SMCC结构反应解释.docx

SMCC结构反应解释.docx

《SMCC结构反应解释.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《SMCC结构反应解释.docx（9页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

SMCC结构反应解释

SMCC是一类含有N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活性酯和马来酰亚胺的双功能偶联剂.可以将分别含有巯基和氨基的化合物键接在一起。

NHS活性酯与伯胺在PH7-9的环境形成酰胺键。

马来酰胺与巯基在PH6.5-7.5的环境下形成稳定的硫醚键。

在水溶液中，NHS活性酯的水解是（与氨基的反应）个竞争反应。

马来酰胺比NHS稳定，但是在PH大于7.5时，马来酰胺会慢慢水解，失去与巯基反应的特异性。

因而，在使用SMCC时通常是在PH7.2-7.5的环境下进行，并且先让NHS发生反应。

SMCC结构里的环己烷环可以降低马来酰胺的水解速率。

这使得蛋白质在用SMCC修饰之后可以冻干存放一段时间。

很多蛋白质都选用该试剂来进行马来酰亚胺修饰。

用SMCC来制备抗体-酶或者半抗原作载体的蛋白质，经常采用两步合成法。

首先，含有氨基的蛋白质与几倍的偶联剂反应，反应结束后通过脱盐柱或者透析的方法除掉没有反应玩的SMCC。

然后，再与含有巯基的蛋白质反应。

在实际操作中要注意的是，SMCC怕潮湿，存放时要和干燥剂一起存放。

并且使用中从冰箱拿出来时要先在室外放置一段时间平衡温度，以免立刻开启，空气中水分遇冷凝结，破坏SMCC结构。

INSTRUCTIONS 

 SMCC （succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-carboxylate）, 50 mg 

Molecular Weight:

 334.32 Spacer Arm:

 8.3 Å Net Mass Added:

 219.09 

Storage:

 Upon receipt store desiccated at 4° C. 

Product is shipped at ambient temperature. 

 Sulfo-SMCC （sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-carboxylate）, 1 g Sulfo-SMCC, 50 mg 

Sulfo-SMCC, No-Weigh™ Format, 8 × 2 mg microtubes  

Molecular Weight:

 436.37 Spacer Arm:

 8.3 Å 

Net Mass Added:

 219.09 CAS #:

 92921-24-9 

Storage:

 Upon receipt store desiccated at -20° C. Product is shipped at ambient temperature. 

Introduction 

SMCC and its water-soluble analog Sulfo-SMCC are heterobifunctional crosslinkers that contain N-hydroxysuccinimide （NHS） ester and maleimide groups that allow covalent conjugation of amine- and sulfhydryl-containing molecules. NHS esters react with primary amines at pH 7-9 to form amide bonds, while maleimides react with sulfhydryl groups at pH 6.5-7.5 to form stable thioether bonds. In aqueous solutions, NHS ester hydrolytic degradation is a competing reaction whose rate increases with pH. The maleimide group is more stable than the NHS-ester group but will slowly hydrolyze and loses its reaction specificity for sulfhydryls at pH values > 7.5. For these reasons, conjugations with these crosslinkers are usually performed at pH 7.2-7.5, with the NHS-ester （amine-targeted） reacted before or simultaneous with the maleimide （sulfhydryl-targeted） reaction. 

The cyclohexane ring in the spacer arm of these reagents decreases the rate of hydrolysis of the maleimide group compared to similar reagents that do not contain this ring.1 This feature enables proteins that have been maleimide-activated with SMCC or Sulfo-SMCC to be lyophilized and stored for later conjugation to a sulfhydryl-containing molecule. Many maleimide-activated protein products are produced in this manner （see Related Products）. 

SMCC and Sulfo-SMCC are often used to prepare antibody-enzyme and hapten-carrier protein conjugates in a two-step reaction scheme. First, the amine-containing protein is reacted with a several-fold molar excess of the crosslinker, followed by removal of excess （nonreacted） reagent by desalting or dialysis; finally, the sulfhydryl-containing molecule is added to react with the maleimide groups already attached to the first protein. 

Sulfo-SMCC is soluble in water and many other aqueous buffers to approximately 10 mM, although solubility decreases with increasing salt concentration. SMCC is not directly water-soluble and must be dissolved in an organic solvent such as dimethylsulfoxide

 （DMSO） or dimethylformamide （DMF）; subsequent dilution into aqueous reaction buffer is generally possible, and most protein reactants will remain soluble if the final concentration of organic solvent is less than 10%.  

SMCC and Sulfo-SMCC 

Important Product Information 

• 

SMCC and Sulfo-SMCC are moisture-sensitive. Store reagent vial in desiccant. Equilibrate vial to room temperature before opening to avoid moisture condensation inside the container. Dissolve needed amount of reagent and use it immediately before hydrolysis occurs. Discard any unused reconstituted reagent. Do not store reagent in solution.  • 

No-Weigh Microtube Handling:

 Immediately before use, puncture the microtube foil with a pipette tip, add 200 µl of 50 mM sodium phosphate buffer （pH 7.0-7.5） or ultrapure water and pipette up and down to mix. After use, cut the used microtube from the microtube strip and discard. Store the unused microtubes in the foil pouch provided. 

Note:

 Do not use phosphate-buffered saline （PBS） for initial dissolution of Sulfo-SMCC; the reagent does not dissolve well in buffers exceeding 50 mM total salts. However, once dissolved, the solution can be further diluted in PBS or other non-amine buffers. • 

Avoid buffers containing primary amines （e.g., Tris or glycine） and sulfhydryls during conjugation, because they will compete with the intended reaction. If necessary, dialyze or desalt samples into an appropriate buffer such as phosphate- buffered saline （PBS）. 

• 

Molecules to be reacted with the maleimide moiety must have free （reduced） sulfhydryls. Reduce peptide disulfide bonds with Immobilized TCEP Disulfide Reducing Gel （Product No. 77712）. For proteins, reduce disulfide bonds using 5 mM TCEP （1:

100 dilution of Bond-Breaker® TCEP Solution, Product No. 77720） for 30 minutes at room temperature, 

followed by two passes through a suitable desalting column （e.g., Zeba™ Desalt Spin Columns）. Be aware that proteins （e.g., antibodies） may be inactivated by complete reduction of their disulfide bonds. Selective reduction of hinge-region disulfide bonds in IgG can be accomplished with 2-Mercaptoethylamine•HCl （2-MEA, Product No. 20408）. Sulfhydryls can be added to molecules using N-succinimidyl S-acetylthioacetate （SATA, Product No. 26102） or 2-iminothiolane•HCl （Traut’s Reagent, Product No. 26101）, which modify primary amines.   

Procedure for Two-step Protein Crosslinking 

Generally, a 10- to 50-fold molar excess of crosslinker over the amount of amine-containing protein results in sufficient maleimide activation to enable several sulfhydryl-containing proteins to be conjugated to each amine-containing protein. More dilute protein solutions require greater fold molar excess of reagent to achieve the same activation level. Empirical testing is necessary to determine optimal activation levels and final conjugation ratios for the intended application. A. Material Preparation • 

Conjugation Buffer:

 phosphate-buffered saline （PBS = 100 mM sodium phosphate, 150 mM sodium chloride, pH 7.2; e.g., Product No. 28372） or other amine- and sulfhydryl-free buffer at pH 6.5-7.5 （see Important Product Information） – adding EDTA to 1-5 mM helps to chelate divalent metals, thereby reducing disulfide formation in the sulfhydryl-containing protein 

• Desalting column to separate modified protein from excess crosslinker and reaction byproducts （e.g., Zeba Desalt Spin Columns） 

• 

Amine-containing （Protein-NH2） and sulfhydryl-containing proteins （Protein-SH） to be conjugated 

B. Protocol 

Note:

 For best results, ensure that Protein-SH is prepared and ready to combine with Protein-NH2 in step 5. 1. Prepare Protein-NH2 in Conjugation Buffer.   

2. Add the appropriate amount of crosslinker to the protein solution. The concentration of the Protein-NH2 determines the 

crosslinker molar excess to use. Suggested crosslinker molar excesses are as follows （also see Table 1）:

• Protein samples < 1 mg/ml use 40-80-fold molar excess.

• Protein samples of 1-4 mg/ml use 20-fold molar excess. 

• Protein samples of 5-10 mg/ml use 5- to 10-fold molar excess.   

Table 1. Crosslinker preparation and molar excess to use for 1 ml of sample. Immediately before use, dissolve crosslinker in the appropriate solvent at the concentration denoted in parentheses; then add the listed volume to a 1 ml protein sample. For example, to use the No-Weigh Sulfo-SMCC, dissolve the 2 mg contents of the microtube in 200 µl of buffer and then add the prescribed volume to per 1 ml sample. For the other products, the appropriate amount of dry reagent must be weighed on a balance （e.g., 2.4 mg Sulfo-SMCC for dissolution in 500 µl buffer）. 

Protein-NH2 Concentration 

（based on a 50 kDa protein）  10 mg/ml  1 mg/ml  0.5 mg/ml 

Crosslinker Molar Excess 5X 20X 50X Sulfo-SMCC 

（in 50 mM sodium phosphate or water） 100 µl （4.8 mg/ml*） 40 µl （4.8 mg/ml*） 50 µl  （4.8 mg/ml*） No-Weigh Sulfo-SMCC 

（in 50 mM sodium phosphate or water） 

50 µl （10 mg/ml*） 20 µl  （10 mg/ml*） 25 µl  （10 mg/ml*） SMCC 

（in DMSO or DMF） 

100 µl  （3.7 mg/ml*） 

100 µl  （1.5 mg/ml*） 

100 µl  （1.8 mg/ml*） 

*Concentration of each crosslinker before adding to protein sample. 

Note:

 If the Sulfo-SMCC solution does not completely dissolve, place the tube under hot running water or incubate for several minutes in a 50°C water bath.   

3. Incubate reaction mixture for 30 minutes at room temperature or 2 hours at 4°C. 

4. Remove excess crosslinker using a desalting column equilibrated with Conjugation Buffer. 

5. Combine and mix Protein-SH and desalted Protein-NH2 in a molar ratio corresponding to that desired for the final 

conjugate and consistent with the relative number of sulfhydryl and activated amines that exist on the two proteins. 6. Incubate the reaction mixture at room temperature for 30 minutes or 2 hours at 4°C. 

Note:

 Generally, there is no harm in allowing the reaction to proceed for several hours or overnight, although usually the reaction will be complete in the specified time. To stop the conjugation reaction before completion, add buffer containing reduced cysteine at a concentration several times greater than the sulfhydryls of Protein-SH. Note:

 Conjugation efficiency can be estimated by electrophoresis separation and subsequent protein staining.  

Additional Information 

A. Please visit the Pierce website for additional information including the following item:

 • 

Tech Tip:

 Attach an antibody onto glass, silica or quartz surface B. Two-step reaction scheme 

Maleimide-activated Antibody

Antibody-enzyme Conjugate

Sulfo-SMCCAntibodyAntibody

AntibodyEnzyme

Enzyme

Figure 1. Two-step reaction scheme for conjugating antibody and enzyme proteins with Sulfo-SMCC. In this example, the crosslinker is first reacted with the antibody to produce a mal