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实验一药理实验基础知识
第一章实验一药理实验基础知识
第一节药理学实验的目的和要求
药理学实验的目的在于通过循序渐进的常规实验，使学生验证和巩固所学的差不多理论；通过综合实验了解较为先进的科研方法和技能，同时培养学生联想及综合分析问题的能力；通过设计性实验，培养学生独立摸索、科学思维及创新的能力，建立实事求是、严谨的科学态度，提高解决实际问题的能力，为后续知识的学习和毕业后的科研工作奠定良好的基础。
为了达到上述目的，要求学生做到以下几点。
【实验前】
1.认真阅读实验指导，了解实验目的、原理、要求、方法和操作步骤。
2.结合实验内容，复习有关药理学、生理学、生物化学及免疫学等方面的理论知识，做到充分明白得。
3.推测实验中可能显现的情形和发生的问题。
【实验时】
1．实验器材的放置力求稳当、整齐、有条不紊。
2．严格按照实验指导上的步骤进行操作，准确运算给药量，节约器材和药品。
要注意爱护实验动物和标本，幸免与实验内容无关的刺激。
3．认真、耐心地观看实验过程中显现的各种现象，实事求是地记录药物显现反应的时刻、表现以及最后的转归，联系课堂讲授的内容进行摸索。
4．在实验过程中遇到疑难之处，先要自己设法解决，如一时解决不了，应向指导教师说明情形，要求教师协助解决。
关于贵重仪器，在未熟悉其性能之前，不可轻易调试。
5．实验室内保持安静、整洁。
用药后须用原瓶塞塞好，公用药品和器材不可随意移动。
【实验后】
1．将实验用器材清洗擦干，清点整理后放到指定位置。
如有损坏、缺少，应及时报告老师。
将存活和死亡动物分别送至指定处所。
2．认真整理实验记录，通过分析摸索，撰写实验报告，按时交给指导老师。
3．做好实验室的清洁卫生工作。
第二节药理学实验设计的差不多原则
在进行药理学实验时，为保证实验结果的客观性和可信性必须遵循以下差不多原则：
一．对比原则：
进行实验时必须设对比组。
设置对比组是为了使观看指标通过对比而发觉其在处理因素（如药物等）的作用下而表现出的某种特异性变化，排除各种无关因素的阻碍。
这就要求在比较的各组实验对象之间除了处理因素不同外，所有非处理因素应尽量保持相同，从而依照处理与不处理之间的差异，了解处理因素带来的专门效应。
对比有多种形式，如空白对比（又称正常对比），即对比组不施加处理因素，但给予同容积的溶剂；模型对比，即造成疾病模型，但不给予药物处理，给予同容积的溶剂；阳性对比，即给予相同适应症的市售药物，以监控实验条件；假手术对比，即除造成某种疾病模型的关键步骤外，所有手术操作均同模型对比组。
自身对比，对比与实验均在同一实验对象进行，即同一个体处理前后的对比，如给药前后的对比等。
若观看给药前后的指标变化，此种对比必须以指标本身对时刻变化相对稳固为首要前提。
二．随机原则：
随机是指对实验对象的实验顺序和分组进行随机处理。
在分组时，对实验对象进行随机抽取可保证被研究的样本能代表总体，从而减少抽样误差；在施加多个处理因素时采纳随机原则，可保证各组样本的条件差不多一致，可减少组间人为的误差。
三．重复原则：
“重复”在那个地点有两方面的含义，一是指实验结果的可再现性，一是指实验结果应该来自足够大的样本。
样本越大，重复的次数越多，实验结果的误差越小，可信度越高。
第三节药理学实验中分组方法
药理学实验一样应当设有正常对比组、模型对比组、阳性药对比组及受试药2个以上剂量组（新药研发时要求至少设立三个给药剂量组，以考察量效关系）等，如需手术造成疾病模型，还应设假手术对比组。
而学生药理学实验课时，由于时刻等条件的限制，可酌情减少实验分组，只设空白对比组或模型对比组及受试药一个剂量组。
一．动物分组的一样原则
实验时，要遵循受试药组与对比组一致性原则，即两组只承诺在被实验因素方面有所不同，在其他方面（包括实验对象、实验者、实验条件、环境、时刻以及仪器等）应力求一致。
除了被实验因素外，假如两组还有不一致的地点，则对比组的存在失去其应有意义。
两组之例数应相等或相近似，认为对比组只有少数几例即可，是不正确的。
分组时，为了满足以上要求，幸免主观因素需要采取随机抽样的方法。
所谓随机抽样确实是指按着机会的安排来抽取样本，换言之，不论任何被实验的对象都有相等的机会被抽出。
随机抽样的方法专门多，如应用骰子法、单双号法、卡片法以及随机数表等。
必须指出，随机抽样比较适宜大样本时的分组，而小样本时随机抽样不能保证各组的一致性，故小样本时必须用人为的方法来保证各组的一致性，其目的是更好地贯彻随机抽样原则，与主观选择有本质上的区别。
二．小样本的分组法
要紧有分群法（Stratify）和配对（群）法。
分群法是按某几个因素将对象先分为数群，而后再按随机抽样法将每群中的对象分到各组中去。
有时先分为几个大群，而后每大群再分为数小群，最后将每小群中的对象再随机抽样地分到各组中去。
分群可按性别、体重或血压等生理或病理因素进行，一样应以观测指标或对观测指标有要紧阻碍的因素为准来分群，如降压实验，应以血压为准来分群；豚鼠的平喘实验，须对豚鼠进行初筛，分组时，应以哮喘埋伏期来分群；降血脂实验，应以血脂水平为准来分群。
而多数是按性别、体重分群。
配对（群）法，是把各方面相近似的对象配成多数的对或群（二组则二个一对，三组则三个一群），然后每对（群）中的对象按随机抽样原则分到各组中去。
以最常用的分群法为例，说明如下：
【举例】
由实验动物中心取来同种属同时出生日期相近似的小白鼠36只，欲就性别及体重将其分为实验及对比两组，可进行如下分组：
先就性别将动物分为雌雄两大群，每群再按体重分为数小群（以1g为组距），假定其性别及体重分布情形如表1-1之左侧所表示，则可按随机抽样原则将各小群的动物分到两组中去。
假如有的小群动物数是奇数时，则应尽力照管到两组的均衡来分配之，最终的分组情形正如表1-1之右侧所表示。
表1-1分组法
分布情况
分组情况
性别体重（g）动物数（只）
实验组对比组
雌18-196
19-206
20-213
21-223
33
33
21
12
Σ18
99
雄18-195
19-203
20-216
21-224
32
12
33
22
Σ18
99
第四节药理学实验数据的分析处理
一、实验结果的记录及表示方法
实验过程中，要对实验数据进行及时、客观的记录。
凡是属于量反应资料（又称计量资料，即药物作用能够用数值的变化来表示，如血压的高低、时刻的长短、心率的快慢、肿瘤轻重、心输出量的多少等）均应以正确的单位和数值标定。
凡是由曲线记录测量指标的实验，应尽量用曲线记录实验结果，在所记录的曲线中应标注有给药或刺激记号、时刻记号等。
为便于对实验结果进行分析、比较，多以各组数据的均值加减标准差来制表或绘图来表示实验结果，表格要有表题，图要有图题。
制作表格及作图时，应注意以下几点：
1.表格应制三线表，表格中不用纵向线。
一样按照组别、剂量、动物数、观测指标的顺序在表内由左至右填写。
2.作图时，通常是以实验观看指标的变化为纵坐标，以时刻或给药剂量为横坐标而作图，例如呼吸曲线、肌肉收缩曲线等；横、纵坐标轴均应加以标注，如药物剂量、时刻单位、测量指标及单位等。
3.实验数据若呈连续性变化，则以曲线形式表达实验结果，绘制通过各点的曲线或折线应光滑；实验数据若不呈连续性变化，则不宜用曲线表示，可采纳直方图的形式表示。
4．表及图下面应有必要的说明，如统计学显著性的表示等。
二、差值的显著性测验
实验终止后，实验者必须对所获得的实验结果进行统计学分析处理，才能发觉问题，得出结论。
药理学实验往往要在两组或两组以上实验对象上进行，如一组为实验组，一组为对比组，然后就两组所获得的实验数据进行比较，判定两者有无差异，从而确定被实验因素是否对实验对象确实具有某种阻碍，例如药物疗效之观看等。
但药理学研究的实验对象大差不多上各种动物（临床药理学研究的对象是人），因此实验中生物个体差异所造成的误差是不可幸免的，此外也还有一些其他性质的误差，可统称之为实验误差。
从而两组实验获得数据的差异就有可能是实验误差所造成，而在被实验对象的数目专门少时（小样本），此种可能性更大。
两组数据的差值怎么说是被实验因素所致，依旧实验误差阻碍所致，这不能主观决定，而一定要通过生物统计学的客观方法来判定，以确定此差值是否有意义。
此种方法就称为差值的显著性测验。
假如测验的结果是两组之间差异“显著”，则提示两组之间的差异可能是因处理因素（如药物）造成的；若“不显著”，就说明此差值专门可能是实验误差所造成的，没有实际意义。
但不应只依照一次的结果而轻率地下结论，在动物数少时专门如此。
应视具体情形，进行重复实验。
需要指出的是，统计学方法之运用需建立在对实验对象客观的、科学的分组和正确的实验资料的基础之上。
不当的实验设计与错误的实验资料，即使通过统计处理，其结论仍旧是不可靠的。
因实验指标有量反应指标和质反应指标的不同，其统计处理方法也不同。
分述如下：
1．量反应指标的差值显著性测验法
差值显著性测验最常应用的方法为“t检验法”。
t值即差值的绝对值与差值标准误之比。
亦即用误差单位来衡量差值的大小，视其有无意义。
依照实验数据运算出者称实验t值，t0为由t值表查出者，称标准t值。
差不多公式：
……（只适用于两组例数相等或近似之情形）
X……被实验个体实验观看指标量的大小。
N……该组被实验的对象数。
……该组X的均值，为测量指标最常应用的综合指标。
S……标准差，是用以估量原始数据（X）的分散程度或原始数据的实验误差程度的人为单位。
……标准误，用以估量均值（X）的可靠程度或均值的实验误差程度的人为单位。
……差值标准误，用以估量差值的可靠程度或差值实验误差程度的人为单位。
……两组均值数据差（差值）的绝对值。
自由度……统计学一专门术语。
只关系到一组时为例数减一（n—1），如关系到两组时则为总例数减二（n1+n2-2）。
∑……总和。
无效假设及结果判定：
第一假设两组的差异是由实验误差所致，处理因素对实验结果没有阻碍。
然后将实验数据带入公式运算t值。
将实验t值（ts）与标准t值（t0）相比较，判定标准如下：
t0（1％）＞ts＞t0（5％），则0.01＜P值ts＞t0（1％），则P值＜O．01，即无效假设成立的可能性小于1%，换言之，组间差异是因处理因素（如药物）所致的可能性大于99%，差异专门显著。
ts＞t0（5％），则P＞0．05，即无效假设成立的可能性大于5%，差异不显著。
P值为机率或危险率。
标准t值可依照t值表查出，由该表有关自由度及特点危险率（5％或1％）而找出该标准t值。
标准t值表
自由度
机率
自由度
机率
5％
1％
5％
1％
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
12.706
4．303
3．182
2．776
2．571
2．447
2．365
2．306
2．262
2．228
2．201
2．179
63．657
9．925
5．841
4．604
4．032
3．707
3．499
3．355
3．250
3．196
3．106
3．055
13
14
15
16
17
18
19
20
30
100
1000
X
2．160
2．145
2．131
2．120
2；110
2．101
2．093
2．083
2．042
1．984
1．962
1．960
3．012
2．977
2．947
2．92l
2．898
2．878
2．861
2．845
2．750
2．626
2．581
2．576
2．质反应指标的显著性测验法
计数资料显著性测验最常用的是X2（卡方）检验法，它能够用来检验两个或多个百分比（率）之间的差异。
运算方法和步骤如下：
（1）第一假设两组的差异是由机会所致，即两组的阳性是相同的。
（2）将数据带入四格表，并依照X2运算公式算出X2值。
（3）判定无效假设是否成立。
四格表
组别阳性阴性合计
用药组aba+b
对比组cdc+d
合计a+cb+da+b+c+d=n
x2检验的公式如下：
依照自由度查x2值表，自由度的运算公式为：
n（自由度）=（行-1）（列-1），故四格表法的自由度为1。
查x2值表可知，求得的x2值若大于3.84，则P值小于0.05，有显著差异；若求得的x2值大于6.63，则P值小于0.01，有专门显著差异。
即求得的x2值越大，否定假设情形的可能性就越大，差值是由处理因素所致的可能性越大；反之，x2值越小，否定假设情形的可能性越小，即差值是由实验误差所致的可能性越大。
注意：
数据中无0或1时才能够用上述公式运算x2值。
假如数据中显现了0或1，则要用简化值直截了当概率法运算。
实验动物数必须大于40。
x2值表
自
由
度
大于此值之机率P
0.900
0.750
0.500
0.250
0.100
0.050
0.025
0.010
0.005
1
0.02
0.01
0.45
1.32
2.71
3.84
5.02
6.63
7.88
第五节实验报告的书写要求
实验报告是实验者对其完成的实验工作进行的扼要的文字总结，是综合评定实验课成绩的重要依据之一。
学生每完成一次实验都应提交相应的实验报告。
实验报告通常的格式如下：
姓名专业班级组别日期
1．实验题目：
2．实验目的及原理：
3．实验材料：
包括实验器材、实验动物及药品试剂。
实验动物要写明其种类、性别、体重。
假如所使用的仪器和方法与实验教材规定的有所不同时，可作简要说明。
4．实验方法：
实验步骤可作简要描述。
5．实验结果:
应详细记录原始数据，对较长的曲线记录，可选取一段有变化的曲线，剪下后贴在实验报告中，并依照原始资料，真实、准确记述所观看到的实验现象。
将原始数据进行统计学处理，最后用图或表来表示。
绘图时，应在横轴和纵轴上画出刻度，标明数值单位。
一样以纵轴表示反应强度，横轴表示时刻或药物剂量。
绘制表格时，应制三线表，表内布局要合理，标题在表的上方。
6．讨论：
实验结果的讨论是依照已知的理论知识和已有的文献资料对实验结果的说明和分析，判定所得到的结果是否为预期的结果；关于非预期结果要分析可能的缘故。
还应在讨论中指出实验结果的生物学意义。
7．结论：
是对该实验所能证明的作用或作用机制的简明总结。
不要简单地排列具体的结果，而应在讨论的基础上归纳出概括性的判定。
结论应言之有据，不能充分证明的理论分析不应写入结论中。
第六节实验室守则
1.遵守学习纪律，准时到达实验室。
在做实验时因故外出或早退应向指导老师请假，经同意后方能离开实验室。
2.实验时应严肃认真，不得高声谈笑及进行任何与实验无关的活动，应保持实验环境的宁静。
参加实验时应穿着实验工作服。
3.参加实验者应先熟悉实验仪器和设备的性能及使用要点，而后使用。
一旦发觉仪器和设备故障或损坏，应赶忙向指导教师报告，以便能及时修理或更换，不可擅自拆修或调换。
仪器和设备不慎损坏时，应及时向指导教师汇报情形，按章赔偿。
4.各实验小组的实验仪器和器材各自保管使用，不得随意与他组调换挪用。
如需补发增加时，应向指导教师申报理由，经同意后方能补领。
每次实验后应清点实验器材，用品。
5.爱惜公共财物，注意节约器材，爱护实验动物，实验室内物品不得擅自带走。
6.保持实验室的整洁卫生，不必要的物品不要带进实验室内。
实验完毕后，应将实验器材，用品及实验桌凳收拾洁净；实验动物尸体和废物应放到指定的地点，不得随地乱丢。
实验室的清洁卫生工作应由各实验小组轮番负责打扫，以保证实验室环境整洁卫生。
（邹莉波）
第二章动物实验的差不多操作技术
第一节药理学实验常用动物的种类及特点
一．小白鼠（mouse）
小白鼠属哺乳纲，啮齿目，鼠科。
其温顺易捉，繁育力强，价格低廉，对实验动物同种、纯种、性别和年龄的要求比较容易满足，生活条件也容易操纵，因此是药理学实验最常用的动物，专门适用于需要大样本的实验，如药物选择、药物半数致死量的测定等。
小白鼠对多种疾病有易感性，能够复制多种疾病模型，如癌症、肉瘤、白血病、血吸虫病、败血症、癫痫、药物依靠性、痴呆症等。
二．大白鼠（rat）
大白鼠亦属哺乳纲，啮齿目，鼠科，受惊时有攻击性，易对实验者造成损害，应注意防护。
大白鼠也可用于多用实验和复制多种动物模型，如复制水肿、炎症、缺氧、休克、发热、胃溃疡、高血压以及肾衰等动物模型；大白鼠的垂体-肾上腺功能专门发达，常用来作应激反应、肾上腺及垂体等内分泌功能实验。
大白鼠的高级神经活动发达，因此，也广泛用于脑功能定位、神经元细胞外记录等实验中。
三．家兔（rabbit）
家兔属哺乳纲，啮齿目，兔科。
其特点是性情温顺，易于饲养。
常用于与呼吸功能、泌尿功能、心血管功能有关的实验中，如呼吸运动的调剂及呼吸衰竭的处理、血压的调剂和心衰的处理等。
因家兔对致热源敏锐，故常用于研究解热药和检查热源。
此外，因家兔耳长大，血管清晰，便于静脉注射和采血，故也广泛用于药物的血管刺激性及溶血性的研究。
四．豚鼠（guinea-pig）
豚鼠又称天竺鼠，荷兰猪。
属哺乳纲，啮齿目，豚鼠科。
其特点是性情温顺，对组胺和结核菌敏锐。
常用于复制哮喘、组胺过敏、结核病模型，以研究平喘药、抗组胺药以及抗结核药的作用。
也用于药物安全性试验中的全身主动过敏性试验。
五．猫（cat）
猫属哺乳纲，食肉目，猫科。
与兔相比，猫对外科手术的耐受性强，血压相对稳固，但极具攻击性。
常用于去大脑僵直、下丘脑功能以及血压方面的实验。
六．犬
犬常用于观看动物对冠状动脉血流量的阻碍、心肌细胞电生理研究、降压药及抗休克药的研究等；通过训练，可与人合作，专门适用于慢性实验，如条件反射试验。
犬的体形大，对手术的耐受性较强，常用于其他小动物不易进行的手术中，如胃瘘、肠瘘、膀胱瘘、胆囊瘘以及冠状动脉结扎等。
在进行临床前长期毒性试验中，犬是常用动物。
七．蟾蜍（toad）
蟾蜍属于两栖纲，无尾目。
由于进化较低，其离体标本（如心脏、腓肠肌等）能在较长时刻内保持着自律性和兴奋性，而且蟾蜍容易获得并价格廉价，故经常被用于研究药物对心脏的阻碍、反射弧分析以及肌肉收缩等实验中。
第二节实验动物的选择
为了获得理想的实验结果，必须依照实验目的选择适宜的观看对象，在选择动物时，需考虑如下因素：
一．种属的选择
不同种属的动物对同一疾病病因刺激的反应程度会有专门大的差异。
在选择实验动物时，尽可能选择对刺激因素较为敏锐且与人类接近的种属。
例如在进行发热实验时，宜首选家兔：
在进行过敏反应和变态反应实验时，宜首选豚鼠；小鼠则宜用于半数致死量等方面的观看。
二．性别的选择
由于成年雌性动物的代谢存在着明显的性周期的变化，这些变化会阻碍受试动物对某些实验因素的反应状态。
因而在选择实验动物时，一样多用雄性动物，但热板法镇痛实验不宜选用雄性小鼠或大鼠，半数致死量的测定应雌雄各半。
三．周龄或体重的选择
一样选择成年动物，小鼠体重18-22g，大鼠体重200-250g，豚鼠体重350-450g，家兔体重2.5-3.5kg，beagle犬体重8-20kg。
但有些实验对动物体重或周龄有专门要求，如大鼠足肿胀法的抗炎实验，宜选用120-150kg的大鼠，对致炎剂敏锐。
制作大鼠脑永久性低灌注模型时，宜选用13周龄以上的大鼠，可大大降低死亡率。
四．状态的选择
实验动物对人类疾病的表达程度及对施加因素的反应情形，除了与动物自身的生理特点有关外，还受动物的状态，如是否饥饿、睡眠是否足够、是否患有其他疾病等的阻碍。
因此，应选择健康、反应机敏以及其它各个方面条件尽量一致的动物作为观看对象。
五．实验条件的选择
由于环境因素对实验结果有着专门强的干扰作用，如明、暗（即光照周期）对体内代谢就有着重要的阻碍。
在实验时应选择与受试动物自然生活尽量一致的实验环境或人为地将实验环境操纵到符合条件的程度。
第三节实验动物的编号
在药理学实验中为了观看并记录每只动物、各组动物的变化情形，必须在实验前预先对动物进行随机分组和编号标记。
关于比较大的动物如狗，兔等，可将号码烙在金属牌上，实验时将其固定于狗链条或兔耳上。
关于家兔还可采纳化学药品涂染背毛或采纳兔耳打孔法。
下面以药理学实验最常用动物为例，介绍大鼠和小鼠的编号标记方法。
大鼠和小鼠的编号一样都采纳各种不同颜料涂擦被毛的方法来标记，也可用不同颜色的油性记号笔在尾部标记。
常用的涂染化学品如下：
1.涂染黄色，用3%～5%苦味酸溶液。
2.涂染红色，用0.5%中性红或品红溶液。
3.涂染咖啡色，用2%硝酸银溶液。
4.涂染黑色，用煤焦油的酒精溶液。
最常用的是3%～5%苦味酸溶液。
用毛笔或棉棒蘸取此溶液，在动物的不同部位涂上苦味酸溶液表示不同号码。
一样适应涂染在左前腿上为1，左侧腰部为2，左后腿上为3，头部为4，背部正中为5，尾基部为6，右前腿为7，右侧腰部为8，右侧后腿上为9，不涂染鼠为10（如图2-1A、B）。
假如实验时动物的编号超过10，且在20～99之内，可采纳在上述动物同一部位上，再涂染另一种涂染剂（如0.5%中性红或品红溶液）斑点，表示相应的十位数。
例如，在左前腿标记红色和黄色斑点，这就表示为11；假如红色标记在左前腿上，而黄色标记在左腰部，这确实是12，以此类推（如图2-1C、D）。
也能够用同一种颜色涂在两个部位来标记10以上的记号。
如左前腿和左后腿都标记苦味酸溶液，表示13号，以此类推。
图2-1A图2-1B
图2-1C图2-1D
上述苦味酸溶液等颜料标记的优点是连续时刻比较长，一个月左右也可不能退色，关于慢性实验专门适合。
假如是急性实验，或饲养小鼠时刻在一周之内，可用不同颜色的油性记号笔在尾部标记，如图2-2所示。
图2-2
标记要有记录，做到实验者心中有数，以免时刻长不记得。
第四节实验动物的捉持和给药方法
正确地捉拿与固定动物是药理学实验的差不多操作之一，也是实验顺利进行的保证。
把握正确的动物捉拿与固定方法，不仅可有效防止实验者被动物咬、抓伤，也可确保动物不被过分激惹，以保证其正常的生理活动不受明显干扰，从而不致明显地阻碍实验结果。
一．小鼠的捉持和给药方法捉拿小鼠时，先用右手将鼠尾抓住并提起，将小鼠放在鼠笼上或较为粗糙的台面上，在其向前爬行时，用右手向后拉尾，用左手的拇指和食指抓住小鼠的两耳及头颈部皮肤，将其置于手心中，拉直四肢并用左手的无名指压紧尾部，右手即可作注射和进行其它操作（如图2-4-1）。
也可只用左手捉拿小鼠，方法是先用左手的拇指和食指抓住小鼠的尾部中段，然后用左手的无名指和小指夹住尾的根部，并轻压向背部，用左手的拇指和食指抓住小鼠的两耳及头颈部皮肤，将其置于手心中。
此种方法熟练后，比两手捉拿小鼠方便快捷，也便于右手的操作。
取尾血或进行尾静脉注射时，可将小鼠固定在金属、玻璃、塑料或木制的固定器上。
给药方法：
1．灌胃法左手捉拿小鼠，右手持灌
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