缓冲液配制.docx

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缓冲液配制

分子生物学常用试剂配置

2009-11-1810:

08

一、分子生物学常用贮存液的配制

1、30%丙烯酰胺溶液

【配制方法】将29g丙烯酰胺和1gN,N'-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水中。

加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml.用滤器（0.45μm孔径）过滤除菌，查证该溶液的pH值应不大于7.0,置棕色瓶中保存于室温。

【注意】丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收，其作用具累积性。

称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。

可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能会含有少量未聚合材料。

一些价格较低的丙烯酰胺和双丙烯酰胺通常含有一些金属离子，在丙烯酰胺贮存液中加入大约0.2体积的单床混合树脂（MB-1Mallinckrodt），搅拌过夜，然后用Whatman1号滤纸过滤以纯化之。

在贮存期间，丙烯酰胺和双丙烯酰胺会缓慢转化成丙烯酰和双丙烯酸。

2、40%丙烯酰胺

【配制方法】把380g丙烯酰胺（DNA测序级）和20gN,N'-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为600ml的蒸馏水中。

继续按上述配制30%丙烯酰胺溶液的方法处理，但加热溶解后应以蒸馏水补足至终体积为1L.

【注意】见上述配制30%丙烯酰胺的说明，40%丙烯酰胺溶液用于DNA序列测定。

3、放线菌素D溶液

【配制方法】把20mg放线菌素D溶解于4ml100%乙醇中，1:

10稀释贮存液，用100%乙醇作空白对照读取OD440值。

放线菌素D（分子量为1255）纯品在水溶液中的摩尔消化系数为21,900，故而1mg/ml的放线菌素D溶液在440nm处的吸光值为0.182,放线菌素D的贮存液应放在包有箔片的试管中，保存于-20℃。

【注意】放线菌素D是致畸剂和致癌剂，配制该溶液时必须戴手套并在通风橱内操作，而不能在开放在实验桌面上进行，谨防吸入药粉或让其接触到眼睛或皮肤。

药厂提供的作治疗用途的放线菌素D制品常含有糖或盐等添加剂。

只要通过测量贮存液在440nm波长处的光吸收确定放线菌素D的浓度，这类制品便可用于抑制自身引导作用。

4、0.1mol/L腺苷三磷酸（ATP）溶液

【配制方法】在0.8ml水中溶解60mgATP,用0.1mol/LNaOH调至pH值至7.0,用蒸馏水定容1ml,分装成小份保存于-70℃

5、10mol/L乙酸酰溶液

【配制方法】把770g乙酸酰溶解于800ml水中，加水定容至1L后过滤除菌。

6、10%过硫酸铵溶液

【配制方法】把1g过硫酸铵溶解于终量为10ml的水溶液中，该溶液可在4℃保存数周。

7、BCIP溶液

【配制方法】把0.5g的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二钠盐（BCIP）溶解于10ml100%的二甲基甲酰胺中，保存于4℃

8、2×BES缓冲盐溶液

【配制方法】用总体积90ml的蒸馏水溶解1.07g盐溶液BES[N,N-双（2-羟乙基）-2-氨基乙磺酸]、1.6gNaCl和0.027gNa2HPO4，室温下用HCl调节该溶液的pH值至6.96、然后加入蒸馏水定容至100ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成小份，保存于-20℃。

9、1mol/LCaCl2溶液

【配制方法】在200ml蒸馏水中溶解54gCaCl2·6H2O，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成10ml小份贮存于-20℃。

【注意】制备感受态细胞时，取出一小份解冻并用蒸馏水稀释至100ml,用Nalgene滤器（0.45μm孔径）过滤除菌，然后骤冷至0℃。

10、2.5mol/LCaCl2溶液

【配制方法】在20ml蒸馏水中溶解13.5gCaCl2·6H2O，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20℃。

11、1mol/L二硫苏糖醇（DTT）溶液

【配制方法】用20ml0.01mol/L乙酸钠溶液（pH5.2）溶解3.09gDTT,过滤除菌后分装成1ml小份贮存于-20℃。

【注意】DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处理。

12、脱氧核苷三磷酸（dNTP）溶液

【配制方法】把每一种dNTP溶解于水至浓度各为100mmol/L左右，用微量移液器吸取0.05mol/lTris碱分别调节每一dNTP溶液的pH值7.0（用pH试纸检测），把中和后的每种dNTP溶液各取一份作适当稀释，在下表中给出的波长下读取光密度计算出每种dNTP的实际浓度，然后用水稀释成终浓度为50mmol/L的dNTP,分装成小份贮存于-70℃。

碱基

波长（nm）

消化系数（ε）[L/（mol·cm）]

A

259

1.54×104

G

253

1.37×104

C

271

9.10×103

T

260

7.40×103

比色杯光径为1cm时，吸光度=εM。

13、0.5mol/lEDTA（pH8.0）溶液

【配制方法】在800ml水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na·2H2O），在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节溶液的pH值至8.0（约需20gNaOH颗粒）然后定容至1L，分装后高压灭菌备用。

【注意】EDTA二钠盐需加入NaOH将溶液的pH值调至接近8.0，才能完全溶解。

14、溴化乙锭（10mg/ml溶液）

【配制方法】在100ml水中加入1g溴化乙锭，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，然后用铝箔包裹容器或转移至棕色瓶中，保存于室温。

【注意】小心：

溴化乙锭是强诱变剂并有中度毒性，使用含有这种染料的溶液时务必戴上手套，称量染料时要戴面罩。

15、2×HEPES缓冲盐溶液

【配制方法】用总量为90ml的蒸馏水溶解1.6gNaCl、0.074gKCl、0.027gNa2PO4·2H2O、0.2g葡聚糖和1gHEPES，用0.5mol/lNaOH调节pH值至7.05，再用蒸馏水定容至100ml。

用0.22μm滤器过滤除菌，分装成5ml小份，贮存于-20℃。

16、IPTG溶液

【配制方法】IPTG为异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（分子量为238.3），在8ml蒸馏水中溶解2gIPTG后，用蒸馏水定容至10ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20℃。

17、1mol/L乙酸镁溶液

【配制方法】在800ml水中溶解214.46g四水乙酸镁，用水定容至1L过滤除菌。

18、1mol/LMgCl2溶液

【配制方法】在800ml水中溶解203.4gMgCl2·6H2O，用水定容至1L，分装成小份并高压灭菌备用。

【注意】MgCl2极易潮解，应选购小瓶（如100g）试剂，启用新瓶后勿长期存放。

19、β-巯基乙醇（BME）溶液

【配制方法】一般得到的是14.4mol/L溶液，应装在棕色瓶中保存于4℃。

【注意】BME或含有BME的溶液不能高压处理。

20、NBT溶液

【配制方法】把0.5g氯化氮蓝四唑溶解于10ml70%的二甲基甲酰胺中，保存于4℃。

21、酚/氯仿溶液

【配制方法】把酚和氯仿等体积混合后用0.1mol/LTris·HCl（pH7.6）抽提几次以平衡这混合物，置棕色玻璃瓶中，上面覆盖等体积的0.01mol/lTris·HCl（pH=7.6）液层，保存于4℃。

【注意】酚腐蚀性很强，并可引起严重灼伤，操作时应戴手套及防护镜，穿防护服。

所有操作均应在化学通风橱中进行。

与酚接触过的部位皮肤应用大量的水清洗，并用肥皂和水洗涤，忌用乙醇。

22、10mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）溶液

【配制方法】用异丙醇溶解PMSF成1.74mg/ml（10mmol/L），分装成小份贮存于-20℃。

如有必要可配成浓度高达17.4mg/ml的贮存液（100mmol/L）。

【注意】PMSF严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。

一旦眼睛或皮肤接触了PMSF,应立即用大量水冲洗之。

凡被PMSF污染的衣物应予丢弃。

PMSF在水溶液中不稳定。

应在使用前从贮存液中现用现加于裂解缓冲液中。

PMSF在水溶液中的活性丧失速率随pH值的升高而加快，且25℃的失活速率高于4℃。

pH值为8.0时，20μmmol/lPMSF水溶液的半寿期大约为85min,这表明将PMSF溶液调节为碱性（pH>8.6）并在室温放置数小时后，可安全地予以丢弃。

23、磷酸盐缓冲溶液（PBS）溶液

【配制方法】在800ml蒸馏水中溶解8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4,用HCl调节溶液的pH值至7.4加水定容至1L,在15lbf/in2（1034×105Pa）高压下蒸气灭菌20min.保存于室温。

24、1mol/L乙酸钾（pH=7.5）溶液

【配制方法】将9.82g乙酸钾溶解于90ml纯水中，用2mol/L乙酸调节pH值至7.5后加入纯水定容到1L,保存于-20℃。

25、乙酸钾溶液（用于碱裂解）

【配制方法】在60ml5mol/L乙酸钾溶液中加入11.5ml冰乙酸和28.5ml水，即成钾浓度为3mol/L而乙酸根浓度为5mol/L的溶液。

26、3mol/L乙酸钠（pH5.2和pH7.0）溶液

【配制方法】在80ml水中溶解408.1g三水乙酸钠，用冰乙酸调节pH值至5.2或用稀乙酸调节pH值至7.0,加水定容到1L,分装后高压灭菌。

27、5mol/LNaCl溶液

【配制方法】在800ml水中溶解292.2gNaCl加水定容至1L,分装后高压灭菌。

28、10%十二烷基硫酸钠（SDS）溶液

【配制方法】在900ml水中溶解100g电泳级SDS，加热至68℃助溶，加入几滴浓盐酸调节溶液的pH值至7.2，加水定容至1L，分装备用。

【注意】SDS的微细晶粒易扩散，因此称量时要戴面罩，称量完毕后要清除残留在称量工作区和天平上的SDS,10%SDS溶液无须灭菌。

29、20×SSC溶液

【配制方法】在800ml水中溶解175.3gNaCl和88.2g柠檬酸钠，加入数滴10mol/lNaOH溶液调节pH值至7.0，加水定容至1L，分装后高压灭菌。

30、20×SSPE溶液

【配制方法】在800ml水中溶解17.5gNaCl、27.6gNaH2PO4·H2O和7.4gEDTA,用NaOH溶液调节pH值至7.4（约需6.5ml10ml/LNaOH），加水定容至1L，分装后高压灭菌。

31、100%三氯乙酸溶液

【配制方法】在装有500gTCA的瓶中加入227ml水，形成的溶液含有100%（M/V）TCA.

32、1mol/LTris溶液

【配制方法】在800ml水中溶解121.91gTris碱，加入浓HCl调节pH值至所需值。

pHHCl    

7.470ml         

7.660ml            

8.042ml

应使溶液冷至室温后方可最后调定pH值，加水定容至1L,分装后高压灭菌。

【注意】如1mol/L溶液呈现黄色，应予丢弃并置备质量更好的Tris.

尽管多种类型的电极均不能准确测量Tris溶液的pH值，但仍可向大多数厂商购得合适的电极。

Tris溶液的pH值因温度而异，温度每升高1℃，pH值大约降低0.03个单位。

例如：

0.05mol/L的溶液在5℃、25℃、和37℃时的pH值分别为9.5、8.9和8.6.

33、Tris缓冲盐溶液（TBS）（25mmol/lTris）

【配制方法】在800ml蒸馏水中溶解8gNaCl、0.2gKCl和3gTris碱，加入0.015g酚并用HCl调至pH值至7.4,用蒸馏水定容至1L,分装后在151bf/in2（1.034×105Pa）高压下蒸汽灭菌20min,于室温保存。

34、X-gal溶液

【配制方法】X-gal为5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷。

用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成的20mg/ml的贮存液。

保存于一玻璃管或聚丙烯管中，装有X-gal溶液的试管须用铝箔封裹以防因受光照而被破坏，并应贮存于-20℃。

X-gal溶液无须过滤除菌。

二、常用抗生素溶液

抗生素

贮存液a

工作浓度

浓度

保存条件

严紧型质粒

松弛型质粒

氨苄青霉素

50mg/ml（溶于水）

-20℃

20μg/ml

60μg/ml

>羧苄青霉素

50mg/ml（溶于水）

-20℃

20μg/ml

60μg/ml

>氯霉素

34mg/ml（溶于乙醇）

-20℃

25μg/ml

170μg/ml

卡那霉素

10mg/ml（溶于水）

-20℃

10μg/ml

50μg/ml

链霉素

10mg/ml（溶于水）

-20℃

10μg/ml

50μg/ml

四环素b

5mg/ml（溶于乙醇）

-20℃

10μg/ml

50μg/ml

a:

以乙醇为溶剂的抗生素溶液无须除菌处理。

所有抗生素溶液均应放于不透光的容器保存。

b:

镁离子是四环素的拮抗剂，四环素抗性菌的筛选应使用不含镁盐的培养基（如LB培养基）。

三、常用的电泳缓冲液

缓冲液

使用液

浓贮存液（每升）

Tris-乙酸（TAE）

1×：

0.04mol/LTris-乙酸

50×：

242gTris碱

0.001mol/LEDTA

57.1ml冰乙酸

100ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）

Tris-磷酸（TPE）

1×:

0.09mol/LTris-磷酸

10×:

10gTris碱

0.002mol/LEDTA

15.5ml85%磷酸（1.679g/ml）

40ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）

Tris-硼酸（TBE）a

0.5×0.045mol/LTris-硼酸

5×：

54gTris碱

0.001mol/LEDTA

27.5硼酸

20ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）

碱性缓冲液b

1×:

50mmol/LNaOH

1×:

5ml10mol/LNaOH

1mmol/LEDTA

2ml0.5mmol/LEDTA（pH8.0）

Tris-甘氨酸c

1×:

25mmol/LTris

5×:

15.1gTris

250mmol/L甘氨酸

94g苷氨酸（电泳级）（pH8.3）

0.1%SDS

50ml10%SDS（电泳级）

常见缓冲液配制方法

2009-11-1809:

01

1.乙醇－醋酸铵缓冲液（pH3.7）取5mol/L醋酸溶液15.0ml，加乙醇60ml和水20ml,用10mol/L氢氧化铵溶液调节pH值至3.7，用水稀释至1000ml，即得。

2.三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH8.0）取三羟甲基氨基甲烷12.14g,加水800ml,搅拌溶解，并稀释至1000ml,用6mol/L盐酸溶液调节pH值至8.0,即得。

3.三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH8.1）取氯化钙0.294g,加0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液40ml使溶解，用1mol/L盐酸溶液调节pH值至8.1，加水稀释至100ml，即得。

4.三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH9.0）取三羟甲基氨基甲烷6.06g,加盐酸赖氨酸3.65g、氯化钠5.8g、乙二胺四醋酸二钠0.37g，再加水溶解使成1000ml，调节pH值至9.0，即得。

5.乌洛托品缓冲液取乌洛托品75g，加水溶解后，加浓氨溶液4.2ml，再用水稀释至250ml,即得。

6.巴比妥缓冲液（pH7.4）　取巴比妥钠4.42g,加水使溶解并稀释至400ml，用2mol/L盐酸溶液调节pH值至7.4，滤过，即得。

7.巴比妥缓冲液（pH8.6）　取巴比妥5.52g与巴比妥钠30.9g,加水使溶解成2000ml，即得。

8.巴比妥－氯化钠缓冲液（pH7.8）　取巴比妥钠5.05g,加氯化钠3.7g及水适量使溶解,另取明胶0.5g加水适量，加热溶解后并入上述溶液中。

然后用

0.2mol/L盐酸溶液调节pH值至7.8，再用水稀释至500ml，即得。

9.甲酸钠缓冲液（pH3.3）取2mol/L甲酸溶液25ml，加酚酞指示液1滴，用2mol/L氢氧化钠溶液中和，再加入2mol/L甲酸溶液75ml,用水稀释至200ml,调节pH值至3.25～3.30,即得。

10.邻苯二甲酸盐缓冲液（pH5.6）取邻苯二甲酸氢钾10g，加水900ml,搅拌使溶解，用氢氧化钠试液（必要时用稀盐酸）调节pH值至5.6,加水稀释至1000ml，混匀，即得。

11.枸橼酸盐缓冲液取枸橼酸4.2g,加1mol/L的20％乙醇制氢氧化钠溶液40ml使溶解,再用20％乙醇稀释至100ml，即得。

12.枸橼酸盐缓冲液（pH6.2）取2.1％枸橼酸水溶液，用50％氢氧化钠溶液调节pH值至6.2，即得。

13.枸橼酸－磷酸氢二钠缓冲液（pH4.0）甲液：

取枸橼酸21g或无水枸橼酸19.2g,加水使溶解成1000ml，置冰箱内保存。

乙液：

取磷酸氢二钠71.63g，加水使溶解成1000ml。

取上述甲液61.45ml与乙液38.55ml混合，摇匀，即得。

14.氨－氯化铵缓冲液（pH8.0）取氯化铵1.07g，加水使溶解成100ml，再加稀氨溶液（1→30）调节pH值至8.0，即得。

15.氨－氯化铵缓冲液（pH10.0）取氯化铵5.4g，加水20ml溶解后，加浓氯溶液35ml，再加水稀释至100ml，即得。

16.硼砂－氯化钙缓冲液（pH8.0）取硼砂0.572g与氯化钙2.94g，加水约800ml溶解后,用1mol/L盐酸溶液约2.5ml调节pH值至8.0，加水稀释至1000ml，即得。

17.硼砂－碳酸钠缓冲液（pH10.8～11.2）取无水碳酸钠5.30g,加水使溶解成1000ml；另取硼砂1.91g，加水使溶解成100ml。

临用前取碳酸钠溶液973ml与硼砂溶液27ml，混匀，即得。

18.醋酸盐缓冲液（pH3.5）取醋酸铵25g，加水25ml溶解后，加7mol/L盐酸溶液38ml，用2mol/L盐酸溶液或5mol/L氨溶液准确调节pH值至3.5（电位法指示）,用水稀释至100ml,即得。

19.醋酸－锂盐缓冲液（pH3.0）取冰醋酸50ml，加水800ml混合后，用氢氧化锂调节pH值至3.0，再加水稀释至1000ml，即得。

20.醋酸－醋酸钠缓冲液（pH3.6）取醋酸钠5.1g,加冰醋酸20ml，再加水稀释至250ml,即得。

21.醋酸－醋酸钠缓冲液（pH3.7）　取无水醋酸钠20g,加水300ml溶解后，加溴酚蓝指示液1ml及冰醋酸60～80ml，至溶液从蓝色转变为纯绿色，再加水稀释至1000ml，即得。

22.醋酸－醋酸钠缓冲液（pH3.8）　取2mol/L醋酸钠溶液13ml与2mol/L醋酸溶液87ml,加每1ml含铜1mg的硫酸铜溶液0.5ml,再加水稀释至1000ml，即得。

23.醋酸－醋酸钠缓冲液（pH4.5）取醋酸钠18g,加冰醋酸9.8ml,再加水稀释至1000ml,即得。

24.醋酸－醋酸钠缓冲液（pH4.6）取醋酸钠5.4g,加水50ml使溶解，用冰醋酸调节pH值至4.6，再加水稀释至100ml，即得。

  25.醋酸－醋酸钠缓冲液（pH6.0）取醋酸钠54.6g，加1mol/L醋酸溶液20ml溶解后，加水稀释至500ml，即得。

26.醋酸－醋酸钾缓冲液（pH4.3）取醋酸钾14g，加冰醋酸20.5ml，再加水稀释至1000ml，即得。

27.醋酸－醋酸铵缓冲液（pH4.5）取醋酸铵7.7g，加水50ml溶解后，加冰醋酸6ml与适量的水使成100ml，即得。

28.醋酸－醋酸铵缓冲液（pH6.0）取醋酸铵100g，加水300ml使溶解，加冰醋酸7ml,摇匀，即得。

29.磷酸－三乙胺缓冲液取磷酸约4ml与三乙胺约7ml，加50％甲醇稀释至1000ml，用磷酸调节pH值至3.2，即得。

30磷酸盐缓冲液取磷酸二氢钠38.0g，与磷酸氢二钠5.04g,加水使成1000ml,即得。

　31　磷酸盐缓冲液（pH2.0）甲液:

取磷酸16.6ml，加水至1000ml，摇匀。

乙液：

取磷酸氢二钠71.63g，加水使溶解成1000ml。

取上述甲液72.5ml与乙液27.5ml混合，摇匀，即得。

　32　磷酸盐缓冲液（pH2.5）取磷酸二氢钾100g，加水800ml，用盐酸调节pH至2.5,用水稀释至1000ml。

　33磷酸盐缓冲液（pH5.0）取0.2mol/L磷酸二氢钠溶液一定量,用氢氧化钠试液调节pH值至5.0，即得。

　　34磷酸盐缓冲液（pH5.8）取磷酸二氢钾8.34g与磷酸氢二钾0.87g,加水使溶解成1000ml，即得。

　　35磷酸盐缓冲液（pH6.5）取磷酸二氢钾0.68g,加0.1mol/L氢氧化钠溶液15.2ml，用水稀释至100ml，即得。

　　36磷酸盐缓冲液（pH6.6）取磷酸二氢钠1.74g、磷酸氢二钠2.7g与氯化钠1.7g，加水使溶解成400ml，即得。

　　37磷酸盐缓冲液（含胰酶）（pH6.8）取磷酸二氢钾6.8g,加水500ml使溶解,用0.1mol/L

　　38氢氧化钠溶液调节pH值至6.8；另取胰酶10g，加水适量使溶解，将两液混合后,加水稀释至1000ml，即得。

　　39磷酸盐缓冲液（pH6.8）取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml，加0.2mol/L氢氧化钠溶液118ml，用水稀释至1000ml，摇匀，即得。

　　40磷酸盐缓冲液（pH7.0）取磷酸二氢钾0.68g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液29.1ml，用水稀释至100ml，即得。

　　41磷酸盐缓冲液（pH7.2）取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液50ml与0.2mol/L氢氧化钠溶液35ml，加新沸过的冷水稀释至200ml，摇匀，即得。

42磷酸盐缓冲液（pH7.3）取磷酸氢二钠1.9734g与磷酸二氢钾0.2245g,加水使溶解成1000ml，调节pH值至7.3，即得。

　43　磷酸盐缓冲液（pH7.4）取磷酸二氢钾1.36g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液79ml，用水稀释至200ml，即得。

　44　磷酸盐缓冲液（pH7.6）取磷酸二氢钾27.22g，加水使溶解成1000ml，取50ml，加0.2mol/L氢氧化钠溶液42.4ml，再加水稀释至200ml，即得。

　45磷酸盐缓冲液（pH7.8）甲液：

取磷酸氢二钠35.9g，加水溶解，并稀释至500ml。

　乙液：

取磷酸二氢钠2.76g，加水溶解，并稀释至100ml。

取上述甲液91.5ml与乙液8.5ml混合，摇匀，即得。

46　磷酸盐缓冲液（pH7.8～8.0）取磷酸氢二钾5.59g与磷酸二氢钾0.41g，加水使溶解成1000ml，即得。