基于衍生化反应和GCMS技术测省略鼠血液和尿液中内源性.docx
《基于衍生化反应和GCMS技术测省略鼠血液和尿液中内源性.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基于衍生化反应和GCMS技术测省略鼠血液和尿液中内源性.docx（8页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
基于衍生化反应和GCMS技术测省略鼠血液和尿液中内源性
中华中
医药学刊
2012年1月CHINESE
ARCHIVESOF
TRADITIONALCHINESE
MEDICINE
Jan．2012
基于衍生化反应和GC－MS技术测定大鼠血液和尿液中内源性代谢物轮廓谱
夏鑫华1，刘梅2，李欢
1
（1．广州医学院第一附属医院，广东广州510120；2．广州中医药大学中药学院，广东省广州510006）摘
要：
目的：
建立基于硅烷基衍生化反应的气相色谱－质谱联用技术（GC－MS）的代谢组学测定方法，初
步研究大鼠血液和尿液中内源性代谢物轮廓谱。
方法：
通过硅烷基化反应，将生物样品中的氨基酸、脂肪酸、有机
酸、糖类和固醇类物质制成热稳定性强、易挥发的硅烷酯或醚，通过优化色谱条件对大鼠血液和尿液中的内源性代谢物进行分析测定。
结果：
通过优化衍生化条件和色谱条件，建立了最佳的GC－MS测定方法，并进行了方法学考察。
获得了大鼠尿液和血液中的内源性代谢物轮廓谱，并鉴定了其中23个主要色谱共有峰。
结论：
优化的衍生化方法结合GC－MS技术可以从代谢水平对内源性代谢物进行分析，为后期的病理模型中内源性生物标志物的发现提供最佳的测定技术和方法。
关键词：
代谢指纹图谱；气相色谱－质谱联用（GC－MS）；血液；尿液
中图分类号：
R－332
文献标识码：
A
文章编号：
1673－7717（2012）01－0041－03
MetabolicFingerprintAnalysisofEndogenousMetabolites
FromBloodSerumandUrineofNormalRatsBasedonDerivationReaction
CombinedwithGasChromatography-MassSpectrometry
XIAXin-hua1，LIUMei2，LIHuan1
（1．TheFirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalCollege，Guangzhou510120，Guangdong，China；
2．SchoolofChineseMaterialMedicaofGuangzhouUniversityofChineseMedicine，Guangzhou510006，Guangdong，China）
Abstract：
Objective：
Ametabolomicmethodbasedonderivationreactioncombinedwithgaschromatography-massspectrometrywasestablishedtoinvestigatemetabolicfingerprintsoftheendogenousmetabolitesfromserumandurineofnormalrats．Method：
Aminoacids，fattyacids，organicacids，glucose，andsterolsweretransferredintoethersoresterswhichwereheatstableandevaporatedeasily．Then，thechromatographicconditionswereoptimizedtoanalyzetheendog-enousmetabolitesfromserumandurineoftherats．Results：
Theoptimummethodwasestablishedandvalidated．Themetabolicfingerprintsoftheendogenousmetaboliteswereobtainedbyusingthemethoddescribedabove．Twentythreechromatographicpeaksinthemetabolicfingerprintswereidentifiedbymassdataandstandardreferences．Conclusion：
ThemetabolicfingerprintsbasedonthederivationreactioncombinedwithGC－MScouldanalyzetheendogenousmetabo-litesatmetaboliclevel，whichcouldsupplythebestmethodandtoolforthebiomarkersofpathologicalanimalmodelinfurtherresearch．
Keywords：
Metabolicfingerprint；GC－MS；serum；urine
随着系统生物学的提出和迅速发展，代谢组学也成为
合在一起的代谢物变化，以生物体的体液或组织为研究对
了继基因组学、蛋白质组学之后，又一个是受到广泛关注的象，着重强调生物体的代谢物谱在疾病或环境刺激下的整新兴研究领域
［1］
。
代谢组学研究的是生物体各种细胞整体应激和变化
［2］
。
体内的代谢物会因机体的病理变化而
产生某种相应的变化，对正常机体的代谢产物进行测定并
收稿日期：
2011－08－17
基金项目：
国家自然科学基金资助项目（30901902）；广东省自然科
建立代谢物指纹轮廓谱；当疾病产生时，再测定相应的代谢学基金资助项目（9451018201003646）
物轮廓谱，通过疾病引起的代谢物轮廓谱变化的分析，能够作者简介：
夏鑫华（1976－），男，江西吉安人，
副教授，博士，研究方帮助更好地理解疾病的病变过程及机体内物质的代谢途向：
中医心脑血管疾病的代谢组学研究。
径，同时也有助于疾病的生物标志物的发现和达到辅助临通讯作者：
刘梅（1977－），女，陕西府谷人，
副教授，博士，研究方床诊断的目的。
向：
生药的活性成分、质量标准及体内代谢研究，E-mail：
近年来，基于质谱的技术开始广泛应用于生物体内代mayliu2004@163．com。
谢物的分析，主要优点是其得高灵敏度和专属性，并且在代
中
华中医药41学刊
CHINESE
中华中
OF
医药学刊
MEDICINE
Jan．2012
2012年1月ARCHIVESTRADITIONALCHINESE
谢产物的鉴定也具有一定的优势。
气相色谱－质谱（GC－MS）方法具有高性能的毛细管柱，再加上高灵敏度的质谱检测，被视为一种有用的代谢轮廓分析技术。
此外，气质联用仪器使用了电子轰击或化学电离作为接口个的联用技
并结合高质量的稳定的商业的质谱数据库，大大提高了术，
质谱的物质解析能力。
GC－MS不仅可以用来分析大多数
而且可以通过化学衍生化方法，分析许多的挥发性化合物，
半挥发性和非挥发性代谢物。
本文旨在利用GC－MS技术结合样品的衍生化反应，建立正常大鼠尿液和血液中内源性代谢物轮廓谱的方法，为后期的病理模型中内源性生物标志物的发现寻找最佳的测定技术和方法。
11．1
实验部分
主要仪器与试剂
Agilent6890N/5973N气相色谱－质谱联用仪，配有Agilent7683自动进样器，AgilentDB－5MS毛细管柱（0.25mm），Agilent色谱工作站和NIST2002质谱数据库。
N－甲基－三甲基硅烷基三氟乙酸胺甲氧胺盐酸盐、（MSTFA）、三甲基氯硅烷（TMCS）和吡啶均为色谱纯，购于阿拉丁试剂公司，其余试剂均为分析纯。
1．2动物和取样
SPF级SD大鼠10只，体重（200ʃ20）g，购于广东省实验动物中心。
动物每笼5只群养，饲养于SPF级动物房，室相对湿度保持为30%40%，喂内温度保持为（22ʃ2）ħ，常规饲料，自由进食饮水，在取样前将各组大鼠分别放入代每笼1只。
谢笼，
尿液样本的获取：
取SPF大鼠，于代谢笼中饲养3天，待其充分适应动物室环境后，收集24h空白尿液（其间禁食但自由饮水）。
样本置于－80ħ下保存。
血液样本的获取：
取SPF大鼠，于代谢笼中饲养3天，待其充分适应动物室环境后，眼眶取血，血液中加入1%肝
－1
然后离心10min（r·min），移取血浆置于素钠抗凝，
－80ħ下保存。
－5MS毛细管柱；不分流进样。
升温程序见表1。
质谱条
200ħ；检测质荷比范围30600；溶剂延件，离子源温度，5min；扫描速度：
20张图谱/s。
时，
2结果和讨论2．1
代谢物鉴定
使用NIST质谱数据库2002版对GC－MS分析的色谱
根据检测峰所代表的代谢物进行鉴定。
并结合标准对照，
到的代谢物EI质谱碎片和数据库中的标准物质的质谱信
息以及标准品的EI碎片信息进行比对。
共鉴定了氨基酸、有机酸、糖类和胆固醇等23个化合物。
标准品的GC－MS总离子流图及质谱峰化合物归属分别见图1和表2。
图123个标准品的GC－MS总离子流图
表2
序号1234567891011121314151617181920212223
23个标准品GC－MS峰归属表
保留时间5．176．587．718．6710．0310．7010．7811．2111．3111．6412．4312．7513．3113．7613．8814．1914．6615．2916．7417．4418．0618．5823．08
归属化合物乳酸缬氨酸丙氨酸草酸β－羟基丁酸
尿素磷酸苏氨酸甘氨酸丝氨酸苹果酸脯氨酸D－核糖柠檬酸半乳糖葡萄糖棕榈酸肌醇亚油酸油酸硬脂酸尿苷胆固醇
1．3
生物样品制备
取200μL冻后样本加入200μL乙睛沉淀蛋白，冰浴超
－1
声10min后，离心分离10min（10000r·min）。
取一定体
N2气吹干。
加15mg/mL甲氧胺吡积上清液置GC进样瓶，
70ħ下肟化1h后加衍生化试旋涡混匀30s，啶溶液50μL，
V/V）50μL，剂（MSTFAʒTMCS=100ʒ1，混匀，静置1h。
移供GC－MS分析。
取上清液到微量进样管，
表1GC/MS色谱柱温箱升温程序
中华中医药42学刊
1．4
时间（min）
0515253035
升温速度（ħ/min）
010525100
温度（ħ）
80150200250290290
2．22．2．1
方法学考察
精密度和重复性分别对同一制备好的尿液和血
计算主要共有峰的峰面积相对标准液样品连续进样6次，
偏差。
尿液样品中23个主要共有峰的峰面积相对标准偏
差范围在2．47%8．96%之间，全部共有峰的峰面积相对标准偏差小于10%。
血液样品中29个主要共有峰的峰面积相对标准偏差范围在1．38%6．78%之间，全部共有峰的峰面积相对标准偏差小于10%。
说明仪器精密度良好。
GC－MS条件
1μL；进样口温度，270ħ；载气，超纯氦进样量，
（99.9996%）；流量，1mL/min；接口温度：
260ħ；色谱柱DB
CHINESE
中华中
OF
医药学刊
MEDICINE
Jan．2012
2012年1月ARCHIVESTRADITIONALCHINESE
平行制备尿液样品和血液样品各6份，分别测定，计算主要共有峰的相对标准偏差，尿液样品的主要共有峰相对类、糖类和脂类等物质，这些物质在生物体内的含量与机体内氨基酸代谢、能量代谢和脂类代谢等代谢状况密切相关。
偏差在3．11%15．32%之间，血液样品的主要共有峰相疾病的发生会使体内的代谢体系发生异常，代谢物被扰动对偏差在2．14%13．36%之间。
说明该样品制备方法重后，能在代谢物轮廓谱中以色谱峰的个数的改变或峰面积复性良好。
的增加或减少而体现出来。
因此，对于生物体内代谢物网2．2．2样品稳定性
主要考察样品在冻融过程中的稳定
络的轮廓进行分析，对疾病的诊断、临床干预治疗和药物作性。
取尿液和血液样品按照1．3项下制备供试品各3份，
用机制的研究具有积极的意义。
经过一个冻融循环后，再取同样样品采用相同方法制备供
试品各3份。
尿液和血液供试品各6份，
GC－MS测定，并计算主要共有峰的峰面积相对标准偏差。
结果显示，主要
共有峰的峰面积相对标准偏差均小于15%，说明样品在一个冻融循环周期能保持稳定。
2．3衍生化条件的选择
生物体内的代谢物，如血液和尿液中的氨基酸、脂肪酸、胺类、糖类和甾体类物质，这些物质具有极性强、挥发性低的共同特征，
往往不适合进行GC－MS分析。
如果将这些物质进行适当的化学处理转化成相应的挥发性衍生物，图3正常大鼠尿液的GC－MS代谢轮廓分析的总离子流（TIC）图
不仅可以用GC－MS进行测定，而且生物样品中结构近似3结论
的化合物在质谱中更容易被区分。
因此，建立一种简单有效的生物样品中代谢物的衍生化方法可以使GC－MS技术本实验将衍生化技术与气相色谱－质谱联用技术结更好得到应用。
在气相色谱中，常用的衍生化反应有硅烷合，建立了测定大鼠血液和尿液中内源性代谢物指纹谱的
化反应、烷基化反应、酰基化反应、缩合反应等等。
综合考方法，并采用NIST数据库与标准品比对的方法鉴定了指纹虑到反应试剂的毒性、操作过程的难易和重复性等等因素，图谱中主要的23个共有色谱峰。
在血液和尿液中的主要本文采用硅烷化试剂对生物样品进行衍生化反应，其原理代谢产物为氨基酸类、脂肪酸类、有机酸类、胺类、糖类和固主要是通过硅烷基取代羟基、羧基、巯基、氨基及亚氨基等醇类物质，其与机体内氨基酸代谢、能量代谢和脂类代谢等集团上的活泼氢，
而产生热稳定性好、挥发性强的硅醚或硅代谢状况密切相关。
因此，优化的衍生化方法结合GC－MS技术可以从代谢水平对内源性代谢物进行分析，为后期酯，
可直接进行GC－MS分析。
经过参考文献与反复实验［3］
，确定了本文中生物样品制备的衍生化条件。
的病理模型中内源性生物标志物的发现提供最佳的测定技2．4GC－MS代谢物谱分析
术和方法。
参考文献
［1］NicholsonJK，ConnellyJ，LindonJC，etal．Metabolomics：
a
platformforstudyingdrugtoxicityandgenefunction［J］．NatRevDrugDiscov，2002，1
（2）：
153－161．
［2］陆益红，王广基，黄青，等．自发性高血压大鼠血浆代谢组学
研究及人参总皂苷作用机制初探［J］．中国天然药物，2007，11（6）：
443－447．
［3］周明眉，刘平，贾伟．基于代谢网络变化的中药整体效应评价
方法研究［J］．世界科学技术一中医药现代化，2006，8（6）：
113－119．
图2正常大鼠血浆的GC－MS代谢轮廓分析的总离子流（TIC）图
檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭
血浆和尿液GC－MS总离子流（TIC）图如图2和3所
示。
通过将半挥发或不挥发的代谢物衍生化的方法，GC－食用果糖过多增加患高血压风险
MS可以分析生物体液中各种性质的代谢物。
本实验检测美国研究人员最新研究显示，经常食用富含果糖的食
到尿液中93种代谢物和血浆中的86种共有代谢物（部分
品和饮料可能会增加罹患高血压的风险。
已鉴定代谢物见表2），
它们分别构成了大鼠尿液和血浆的此前的研究显示，目前美国人果糖的摄入量比20年前生物代谢物谱。
方法学实验表明，所选GC－MS分析方法增加了30%，这导致美国肥胖症患者日益增多。
但研究人具有较好稳定性和重现性（各共有峰RSD均小于15%，n员一直不清楚果糖摄入量与高血压是否存在联系。
=6）。
对已有的生物对照品进行线性考察，结果表明尿液美国丹佛大学的研究人员日前在美国肾脏学会年会上和血浆中的绝大多数代谢物在其所在的浓度范围内线性良报告说，他们选择了4528名没有高血压病史的成年人作为好（R2
＞0．99），但血浆中的乳酸、磷酸和葡萄糖，以及血浆研究对象，调查他们摄取果糖的情况。
经过对收集到的数中的尿素由于本身在体内含量丰富，
出现过载现象。
GC－据进行分析，研究人员发现，每天果糖摄入量超过74g（相MS分析生物体液的代谢物谱主要含有氨基酸类、有机酸
当于喝两杯半含糖饮料），会大大增加血压升高的风险。
中
华中医药43学刊
升级会员 