1微生物及无菌知识培训.docx
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1微生物及无菌知识培训
1微生物及无菌知识培训
一.前言
我们所生活的环境中,到处都存在着大量的微生物。
在一样空气中,微生物达800~3500个/m3,在土壤中达1~500×108个/g,在严峻污染的水中可达107个/ml。
(饮用水要求细菌总数≤100个/ml,大肠杆菌≤3个/ml。
经水塔或贮水池贮存后,短期内可繁育至105~106个/ml。
)人的头皮上有140万个/cm2,两手上约有4~40万个,1g指甲污垢有38亿个,1g粪便可达10~1000亿个。
能够讲微生物是无处不在,无处不有。
许多往常被人们认为是极端(高温、高压、强酸、强碱、低温等)甚至是致死的环境,现在已发觉生活着各种类型的微生物(称为极端微生物)。
事实讲明,微生物有专门坚强的生存、繁育和变异能力来适应环境。
微生物种类繁多,有的对人有益,有的有害,有的无益也无害。
但在药品生产过程中,不可能对环境中的各种微生物加以区不对待,为保证药品的安全有效,需要对其进行操纵。
空气中的微生物多数附着在灰尘上,或以芽孢形式悬浮于空气中,1μm以下者处于悬浮状态,10μm以上者会逐步沉下来而形成菌尘。
因此也要对尘粒进行操纵。
大量临床资料表明,注射剂(专门是静脉注射剂)如污染了7~12μm的尘粒,可导致热原反应、肺动脉炎、微血栓或异物肉芽肿等,严峻的还会致人死命。
而如果污染了细菌,轻则局部红肿化脓,重则引起全身细菌性感染。
因此,对微生物和尘粒进行更加严格的操纵关于针剂生产洁净室专门重要。
人是洁净室最大的污染源,占90%左右。
一样男性每人每分钟向周围排放1000个以上的含菌粒子,女性为750个以上。
穿无菌服时,静止时的发菌量为10~300个/min,一样活动时发菌量为150~1000个/min,行走时发菌量为900~2500个/min。
咳嗽一次发菌量为70~700个/min,喷嚏一次为4000~60000个/min。
因此在洁净室中,人的数量和活动应有专门严格的限制。
二.微生物简介
微生物是广泛存在于自然界的一群体形微小(直径小于1mm)、结构简单、肉眼看不见,必须藉助光学或电子显微镜放大数百至数万倍才能观看到的生物。
需要讲明的是,微生物是一个比较笼统的概念,界线有时专门模糊。
如单细胞藻类和一些原生动物也应确实是微生物,但通常它们并不放在微生物中进行研究。
微生物具有以下特点:
①体积小,面积大;②吸取多,转化快(2000倍体重/h);③生长旺,繁育快(20min分裂一次);④易变异,适应强;⑤分布广,种类多(10万种以上)。
微生物按其结构、化学组成及生活习性等差异可分成三大类:
1.真核细胞型 细胞核的分化程度较高,有核膜、核仁和染色体;胞质内有完整的细胞器(如内质网、核糖体及线粒体等)。
真菌属于此类型微生物。
2.原核细胞型 细胞核分化程度低,仅有原始核质,没有核膜与核仁;细胞器不专门完善。
这类微生物种类众多,有细菌、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体和放线菌。
3.非细胞型 没有典型的细胞结构,亦无产生能量的酶系统,只能在活细胞内生长繁育。
体积微小,能通过除菌滤器。
病毒属于此类型微生物。
微生物在自然界中的分布极为广泛,空气、土壤、江河、湖泊、海洋等都有数量不等、种类不一的微生物存在。
在人类、动物和植物的体表及其与外界相通的腔道中也有多种微生物存在。
绝大多数微生物对人类和动、植物的生存是有益而必需的。
自然界中氮、碳、硫等多种元素循环靠微生物的代谢活动来进行。
例如空气中的大量氮气只有依靠微生物的作用才能被植物吸取,土壤中的微生物能将动、植物蛋白质转化为无机含氮化合物,以供植物生长的需要,而植物又为人类和动物所利用。
因此,没有微生物,植物就不能新陈代谢,而人类和动物也将无法生存。
另一方面,由极少数微生物引起的传染病发病快、死亡率高、传播迅速、传播范畴广,严峻危害着人民健康。
三.微生物的形状结构
1.细菌(原核单细胞生物)
细菌按形状可分为:
球菌(0.5~2μm)、杆菌(长1~5μm,宽0.3~1μm)和螺形菌(大小与杆菌相似)。
按革兰氏染色法染色的不同,分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
革兰氏阳性菌的细胞壁表面含较多的磷壁酸,会产生外毒素,如金黄色葡萄球菌;革兰氏阴性菌的细胞壁表面多含脂蛋白和脂多糖,会产生内毒素(即热原),如大肠杆菌。
细菌一样有细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核,有的还有荚膜、鞭毛、菌毛和芽胞等专门结构。
细菌一样为无性繁育,以二分法繁育,几十分钟或1~2小时分裂一次。
资料:
关于芽孢
在温度逐步降低或营养缺乏时,芽胞杆菌属(如炭疽杆菌)及梭状芽胞杆菌属(如破伤风杆菌)能在菌体内形成一个折光性专门强的不易着色小体,称为芽胞。
芽胞是处于休眠状态的细菌,并非细菌的繁育体,当环境适宜时,可复原生长繁育。
芽胞在自然界分布广泛,要注意防止污染。
芽胞的抗击力强,对热力、干燥、辐射、化学消毒剂等理化因素均有强大的抗击力,用一样的方法不易将其杀死。
有的芽胞可耐100℃沸水煮沸数小时。
杀灭芽胞最可靠的方法是高压蒸汽灭菌。
当进行消毒灭菌时往往以芽胞是否被杀死作为判定灭菌成效的指标。
2.霉菌(丝状真菌的通称,真核多细胞生物)
霉菌是真菌的一部分。
在培养基上长成绒毛状或棉絮状的菌丝体的真菌统称为霉菌。
霉菌细胞呈狭长的管状,称为菌丝。
菌丝直径比细菌、放线菌大,约2~10μm。
菌丝分枝连接,交错集合在一起的总体称为菌丝体。
霉菌大多数是多细胞微生物,菌丝细胞由细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核和各种细胞器组成。
细胞壁专门薄,往往在表面产生色素,使菌落显现各种颜色。
霉菌靠孢子繁育,有无性繁育和有性繁育两种方式,以无性繁育为主。
有些真菌可用酿酒造酱,或用于发酵生产柠檬酸、葡萄糖酸、酶、抗生素(如青霉素、头孢菌素);少数真菌能引起各种真菌病。
真菌产生的真菌毒素(如黄曲霉素)有毒。
3.酵母菌(真核单细胞生物,属真菌)
酵母菌以单细胞存在,呈圆形、卵圆形和香肠形,比细菌大,细胞长5~30μm,宽1~5μm。
细胞结构有细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核和各种细胞器等。
酵母菌的增殖分无性繁育和有性繁育两个时期,有三种方式:
芽殖、裂殖、孢子生殖。
酵母菌是重要的工业微生物,用于酿酒,生产单细胞蛋白、B族维生素、核酸、辅酶A、细胞色素C等。
一样对人体无害。
4.放线菌(原核单细胞生物)
放线菌有生长发育良好的菌丝体,呈分枝状,菌丝宽为0.2~1.2μm,革兰氏阳性。
其内部构造与细菌相似,无完整的细胞核。
菌落常呈幅射状,因此称放线菌。
繁育方式为无性孢子繁育。
最适pH6.7~7.5,温度25~30℃。
放线菌可用于生产抗生素、维生素和酶类,少数可引起人畜放线菌病。
5.病毒
病毒是一类体积十分微小,结构简单,只含一种核酸(DNA或RNA),没有产生能量的酶系统,只能在活细胞内以复制方式增殖的非细胞型微生物。
病毒在自然界分布专门广泛,在所有其它生物中都有病毒寄居。
病毒是最常见的致病微生物,人类传染病中大约75%是由病毒引起的。
病毒体要紧由核酸和蛋白质组成。
病毒体积微小,最大直径300nm(如牛痘病毒),最小直径20nm(如口蹄疫病毒),绝大多数在150nm以下,能通过细菌滤器,用一般光学显微镜看不见,必须用电子显微镜放大数千至数万倍才能看见。
形状多呈球形,少数为杆状或砖形。
噬菌体(细菌病毒)有呈蝌蚪状的。
朊病毒于1982年发觉,它专门专门,与一样病毒不同,是一种专门蛋白质,不含有核酸。
与疯牛病(牛海绵状脑病)及人克雅氏病关系紧密。
其复制方式不明。
四.微生物的营养
1.水分:
水占细胞浆的70%~90%,是细胞的重要组成成分。
较普遍的观点认为:
只有在含水的环境中微生物才能存活。
但也有人发觉在无水碳氢化合物中微生物可长期存活。
2.碳源:
碳源是构成细胞的重要物质。
有些微生物的碳源必须来自有机碳化合物如糖、蛋白质、脂肪、有机酸等(同时利用其化学能),属异养型;有些微生物不需有机碳化合物,以CO2为碳源,属自养型(分为光能自养型和化能自养型)。
3.氮源:
氮是组成蛋白质和核酸的重要元素。
4.无机盐类:
细菌所需无机盐包括磷、硫、镁、铁、钾、钠、钙、氯、锰、锌、钴、铜等。
其中磷、硫、镁、钾、钠、铁需要量较多,其他只需微量。
5.生长因子:
生长因子是某些微生物生长发育所必需,而其自身又不能合成的一类营养物质。
包括维生素、嘌呤和嘧啶等。
五.微生物生长的阻碍因素
1.营养物
2.pH值:
各种微生物都有其最适宜的pH值,大多数细菌最适pH为6.8~7.4,但一样有较大的容忍度,在4~9也可存活和生长,少数细菌能在极端pH值范畴内生长。
真菌适于pH值3~6的微酸性环境,但在2~10也可生长。
3.温度:
微生物适于生长繁育要有适宜的温度,当超过其最低或最高可耐受的温度时,即停止生长或死亡。
一样细菌最适温度为30~40℃,真菌为20~30℃。
4.氧气:
大多数细菌和所有霉菌差不多上需氧菌(在有氧环境中才能生长),少数细菌是厌氧菌(在无氧环境中才能生长),有些细菌和酵母菌是兼性需氧厌氧的,在有氧或无氧环境中都能生长繁育。
5.渗透压:
微生物细胞膜和所有生物膜一样是一种半透膜,可让水自由通过,对溶质则有选择性。
由于细胞壁的爱护,微生物能存活在低渗透压的水中。
而在高渗溶液(如高浓度的盐溶液或糖溶液、40%甘油)中,细胞会脱水并停止生长繁育。
但也有一些专性耐高盐细菌只有在高盐(10~15%)条件下才生长。
6.表面张力:
表面活性剂可降低表面张力,它是阻碍细菌生长的因素之一。
专门多革兰氏阴性菌,专门是大肠菌群可专门好地在表面活性剂包围的介质中生长,而大多数革兰氏阳性菌在表面张力低时(0.05N/m)不能专门好生长。
阳离子表面活性剂对专门多有机体有毒性,阴离子表面活性剂毒性专门小,非离子表面活性剂几乎没有毒性,并可成为某些微生物的营养物。
六.消毒与灭菌
消毒与灭菌是微生物实验技术中最差不多的操作,从事药品生产和检验的人员都应当了解消毒与灭菌的方法及其意义,严格遵守操作规程,否则会阻碍产品质量,危害患者安全。
1.概念
无菌——不存在活的生物(GMP指南)。
“无菌”从定义上来讲是一个绝对的概念,但遗憾的是,在科学和技术高度进展的今天,药品的绝对无菌即做不到,也无法加以证实。
然而,无菌制剂的安全性要求人们设定无菌的相对标准。
FDA、欧洲制药工业界曾将百万分之一微生物污染率作为灭菌产品“无菌”的相对标准,它和蒸汽灭菌后产品中微生物存活的概率为10-6(即产品的无菌保证值为6),系同一标准的不同表示法。
这一标准于1980起收录于USPXX中,现在已为世界各国普遍同意和采纳。
灭菌——使达到无菌状态的方法(GMP指南)。
用物理或化学方法杀灭传播媒介上所有的微生物,使其达到无菌(GB)。
通常是指杀灭或除去全部活的微生物(包括繁育体和芽孢)。
消毒——用物理或化学方法杀灭或清除传播媒介上的病原微生物,使其达到无害化(GB)。
通常是指杀死病原微生物的繁育体,但不能破坏其芽孢。
因此消毒是不完全的,不能代替灭菌。
无菌制剂——不存在活的微生物的制剂(GMP指南)。
非无菌制剂——所含活的微生物量符合卫生学标准的制剂(GMP指南)。
2.常用消毒剂
消毒剂
常 用 量
用 途
乙醇
①70%~75%水溶液
②0.5%洗必泰溶于70%乙醇,再加入2%甘油
用于皮肤、器具等消毒
供洗手用消毒
异丙醇
75%水溶液
用于皮肤、器具等消毒
甲醛
37%~40%甲醛液8~9ml,再加入4~5g高锰酸钾
每m3熏蒸量,密闭12~24h。
刺激性强
戊二醛
2%水溶液
用于空气、器具等消毒。
广谱、高效、低毒,可杀芽孢和病毒。
刺激性较轻。
新洁尔灭(苯扎溴铵)
0.1%水溶液
用于皮肤、粘膜、器具等消毒,有清洁和消毒双重功效。
抗菌谱较窄。
杜灭芬(消毒宁)
0.05%~0.1%水溶液
用于皮肤、器具等消毒
过氧乙酸
①0.2%~0.5%水溶液
②新配0.5%水溶液
③1g/m3
用于器具等消毒 抗菌谱广,可
用于皮肤消毒 杀灭某些病毒
熏蒸 但性质不稳固
乳酸
①0.33~1mol/L
②1~1.5ml/m3熏蒸或与等量苯酚合用熏蒸
喷雾,用于空气消毒,有强杀菌作用
熏蒸,密闭12h以上
麝香草酚
5%麝香草酚溶于50%乙醇
喷洒墙面、地面,杀霉菌
3.常用灭菌法
1)干热灭菌法 常见的有火焰、烧灼、干烤和红外线灭菌等。
①火焰、烧灼:
通常用于实验室无菌操作中金属或其它耐火材料制成的器具的灭菌。
②干烤和红外线:
利用干热空气或热辐射进行灭菌。
一样135~145℃需3~5h,160~170℃需2h以上,170~180℃需1h以上,180~200℃需0.5~1h。
除热原则需250℃30min,或200℃45min,180℃2h。
空气传热慢,穿透力不强,故干热灭菌时刻长。
干热灭菌时烤箱内装入物品应留有间隙,以利空气流淌,否则使箱内温度不均,部分物品灭菌不完全。
2)湿热灭菌法 通过热蒸汽或沸水使蛋白质变性而杀灭微生物的方法。
湿热穿透力强,灭菌成效较干热好。
①煮沸或流通蒸汽灭菌:
常压下沸水和蒸汽的温度是100℃,一样处理30~60min可杀死细菌繁育体,但不能完全杀灭芽孢。
此法适用于不能高压蒸汽灭菌的物品。
②低温间隙灭菌(巴斯德灭菌法):
将物品先用60~80℃加热(或煮沸)1h,然后置20~25℃储存24h(或常温过夜),使其中残存的芽孢萌发成繁育体,再用以上条件灭菌,如此反复三次。
本法适用于不耐高温或高温下易变质的物品,但专门费时。
③高压蒸汽灭菌(热压灭菌法):
超过一个大气压时,水的沸点高于100℃,反之亦然。
高压蒸汽灭菌确实是通过加压提升蒸汽温度,灭菌成效最好。
它简便、经济、可靠、无毒,是最可靠、应用最广泛的灭菌法。
此法适用于耐高温顺潮湿的物品。
常用条件为:
115.5℃30min
121.5℃20min
126.5℃15min
注意事项:
a.必须完全排出灭菌器内的空气。
否则会阻碍灭菌器内温度达到规定的要求。
b.注意被灭菌物品的温度。
灭菌器内温度与被灭菌物品的温度一样是一致的,但在蒸汽输入过快时,后者可能低于前者,因此升温时要有一定的预热时刻。
另外,降温过快易引起玻璃炸裂。
因此,关于一种灭菌产品,应制定一固定的灭菌曲线(象冻干曲线一样)。
c.定期检查灭菌器内温度的准确性。
3)化学灭菌法 利用化学试剂形成的气体来杀灭微生物的方法。
常用的灭菌剂为环氧乙烷(又称氧化乙烯)。
环氧乙烷是广谱杀菌剂,能杀灭细菌、芽孢和多种病毒,还能杀死昆虫及虫卵。
但由于环氧乙烷易燃易爆且有毒(有致变异性),用于药品方面极有限,多用于医疗器械、塑料制品等灭菌。
(不能用于橡胶和乳胶手套,能将其溶解。
)
4)滤过除菌法 利用细菌不能通过致密具孔滤材的原理,除去对热不稳固的药品溶液或液体物质中的细菌的方法。
过滤法一样只能除菌,不能除去支原体和病毒。
过滤除菌的成效与滤膜的性能、孔径的大小、密度、滤膜的厚度等因素有关。
滤过除菌法要求最终过滤的滤膜孔径为0.22μm。
由于各厂家生产的相同规格的滤膜质量并不一致,为了保证除菌成效,在使用前后应检查滤器的完好性(如压力坚持试验或起泡点试验)。
一个过滤器的使用时刻应按照品种验证后确定,一样不应超过8小时。
5)辐射灭菌法 辐射有两种类型:
一种是电磁波辐射,如紫外线、红外线、微波;一种是电离辐射,如可引起被照耀物电离的X射线、γ射线。
①紫外线:
紫外光波长在136~390nm之间,其中260nm左右能破坏核酸,杀菌作用最强。
另外,空气中的氧受紫外线照耀后,可微量转变为臭氧共同起杀菌作用。
紫外线消毒的成效与光源的功率、光源与被照耀物的距离、照耀时刻、温度和湿度等因素有关。
我国规定紫外灯照耀强度在距离1m处不低于70μW/cm2(以紫外线测强仪测定)。
在操作面上要求强度达40μW/cm2以上。
一样每10m2装30W灯管1支,工作前开30~60min。
紫外灯的输出功率随使用时刻增加而降低。
国产紫外灯的平均寿命(点到70%额定功率的时刻)一样为2000h,超过平均寿命时,就达不到预期成效,必须更换。
紫外线的穿透力专门弱,不能穿透一样包装材料,如玻璃、塑料薄膜、纸等。
玻璃能强烈吸取小于350nm的紫外线,石英玻璃能吸取小于200nm的紫外线。
因此,它要紧用于空气和物体表面消毒,特制的紫外灯装置也可用于水的消毒。
紫外线对眼、皮肤有损坏,照耀过程中产生的臭氧对眼、鼻腔有刺激,臭氧过多时使人头晕、胸闷、血压下降。
②红外线:
通过加热碳化硅板产生的辐射热能,由空气传导加热灭菌。
如红外线烤箱,温度可达180℃左右。
热效应特点是由表及里。
③微波:
微波灭菌要紧是因其热效应。
微波加热升温快,温度高且平均,杀菌作用强。
热效应特点是由里及表。
不同性质的物品吸取微波的能力不同,其热效应和消毒成效也不同。
微波有一定穿透力,但不强。
微波对人体有害,要注意防护。
④60Co灭菌:
放射性同位素60Co(或137Cs)衰变时可放射出γ射线,γ射线的能量高、穿透力强,可使细胞内各种活性物质发生化学变化,从而使细菌损害或死亡。
经60Co辐射灭菌的物品温度升高专门少,一样仅约5℃,故又称“冷灭菌”。
60Co辐射存在两个方面的安全咨询题:
一是辐射的直截了当作用。
γ射线对人体细胞同样有害;二是通过辐射的食品、药品的安全性。
1984年美国农业部食品安全实验室用辐射处理的鸡肉喂饲小鼠,发觉患睾丸肿瘤增加,包括加重癌病损害。
因此60Co辐射用于食品和药品都应通过安全试验,进行科学的、全面的评判,高剂量的辐射药品更应慎重。
美国药典(?
版)规定25kGy为有效灭菌剂量。
1997年我国卫生部颁发了60Co中药灭菌标准,该标准限国内流通中药可用60Co辐照灭菌,规定了承诺辐照的药材和中成药的品种和剂量。
散剂3kGy
片剂3kGy
丸剂5kGy
中药原料粉6kGy
附录:
1.药品生产洁净室(区)的空气洁净度等级(GMP1998)
洁净度级不
尘粒最大承诺数(个/m3)
微生物最大承诺数
0.5μm
5μm
浮游菌(个/m3)
沉降菌(个/皿)
100级
3,500
0
5
1
10,000级
350,000
2,000
100
3
100,000级
3,500,000
20,000
500
10
300,000级
10,500,000
60,000
-
15
注:
①我国GMP1998附录规定:
“洁净室(区)在静态条件下检测的尘埃粒子数、浮游菌数或沉降菌必须符合规定,应定期监控动态条件下的洁净状况。
”因此,洁净室(区)空气洁净度的测定要求为静态测试,动态监控。
对尘粒和微生物中的两项测定指标,至少各测一项。
②空气洁净度为100级的洁净室,室内大于等于5μm尘粒的计数,应进行多次采样,当某一测试值多次显现时,该值方可认可。
③测试按《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》。
饮用水
某些辅料#
二部片剂
二部胶囊剂%
XX霜*
细菌总数
100/ml
1000/g
1000/g
1000/g
100/g
霉菌、酵母菌数
100/g
100/g
100/g
10/g
大肠杆菌
3/100ml
-
-
-
NC
沙门氏菌
NC
NC
NC
NC
铜绿假单胞菌
NC
NC
NC
-
金黄色葡萄球菌
NC
NC
NC
-
注:
#:
包括有乳糖、药用炭、淀粉、葡萄糖、糊精。
%:
XX胶囊属中药制剂,含胎盘粉,按中国药典2000版一部规定,还不得检出沙门菌。
*:
XX霜属中药制剂,用于创伤、烧伤,故要求细菌总数≤100个/g、霉菌数≤10个/g。
讲明:
-:
表示每1g或每1ml不得检出。
NC:
表示无规定。
可不检查。