甘蓝型油菜隐性细胞核雄性不育上位抑制基因.docx

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甘蓝型油菜隐性细胞核雄性不育上位抑制基因

HUAZHONGAGRICULTURALUNIVERSITY

博士学位论文

PhDDISSERTATION

甘蓝型油菜隐性细胞核雄性不育上位抑制基因ESP的

遗传图谱定位

MAPPINGOFTHEEPISTATICSUPPRESSORGENE（ESP）OFARECESSIVEGENICMALESTERILITYINRAPESEED（BRASSICANAPUSL.）

研究生:

徐正华

CANDIDATE:

XUZHENGHUA

导师:

杨光圣教授

SUPERVISOR:

PROFESSORYANGGUANGSHENG

专业:

作物遗传育种

MAJOR:

CROPGENETICS&BREEDING

研究方向:

FIELD:

油菜遗传育种

RAPESEEDGENETICSANDBREEDING

中国武汉

WUHAN，CHINA

二○○九年九月

SEPTEMBER，2009

分类号：

密级：

华中农业大学博士学位论文

甘蓝型油菜隐性细胞核雄性不育上位抑制基因Esp的

遗传图谱定位

MappingoftheEpistaticSuppressorGene（Esp）ofaRecessiveGenicMaleSterilityinRapeseed（BrassicanapusL.）

专业:

作物遗传育种

Major:

CropGenetics&Breeding

研究方向:

油菜遗传育种

Researchregion:

RapeseedGeneticsandBreeding

研究生:

徐正华

PhD.Candidate:

XuZhenghua

导师:

杨光圣教授

Supervisor:

Pro.YangGuangsheng

华中农业大学植物科学与技术学院

CollegeofPlantScienceandTechnology,HuazhongAgriculturalUniversity

作物遗传改良国家重点实验室

NationalKeyLaboratoryofCropGeneticImprovement

二○○九年九月

September,2009

目　　录

摘要I

ABSTRACTIII

缩略词表V

1文献综述1

1.1油菜杂种优势与利用1

1.2油菜杂种优势利用的途径2

1.2.1细胞质雄性不育2

1.2.2细胞核雄性不育2

1.2.3细胞核+细胞质雄性不育3

1.2.4生态型雄性不育3

1.2.5自交不亲和3

1.2.6其他利用途径3

1.3油菜细胞核雄性不育的研究概况4

1.3.1油菜细胞核雄性不育的来源4

1.3.2油菜细胞核雄性不育的形态特征5

1.3.3油菜细胞核雄性不育的遗传分类6

1.3.4油菜细胞核雄性不育的细胞学研究9

1.3.5油菜细胞核雄性不育的分子机理研究10

1.4质量性状遗传图谱定位的分子标记13

1.4.1常见的用于定位的分子标记13

1.4.2质量性状定位群体的选择及定位的方法16

1.4.3油菜细胞核雄性不育相关基因的定位17

1.4.3油菜质量性状基因精细定位的策略探讨20

1.5分子标记辅助选择在油菜育种中的应用22

1.5.1前景选择23

1.5.2背景选择24

1.5.3分子标记辅助选择在油菜育种中的应用25

2本研究的目的与意义27

3甘蓝型油菜隐性细胞核雄性不育上位抑制基因Esp的遗传图谱定位28

3.1材料与方法28

3.1.1实验材料28

3.1.2实验群体的构建28

3.1.3育性调查以及DNA的提取28

3.1.4DNA混合池的构建28

3.1.5AFLP分析29

3.1.6AFLP标记向SCAR标记的转化32

3.1.7侧翼序列的PCRwalking34

3.1.8连锁遗传分析35

3.1.9SCAR引物的大群体分析35

3.1.10各标记序列与拟南芥序列的同源性比较35

3.1.11比较图谱定位36

3.2结果与分析36

3.2.1定位群体的育性调查结果36

3.2.2AFLP引物的筛选36

3.2.3与上位抑制基因Esp连锁的AFLP标记37

3.2.4连锁遗传分析40

3.2.5差异片断的回收与克隆41

3.2.6差异片段的序列分析及SCAR标记的转化42

3.2.7SCAR标记的大群体分析47

3.2.8大群体连锁遗传分析48

3.2.9各标记序列与拟南芥序列的同源性比较49

3.2.10比较图谱定位49

3.3讨论52

3.3.1AFLP技术及标记的筛选52

3.3.2AFLP标记及其向SCAR标记的转化53

3.3.3定位群体的选择55

3.3.4特异性分子标记的开发55

3.3.5与Esp连锁的分子标记的应用价值57

3.3.6上位抑制基因Esp的精细定位与图位克隆策略57

参考文献60

作者简历80

致谢81

摘要

油菜隐性细胞核雄性不育具有不育性彻底、稳定、无不良胞质效应、恢复源广等优点，在国内已经成为杂种优势利用的一个重要途径，但由于得不到100%的不育系，在杂交制种时需人工拔除不育系株行中50%的可育株，限制了其广泛应用。

9012A是陈凤祥于1993年春在甘蓝型油菜自育品系9012中发现的一类新的隐性细胞核雄性不育材料，该不育材料综合农艺性状、品质性状优良、配合力强。

陈风祥等利用该不育材料选育出稳定的双低两用系9012AB，并于1998年通过遗传研究证明了9012A的隐性上位遗传互作模式，即育性受两对重叠隐性不育基因（ms3和ms4）和一对隐性上位抑制基因（espesp）互作控制，上位基因纯合隐性时对隐性不育基因起抑制作用，三对基因都为纯合隐性时表现为可育，与纯合不育系杂交能够产生全不育的群体，可用作保持系，从而解决了核不育制种中拔除50%可育株的难题。

本研究以甘蓝型油菜隐性上位互作核不育系9012A和临保系为材料，构建回交群体（BC1代），其基因型分别为ms3ms3ms4ms4espesp（可育）和ms3ms3ms4ms4Espesp（不育），采用AFLP和BSA技术筛选与隐性上位抑制基因位点Esp紧密连锁的分子标记，并将其转化为更有利于大群体分析的SCAR标记进行精细定位，得到目的基因区域的精细遗传图谱，为Esp基因的图位克隆奠定基础。

同时，开发出的与目标基因紧密连锁的分子标记（AFLP、SCAR以及SSR标记），可进一步用于分子标记辅助选择育种。

取得的实验结果和主要结论如下：

1.构建了190个单株的BC1群体，采用BSA与AFLP相结合的方法筛选了4096对AFLP引物，共找到了35个与目标基因连锁的分子标记，其中7个标记与目标基因共分离，19个标记位于一侧，9个标记位于另一侧。

2.对9个标记进行了回收、克隆、测序，已经将其中的6个标记（EA03MG13、EC07MC07、EA05TC16、EA07TC06、EA12TC01和EC03TC08）成功地转化为了SCAR标记。

3.利用2355个单株的BC1群体对6个SCAR标记进行了验证，结果表明：

SCAR标记XA、XB、XE-2、XF-1依然没有找到交换单株；SCAR标记SC23有85株发生了交换；SCAR标记XH-1有16株发生了交换。

SC23和XH-1与目标基因的遗传距离分别为3.67cM和0.68cM。

4.利用DH群体TN（Tapidor×Ningyou7）的遗传图谱将目标基因定位于甘蓝型油菜的N7连锁群，并在N7连锁群上成功整合与目标基因连锁的SSR标记Ra2G08与BRAS023，同时也将目标基因定位于白菜的A7连锁群，整合与目标基因连锁的SSR标记BRMS040。

利用2355个单株的BC1群体对SSR标记Ra2G08进行了分析，得出结论：

Ra2G08位于XH-1的另一侧，距离目标基因0.35cM，这样使得目标基因被锁定在1.03cM的范围之内。

关键词：

甘蓝型油菜；隐性核不育；上位抑制基因；SCAR；精细定位；比较图谱

ABSTRACT

Thegenicmalesterility（GMS）systemshadgreatpotentialforhybridseedproductioninvirtueofthecharacteristicsofcompleteandstablemalesterility,widelyspreadofrestorersandnonegativecytoplasmiceffectsonplantgrowth.However,theproductionofF1hybridseedrequirestheremovalof50%ofsegregatingfertileplantsinthesterilefemalelinewhichlimitsitsutilizationforproductionofhybridseed.In1993,Chenetal.reportedarecessivegenicmalesterility（RGMS）linewithanepistaticinhibitorgene,9012A,itsagronomicproperties,qualitypropertiesandcombiningabilityaregood.9012ABisarecessiveepistaticgenicmalesterility（REGMS）linederivedfromanaturalmutantfoundintheBrassicanapusaccessions9012,Geneticanalysisindicatedthatthemalesterilityof9012ABiscontrolledbytworecessivegenes（ms3andms4）interactingwithonerecessiveepistaticsuppressiongene（esp）.Homozygousrecessivesterilegeneatbothloci（ms3ms3ms4ms4）canresultinmalesterility,butthefertilitycanberestoredwhentheespgeneisinrecessivehomozygosity.Basedonthisgeneticmodel,themultiplicationoffemalelinecanbeachievedbycrossinghomozygousmale-sterileline（ms3ms3ms4ms4EspEsp）withamaintainerline（ms3ms3ms4ms4espesp）.ThissystemovercomesthedefectoftraditionalRGMSbecausea100%male-sterilepopulation（ms3ms3ms4ms4Espesp）couldbeproducedandnoneedisrequiredforremoving50%fertileplantsofmaternalline.

Inthisresearch,aBC1populationwasproducedfromacrossbetween9012A（ms3ms3ms4ms4EspEsp）andTAM（ms3ms3ms4ms4espesp）bybackcrossingoftheF1progenytotherecurrentparentTAM.AFLPandBSAwereusedtoidentifyandvalidatemolecularmarkerstightlylinkedtoEspgene,fortheconvenientinlarge-scalepopulationanalysis,itisnecessarytoconvertAFLPmarkersintoSCARmarkers,constructfinegeneticlinkagemapsurroundingtheEsploci.Theseresultslaysasolidfoundationformap-basedcloningoftheEspgene.AndthemocularmarkerstightlylinkedtoEspgenewillfacilitatethemarker-assistedselection（MAS）ofmale-sterilelinesandmaintainers.Mainresultsofthepresentstudyareasfollowing:

1.ABC1populationincluded190plantswasproduced,combiningAFLPandBSAtoidentifymolecularmarkerstightlylinkedtoEspgene.Fromthesurveyof4,096pairsofAFLPprimers,thirtyfivefragmentswereidentifiedtobetightlylinkedtoEspgene,19markersand9markersresideoneachsideoftargetgene,and7markersco-segregatedwiththetargetgene.

2.NineoftheAFLPfragmentswerecloned,sequenced.Andsixofthem:

EA03MG13,EC07MC07,EA05TC16,EA07TC06,EA12TC01andEC03TC08weresuccessfullyconvertedintoSCARmarkers.

3.ABC1populationincluding2,355individualswasdevelopedforfurtherstudyofthesixSCARmarkers,andtheresultsindicatedfourSCARmarkersXA,XB,XE-2,XF-1wereco-segregatedwiththetargetgene,the2markersSC23andXH-1werelocatedatonesideofthetargetlocuswithageneticdistanceof3.67cMand0.68cMrespectively.

4.ThroughcomparingwiththelinkagemapofDH（Tapidor×Ningyou7）population,thetargetgenehasbeenmappedonlinkagegroupN7.SSRmarkerslocatedonlinkagegroupN7,Ra2G08andBRAS023,wereconfirmtolinkagetothetargetgene.ThetargetgenealsohasbeenmappedonlinkagegroupA7,SSRmarkerBRMS040wasconfirmtolinkagetothetargetgene.TheSSRmarkerRa2G08waslocatedatanothersideofthetargetlocuswithageneticdistanceof0.35cM.Theespgenewasthengeneticallymappedtoaregionof1.03cM,with0.68cMfromSCARmarkerXH-1and0.35cMfromSSRmarkerRa2G08,respectively.

Keywords:

Brassicanapus;recessivegenicmalesterility（RGMS）;epistaticsuppressorgene;SCAR;finemapping;comparativemapping

缩略词表

缩略符号

Abbr.

英文

English

中文

Chinese

ACGM

Amplifiedconsensusgeneticmarkers

扩增共有序列遗传标记

AFLP

Amplifiedfragmentlengthpolymorphism

扩增片段长度多态性

Amp

Ampicillin

氨苄青霉素

BAC

Bacterialartificialchromosome

细菌人工染色体

BLAST

Basiclocalalignmentsearchtool

局部比对基本检索工具

BSA

Bulkedsegregationanalysis

分离群体分组分析法

CAPS

Cleavedamplifiedpolymorphicsequence

切割扩增序列多态性

CMS

Cytoplasmicmalesterility

细胞质雄性不育

CTAB

Cetyltrimethylammoniumbromide

十六烷基三甲基溴化铵

DH

Doubledhaploidline

双单倍体

EDTA

Ethylenediaminetetraaceticacid

乙二胺四乙酸

EST

Expressedsequencetag

表达序列标签

GMS

Genicmalesterility

细胞核雄性不育

IPTG

Isopropylthio--D-galactoside

异丙基硫代--D-半乳糖苷

MAS

Marker-assistedselection

分子标记辅助选择

NILs

Nearlyisogeniclines

近等基因系

PAGE

polyacrylamidegelelectrophoresis

聚丙烯酰胺凝胶电泳

PCR

PolymeraseChainReaction

聚合酶链式反应

RAPD

RandomlyamplifiedpolymorphicDNA

随机扩增DNA多态性

RFLP

Restrictionfragmentlengthpolymorphism

限制性酶切片段长度多态性

RIL

Recombinationinbredline

重组自交系

SCAR

Sequencecharacterizedamplifiedregion

序列特异扩增区域

SNP

Single-nucleotidepolymorphisms

单核苷酸多态性

SSH

Suppressionsubtractivehybridization

抑制性消减杂交

SSR

Simplesequencerepeat

简单序列重复

STS

Sequencetaggedsite

序列标签位点

X-gal

5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-galactoside

5-溴-4-氯-3-吲哚--D-半乳糖苷

1文献综述

1.1油菜杂种优势与利用

油菜是我国最重要的油料作物，也是世界四大油料作物之一，种子含油量33%-50%。

油菜籽是我国食用植物油的最主要来源，也是潜在的仅次于豆粕的大宗饲用蛋白源。

自1985年以来，我国油菜种植面积和油菜籽总产量均居世界首位，占世界油菜种植面积和油菜籽总产量的30%左右。

1995年以来，我国油菜常年种植面积在650万hm2以上,油菜籽产量在1000万吨以上，占油料作物总产量的40%-45%（不含大豆）。

油菜除用作榨取食用油和饲料之外，在食品工业中还可制作人造奶油、人造蛋白。

还在冶金、机械、橡胶、化工、油漆、纺织、制皂、造纸、皮革和医药等方面都有广泛的用途，具有重要的经济价值。

生物柴油为菜籽提供了新的利用途径，也为油菜生产展现了新的发展前景。

杂种优势是植物界中普遍存在的一种生物学现象，指的是遗传组成不同的亲本杂交产生的F1代在生活力、生长势、适应性、抗逆性和丰产性等方面明显优于双亲的现象。

利用杂种优势可以大幅度提高作物产量，增强作物抗逆性，改善作物品质等（潘家驹，1995）。

近年来，杂种优势在玉米、高粱、水稻、油菜等作物中得到了广泛的应用（李泽炳等，1981；Crow,1998；傅廷栋，2000）。

油菜杂种优势有其自身的特点：

1）杂种优势强，增产效果显著。

无论是冬油菜还是春油菜，自交系间杂种一代的产量平均要高出中亲值的30-60%（SernykandStefanson,1983；GrantandBeversdorf,1985）。

不同地理来源的油菜间杂交能产生更强的杂种优势。

Grant和Beversdorf（1985）发现加拿大的材料作母本与欧洲的材料杂交，其优势强于欧洲×欧洲、加拿大×加拿大的组合。

管荣展和盖钧锰（1998）对14个亲本所配91个杂交组合进行产量比较实验，发现杂交种亲本的血缘关系越远，配合力越高，其产量优势越明显。

我国第一个大面积推广的油菜杂交种“秦油二号”,在陕西三年的区域试验，比对照增产20.3%-29.4%（傅廷栋等，1989）。

沈金雄等（2002）观察到甘蓝型油菜自交不亲和系F1代存在很强的杂种优势；2）杂交制种技术易于掌握，制种产量高而稳定。

油菜花期长（30天左右），花龄长（3-5天），花器外露，分枝性强，属无限花序，花期调整容易，非常有利于父母本花期相遇和传粉结实；3）繁殖系数高，种子成本低。

一般大田制种产量为600-750kg/hm2，可供200-500hm2大田用种，大田种子成本大约为45-120元/hm2。

因此推广杂交油菜具有投资少、效益好的优势，前景非常广阔（傅廷栋，1995）。

我国的油菜杂种优势利用研究始于20世纪60年代，197