个细节保证“无菌”。
例如，对涂布器等接种器具进行消毒和灭菌、酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围；等等。
2．下列无菌操作中，错误的是（ ）
A．无菌操作的目的是防止杂菌污染
B．用酒精擦拭双手的方法对操作者进行消毒
C．实验操作过程应在酒精灯火焰附近进行
D．玻璃器皿（吸管、培养皿）可用酒精擦拭
答案 D
解析 对操作者应用较温和的方法进行消毒。
实验操作过程应在酒精灯火焰附近进行，防止瓶口的微生物污染培养基。
对无菌操作用到的玻璃器皿要用干热灭菌的方法彻底消灭其中的微生物，用酒精擦拭不能达到目的。
3．下列是用于从土壤中分离纯化土壤细菌的培养基配方。
请回答：
试剂
牛肉膏
蛋白胨
NaCl
琼脂
水
用量
5g
10g
5g
20g
1000mL
（1）培养基的类型有很多，但培养基中一般都含有水、碳源、____________和无机盐。
上述培养基配方中能充当碳源的成分是__________________________。
培养基配制完成以后，一般还要调节pH，并对培养基进行__________处理。
该培养基从物理性质上分类属于____________。
（2）分离纯化微生物最常使用的接种方法是____________和____________________。
（3）假设培养结束后，发现培养基上菌落连成一片，可能的原因是什么？
（列举两项）
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案
（1）氮源 牛肉膏和蛋白胨 灭菌 固体培养基
（2）平板划线法 稀释涂布平板法 （3）稀释倍数不够，菌液的浓度太高；划线时，划完第一次没有灭菌即接着划第二次；培养过程中灭菌不严格，受到了其他微生物的污染（任选两个）
解析 培养基中都应含有水、无机盐、碳源和氮源。
配制培养基时加入了琼脂，因此该培养基属于固体培养基。
培养基配制完成后要调pH和灭菌。
牛肉膏、蛋白胨中含碳元素，可作为有机碳源。
分离纯化微生物一般用平板划线法和稀释涂布平板法。
平板划线法中每次划线前都要将接种环灼烧灭菌，以杀死上次划线时接种环上残留的菌种；采用稀释涂布平板法时稀释度要足够高，否则会使微生物不能分散成单个细胞。
平板划线分离法和涂布平板法的比较
平板划线分离法
涂布分离法
特点
操作简单，但是单菌落不易分离
操作复杂，但是单菌落易分离
原理
连续划线。
由于划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落
将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养皿表面形成单个菌落
相同点
用平板划线法和稀释涂布平板法接种的目的是：
使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落，以便于纯化菌种
考点三 分解尿素的细菌的分离与计数
1．完善土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
（1）分离原理：
土壤中细菌之所以能分解尿素，是由于它们体内能合成脲酶，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起到催化作用。
（2）统计菌落数目：
统计样品中的活菌一般用平板菌落计数法。
（3）实验流程：
土壤取样→样品的稀释→微生物的培养与观察→细菌的计数。
2．判断正误
（1）只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素（ √ ）
（2）筛选分解尿素的细菌应以尿素作为培养基中的唯一氮源（ √ ）
（3）统计样品中的活菌一般用平板划线法（ × ）
（4）在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变蓝，则说明筛选到分解尿素的细菌（ × ）
易错警示
（1）在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。
如果某个平板的菌落数与其他差别甚远，说明该平板操作过程中出现失误，应舍弃。
（2）统计的菌落往往比活菌的实际数目低。
这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。
4．自然界中的微生物往往是混杂生长的。
人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。
下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题。
实验步骤：
（1）制备稀释倍数为102、103、104、105、106的系列稀释液。
（2）为了得到更加准确的结果，你选用____________法接种样品。
（3）适宜温度下培养。
结果分析：
（1）测定大肠杆菌数时，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确可信的是____________，其理由是_________________________________________
________________________________________________________________________。
A．一个平板，统计的菌落数是230
B．两个平板，统计的菌落数是220和260，取平均值240
C．三个平板，统计的菌落数分别是210、50和520，取平均值260
D．四个平板，统计的菌落数分别是210、300、240和250，取平均值250
（2）一同学在稀释倍数为105的培养基中测得平板上菌落数的平均值为234，那么每毫升样品中的菌落数是__________（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL）。
（3）用这种方法测定的大肠杆菌密度，实际活菌数量要比测得的数量____________，因为________________________________________________________________________
______________________。
答案 实验步骤：
（2）稀释涂布平板
结果分析：
（1）D 在设计实验时，一定要涂布至少三个平板作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性；在分析实验结果时，要考虑所设置的重复组的结果是否合理
（2）2.34×108 （3）多 当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
解析 实验步骤：
为了得到更加准确的结果，应用稀释涂布平板法接种样品。
结果分析：
（1）选取多个菌落数相差不大的平板计数，取其平均值。
（2）234÷0.1×105＝2.34×108。
（3）因为菌落可能由两个或多个细菌连在一起生长而成，所以实际活菌数量要比测得的数量多。
1．筛选菌株的原理
微生物的选择培养：
在选择培养基的配方中，把尿素作为培
养基中的唯一氮源，原则上只有能够利用尿素的微生物才能够生长。
2．统计菌落数目的方法
（1）显微镜直接计数法
①原理：
利用特定细菌计数板或血球计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量。
②方法：
用计数板计算。
③缺点：
不能区分死菌与活菌。
（2）间接计数法（活菌计数法）
①原理：
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
②操作：
a.设置重复组，增强实验的说服力与准确性。
b．为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
③计算公式：
每克样品中的菌株数＝（C÷V）×M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL），M代表稀释倍数。
3．鉴定分解尿素的细菌
（1）原理：
CO（NH2）2＋H2O
CO2＋2NH3；由于NH3的产生，培养基碱性增强，pH升高，因此可通过检测pH的变化来判断该化学反应是否发生。
（2）方法：
以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌，若指示剂变红，则pH升高，说明该种细菌能分解尿素。
4．对照原则的运用
（1）判断培养基中是否有杂菌污染，需将未接种的培养基同时进行培养。
（2）判断选择培养基是否具有筛选作用，需设立牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培养基上菌落数目，进行对比得出结论。
考点四 分解纤维素的微生物的分离
1．分离原理
（1）土壤中存在大量纤维素分解菌，包括真菌、细菌和放线菌等，它们可以产生纤维素酶，分解和利用纤维素和半纤维素。
（2）在用纤维素作为唯一碳源的选择培养基中，纤维素分解菌能很好地生长，并产生黄色或棕绿色色素，其他微生物则不能生长。
2．分离方法包括纸条法和固体培养法。
易错警示 对选择培养基的选择方法区分不清
（1）在培养基中加入某种化学物质。
例如，加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食盐可以得到金黄色葡萄球菌。
这里的加入是在主要营养成分完整的基础上加入。
（2）改变培养基中的营养成分。
例如缺乏氮源时可以分离出固氮微生物；石油作为唯一碳源时，可以分离出能消除石油污染的微生物。
（3）改变微生物的培养条件。
例如，将培养基放在高温环境下培养，可以得到耐高温的微生物。
5．关于纤维素分解菌选择培养的正确叙述是（ ）
A．可以增加纤维素分解菌的浓度
B．可以减少纤维素分解菌的浓度
C．所用培养基是固体培养基
D．所用培养基是平板培养基
答案 A
解析 选择培养可增加纤维素分解菌的浓度，所用的培养基是液体培养基，以便于下一步的稀释涂布操作。
6．在加入依姆歇涅茨液体培养基的滤纸条上出现黄色或棕绿色的是（ ）
A．分解尿素的细菌B．硝化细菌
C．分解纤维素的细菌D．乳酸菌
答案 C
解析 分解纤维素的细菌能将纤维素分解，并会出现黄色或棕绿色的斑点。
1．两种菌株筛选原理的比较
土壤中分解尿素的细菌
分解纤维素的微生物
①选择培养基的成分：
尿素作为唯一的氮源
②鉴定方法一：
在用纤维素作为唯一碳源的培养基中，纤维素分解菌能很好地生长，并产生黄色或棕绿色色素，其他微生物则不能生长。
法二：
在培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变红，pH升高，说明细菌能分解尿素
①选择培养基的成分：
纤维素作为唯一的碳源
②鉴定方法：
刚果红染色法，即刚果红与纤维素形成红色复合物，当纤维素被分解后，培养基出现以纤维素分解菌为中心的透明圈
2.选择培养基与鉴别培养基的比较
种类
制备方法
原理
用途
举例
选择培养基
培养基中加入某些化学物质
依据某些微生物对某些物质或环境条件的嗜好、抗性而设计
从众多微生物中分离所需的微生物
加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌
鉴别培
养基
培养基中加入某种指示剂或化学药品
依据微生物产生的某种代谢产物与培养基中的特定试剂或化学药品反应，产生明显的特征变化而设计
鉴别不同种类的微生物
伊红美蓝培养基可以鉴别大肠杆菌
3.分离纤维素分解菌的几个关键步骤
（1）分离纤维素分解菌的实验中先用选择培养基，再用鉴别培养基。
选择培养基为液体培养基，以纤维素作为碳源和能源的微生物可以正常生长，而其他绝大多数微生物不能正常生长；因培养基中无凝固剂，为液体培养基，利用液体培养基能使营养成分充分消耗，以增加纤维素分解菌的浓度。
（2）鉴别培养基含琼脂，为固体培养基，因为要在培养基上形成我们肉眼可见的菌落。
1．（2012·北京卷，5）高中生物学实验中，在接种时不进行严格无菌操作对实验结果影响最大的一项是（ ）
A．将少许干酵母加入到新鲜的葡萄汁中
B．将毛霉菌液接种在切成小块的鲜豆腐上
C．将转基因植物叶片接种到无菌培养基上
D．将土壤浸出液涂布在无菌的选择培养基上
答案 C
解析 在酿制葡萄酒的过程中，如果灭菌不彻底会影响葡萄酒的品质，但影响不大；在制作腐乳的过程中，发酵过程有多种微生物的参与，所以该过程不进行严格的无菌操作对结果影响不大；在植物组织培养过程中，如果灭菌不彻底，杂菌产生的物质会影响外植体的生长，甚至杀死外植体，导致培养失败，对结果影响最大；土壤浸出液本身就含有大量的杂菌，另外在选择培养基上只能生存我们所要筛选的细菌，所以无菌操作不严格，对结果影响也不会太大。
2．（2009·安徽卷，6）下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，其中错误的是
（ ）
A．用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板
B．取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1mL，分别涂布于各组平板上
C．将实验组和对照组平板倒置，37℃恒温培养24～48小时
D．确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数
答案 D
解析 采用平板菌落计数法统计菌落数目时，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
3．（2011·新课标全国卷，39）有些细菌可分解原油，从而消除由原油泄漏造成的土壤污染。
某同学欲从受原油污染的土壤中筛选出能高效降解原油的菌株。
回答问题：
（1）在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以________为唯一碳源的固体培养基上。
从功能上讲，该培养基属于________培养基。
（2）纯化菌种时，为了得到单菌落，常采用的接种方法有两种，即____________和____________。
（3）为了筛选出高效菌株，可比较单菌落周围分解圈的大小，分解圈大说明该菌株的降解能力________。
（4）通常情况下，在微生物培养过程中，实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌、________
和____________。
无菌技术要求实验操作应在酒精灯________附近进行，以避免周围环境中微生物的污染。
答案
（1）原油 选择
（2）平板划线法 稀释涂布平板法（3）强 （4）干热灭菌 高压蒸汽灭菌 火焰
解析
（1）可以将所需要的微生物从混杂的微生物群中分离出来的培养基为选择培养基。
欲筛选出能降解原油的菌株，则培养基中应只含有原油而无其他碳源，这样不能降解原油的细菌在此培养基上不能生存，能降解原油的细菌才能在只含原油这一碳源的培养基上生存。
（2）分离纯化菌种时，接种的方法有平板划线法和稀释涂布平板法，其目的都是使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单菌落，以便于纯化菌种。
（3）降解原油能力越强的菌株，在菌落周围形成的分解圈越大。
（4）实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌（如接种环）、干热灭菌（如培养皿）和高压蒸汽灭菌（如培养基）等。
无菌技术要求整个实验操作都要在酒精灯火焰附近进行，以避免周围微生物的污染。
4．（2009·宁夏卷，40）
（1）在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑_______、_________和渗透压等条件。
由于该细菌具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、____________、________________等优点，因此常作为遗传学研究的实验材料。
（2）在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养器皿进行________（消毒、灭菌）；操作者的双手需要进行清洗和________；静止空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性，还能________________________。
（3）若用平板菌落计数法计数大肠杆菌活菌的个数，要想使所得估计值更接近实际值，除应严格操作、多次重复外，还应保证待测样品稀释的______________。
（4）通常，对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌落特征对细菌进行初步的________________。
（5）培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。
对于固体培养基应采用的检测方法是________________________________________________________。
（6）若用大肠杆菌进行实验，使用过的培养基及其培养物必须经过________处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。
答案
（1）温度 pH 易培养 生活周期短
（2）灭菌 消毒 损伤DNA的结构 （3）比例合适 （4）鉴别（或分类） （5）将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生 （6）灭菌
解析
（1）影响微生物培养的因素除了营养条件外，外界条件主要包括温度、pH和渗透压等。
由于大肠杆菌具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、易培养、生活周期短等优点，所以常作为遗传学研究的实验材料。
（2）对培养基和培养器皿要进行灭菌，对操作者的双手需要进行清洗和用酒精消毒，静止空气中的细菌在用紫外线照射后能够使蛋白质变性，并损伤DNA结构，使细菌死亡。
（3）样品的稀释度直接影响平板上生长的菌落的数目，实际操作中，通常选用
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