东师实验2不同大豆品种质量分析.docx
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东师实验2不同大豆品种质量分析
综合研究性实验二：
不同大豆品种质量分析
一.实验目的
决定大豆质量的主要指标是蛋白质和油脂含量。
东北师范大学生命科学学院苗以农教授从事大豆育种的科学研究工作四十余年。
本实验以苗以农教授提供的几种大豆育种材料为研究对象并完成以下学习目标：
1.学习凯氏定氮测定蛋白质含量的原理和操作技术；
2.学习标准溶液配置与标定的原理与操作；
3.规范分析化学的基本操作技能（电子天平、容量瓶、移液管等仪器的使用方法）；
4.学习利用索氏提取器及减重法测定大豆粗脂肪的含量；
5.掌握误差与分析数据处理的相关知识；
6.学习有机溶剂的回收的方法（简易蒸馏装置、旋转薄膜蒸发仪、真空泵的使用）；
7.6molHCl将蛋白质水解为氨基酸以及氨基酸衍生物的前处理方法；
8.了解利用高压液相色谱法HPLC测定大豆氨基酸组成的原理和方法。
二.大豆粗脂肪的提取和定量分析
[一]实验原理
1.用有机溶剂和索氏提取器可以循环抽提样品中的脂溶性物质的混合物。
2.由于大豆中含有脂肪、游离脂肪酸、固醇、芳香油、某些色素及有机酸等，因此称为粗脂肪。
3.本实验就是利用有机溶剂石油醚和索氏提取器循环抽提大豆中的粗脂肪。
[二]实验器材和试剂
1.实验试剂与原料
（1）大豆粉
（2）石油醚
2.用品与仪器
（1）索氏提取器
（2）电子天平
（3）烧杯
（4）烘箱
（5）干燥器
（6）恒温水浴
（7）脱脂滤纸
（8）脱脂棉
（9）镊子
[三]样品处理
样品处理步骤
1.粉 碎
在研钵中研碎大豆样品，研磨后钵体用脱脂棉擦挣，并放入提取漏斗，研钵用少量乙醚洗净，装入提取管。
2.烘干与称重
将大豆样品在110℃烘箱内烘干至恒重，冷却后称取5-6g样品，记下样品质量m0。
将大豆样品放入脱脂滤纸做成的提取漏斗中，放在盛有CaCl2真空干燥器中干燥。
称量大豆样品和滤纸的质量和m1。
[四]提取
（一）索氏提取器的安装
将洗净的提取瓶在105℃的烘箱内烘干至恒重，加入用CaCl2干燥的石油醚至抽提瓶容积的1/2，将大豆样品包置于抽提管内，然后依照下图连接实验装置。
（二）提取过程
提取过程
加热恒温水浴，使石油醚蒸发。
石油醚蒸汽由连接管上升至冷凝器，凝结成液体，滴入提取管中，样品内的脂肪被石油醚所抽提。
石油醚液面高于虹吸管高度后，溶有脂肪的石油醚经虹吸管流入提取瓶。
循环抽提，调节水浴温度，控制石油醚从冷凝器滴入滤纸筒内的速度为150dpm，使石油醚循环10-20tpm。
从提取管内吸取少量石油醚滴在干净的滤纸上，石油醚蒸干后，滤纸上不留有油脂的斑点，说明抽提已经完毕。
抽提完毕后，冷却，使提取器倾斜，石油醚流回提取瓶中。
取出滤纸包，干燥至恒重，称其质量m2。
（三）利用旋转薄膜蒸发仪回收石油醚
[四]数据计算
称量名称
数值
所称大豆样品质量m0
抽提前大豆样品和滤纸的质量m1
抽提后大豆样品和滤纸的质量m2
计算结果（粗脂肪%）
参考数值
[五]注意事项
1.将滤纸筒放入索氏提取器的提取管内时，不能高于虹吸部分。
2.提取管磨口连接部分不能涂凡士林，但不能漏气。
3.加热抽提时，应在电热恒温水浴中进行，不能使用火焰加热的水浴锅。
三.凯氏定氮法测定蛋白质的含量
[一]实验原理
实验室常用凯氏定氮法测定天然有机物（如蛋白质、核酸、氨基酸）的含氮量。
1.标定
（1）NaOH固体中含有Na2CO3杂质，而且容易吸湿；盐酸易挥发，准确浓度不确定，因此NaOH与盐酸均不能直接配成准确浓度的溶液，而必须先配成一个近似浓度的溶液，再用标准溶液来标定。
（2）由于KHC8H4O4（邻苯二甲酸氢钾，物质的量为204.22）稳定，又可以与NaOH反应，可用于标定NaOH的摩尔浓度，进而标定盐酸的摩尔浓度。
2.消化
含氮有机物与浓硫酸共热时，其中的碳和氢两种元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转化成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵，此过程称为消化。
由于反应比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点，并加入硫酸铜或过氧化氢作为催化剂。
例如：
甘氨酸的消化过程如下：
CH2NH2COOH+3H2SO4→2CO2↑+3SO2↑+4H2O+NH3↑
2NH3+H2SO4→（NH4）2SO4
3.蒸馏
浓碱可以使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定量、浓度硼酸溶液中，硼酸吸收氨后溶液中的氢离子浓度降低。
（NH4）2SO4+2NaOH=Na2SO4+2H2O+2NH3↑
H3BO3（粉红色）+3NH3=（NH4）3BO3（鲜绿色）
4.滴定及计算
（1）用标准盐酸滴定，恢复溶液中原来氢离子浓度。
（2）根据所用标准盐酸的摩尔数计算出待测液的总氮量。
3HCl+（NH4）3BO3=3NH4Cl+H3BO3（颜色变回粉红色）
[二]实验器材和试剂
1.实验试剂与原料
（1）混合指示剂储备液
取50mL，0.1%甲烯蓝乙醇溶液与200mL，0.1%甲基红乙醇溶液混合配成，贮于棕色瓶中，备用。
本指示剂在pH=5.2时为紫红色；在pH=5.4时为暗蓝色（或灰色）；在pH=5.6时为绿色，变色点pI=5.4，所以指示剂的变色范围很窄，灵敏。
（2）硼酸指示剂混合液
取100mL，2%硼酸溶液，滴加混合指示剂储备液（大约1mL），摇匀后，溶液呈紫红色即可。
（3）浓硫酸
（4）40NaOH溶液
（5）0.0100mol/L左右标准HCl溶液
（6）粉末K2SO4、CuSO4混合物（K2SO4：
CuSO4·5H2O=5:
1）
（7）标准硫酸铵溶液（0.3mg氮/mL）
2.仪器与用品
（1）100mL凯氏烧瓶
（2）改进凯氏定氮仪
（3）50mL容量瓶
（4）5mL微量滴定管
（5）电子天平
（6）烘箱
（7）电炉
（8）远红外消煮炉
（9）移液管
（10）酒精灯
[三]样品处理
大豆样品中的含氮量是用100g大豆中含氮的g数来表示（%）。
因此在定氮前，应将大豆样品中的水分除掉。
一般样品烘干温度为105℃。
样品处理步骤
称取一定质量的大豆粉（约0.1000g左右），记下大豆粉的质量m0
在称量瓶中装一定量磨细大豆粉样品，置于105℃烘箱中烘干4h
用坩埚钳将称量瓶放入干燥器内，降至室温后称重
按上述操作继续烘干样品
每干燥1h后，称重，直到2次称重数值不变
[四]消化
消化步骤
取2个100mL凯氏烧瓶，标号
1号加样品（约0.1000g），催化剂（K2SO4-CuSO4·5H2O）约200mg，浓硫酸5mL
2号加0.1mL蒸馏水，催化剂（K2SO4-CuSO4·5H2O）约200mg，浓硫酸5mL*
每个瓶口放一个漏斗，在通风橱内的电炉上消化**
消化完毕，烧瓶中溶物冷却后，加蒸馏水10mL
冷却后将瓶中溶物倾入50mL容量瓶中，用水稀释到刻线
*作为对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。
**将消化管放入60℃水浴中缓慢分解约24h，至消化液呈褐色，滴加2滴过氧化氢，继续在通风橱内的电炉上消化2h，直至透明淡绿色为止。
[五]蒸馏
（一）改良式凯氏蒸馏仪的洗涤
1.反应室；2.蒸汽发生室；3.加样口（小漏斗）并夹子；4.冷凝器；5.冷凝水入口；
6.冷凝水出口；7.夹子；8.夹子（废液排除口）；9.锥形瓶；10.出样口；11.煤气灯
1.取5个5OmL的锥形瓶，各加5mL2%硼酸指示剂混合液，应呈紫红色，用表面皿覆盖备用。
2.打开夹子7，使冷水流入蒸气发生器内球体2/3量后关闭夹子7。
将煤气灯放到蒸气发生器2下面加热，此时夹子3和8处于关闭状态蒸气通过反应室1到冷凝器4外腔，凝成水滴洒落于盛混合液的三角瓶9中。
如此用蒸气洗涤反应室约10min后，移去三角瓶，放上另一个盛混合液的三角瓶，将瓶倾斜，以保证冷凝管末端连接的小玻璃管完全浸于液体内。
继续蒸馏2min。
观察三角瓶内溶液是否变色，如不变成鲜绿色，而是变成灰色或暗色，则表明反应室内部己干净。
移动三角瓶使混合液离开管口约1cm，继续通气1min，最后用水冲洗管外口，移开煤气灯，准备下一步把消化液加入反应室内。
（二）消化样品及空白的蒸馏
打开夹子8，放掉蒸气发生器中的热水，然后关闭夹子8，打开夹子7，使冷水流人蒸气发生器内球体2/3量后关闭夹子7。
这一步操作对加样时避免样品经出样口10抽出反应室是很关键的。
打开夹子3，取2mL稀释消化液自加样口3加大反应室1，关闭夹子3。
另取l个盛混合液的三角瓶斜接于冷凝管下端。
取40%NaOH溶液约10mL，放人加样口的小漏斗中，微开夹子3，使NaOH溶液馒慢流人反应室，当未完全流尽时，关闭夹子3，向小漏斗加入约5mL蒸馏水，再微开夹子3，使一半蒸馏水流人反应室，关闭夹子3，一半蒸馏水留在小漏斗中作水封。
将煤气灯放回蒸气发生器下面，继续加热蒸馏，三角瓶中溶液由紫红色变成鲜绿色，自变色起开始记时，蒸馏5min，然后移动三角瓶使液面离开冷凝管口约1cm，并用少量蒸馏水洗涤冷凝管口外周，继续蒸馏1min。
用表面皿覆盖三角瓶，待其余样品蒸馏完毕后，一同滴定。
（三）蒸馏后蒸馏仪的洗涤
样品蒸馏完毕后，挪开锥形瓶及煤气灯，随即自加样口较快地倒人一些冷蒸馏水，反应室外的空气骤然冷缩，反应室内的废液迅速地从出样口10抽出，打开夹子8，排出蒸气发生器内的废液，关闭夹子8。
再自加样口加入一些冷蒸馏水，打开夹子3，冷水再流人反应室，关闭夹子3，打开夹子7，使冷水尽量多地流人蒸气发生器内，但不要超过出样口10，关闭夹子7，打开夹子8，使冷水排出。
此时，由于蒸气发生器内的空气压力降低较多，反应室中冷水又自动抽出。
如此反复几次，即可排尽反应废液及洗涤废液。
[六]滴定
全部蒸馏完毕后，用已经标定（约0.0100mol/L）的标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，直至硼酸指示剂混合液由绿色变回粉红色，即为滴定终点。
分别记下标定含有大豆粉消化液用去盐酸的体积Vx和标定空白样所用去的盐酸体积V0。
[六]计算
（一）计算方法
式中:
Vx为滴定样品用去的盐酸平均毫升数，V0为滴定空白用去的盐酸平均毫升数，m0为称量样品的质量，C为盐酸的摩尔浓度，14为氮的原子量（lmLO.01mol/L盐酸相当于0.14mg氮），6.25为系数，25为样品的稀释倍数。
（二）实验数据与结果计算
No.
m0（g）
C（mol/L）
Vx（mL）
Vxa（mL）
V0（mL）
Pr（%）
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
参考数值
三.氨基酸高效液相色谱分析
[一]实验原理
首先对大豆样品进行酸水解制备氨基酸,方法是对氨基酸进行衍生化反应，使用高效液相色谱分离所得的衍生物然后以紫外/可见或荧光检测器作定量分析。
本方法适用于一级、二级氨基酸的定量分析。
[二]大豆样品酸水解液的制备
取标准精磨大豆粉20mg,加到2mL的安瓶中,再加入2mL6mol/L的盐酸溶液,封口后放置于110℃烤箱中，进行封管酸水解。
24h后打破安瓶，将酸水解液转移到蒸发皿中，于沸水浴上蒸干时可加少量蒸馏水，再次蒸发，重复3-4次。
[三]衍生化反应
OPA-邻苯二甲醛在常温下可迅速（约30s）同一级氨基酸发生定量反应生成有较强荧光和紫外吸收的异吲哚衍生物。
该反应不能用于脯氨酸的分析。
氯甲酸戊甲酯（FMOC-CL）可与脯氨酸反应生成的衍生物可用于紫外吸收与荧光检测。
OPA和FMOC-CL联用的衍生化法不受水和盐类的干扰，重现性好。
[四]高压液相色谱分析
高压液相色谱分析（HPLC）是生命科学中最有效的分析分离技术，它是在经典柱色谱和气相色谱的基础上发展起来的仪器化液柱色谱。
流动相在高压输液泵的驱动下，在色谱柱中与高分离效能的固定相作相对运动，由于样品中不同组分在流动相和固定相之间的分配系数不同，因此，这些组分在两相间反复多次地进行平衡分配，造成差速迁移而彼此分离。
组分依次随流动相流出色谱柱进入检测器，在检测器中利用组分的物理性质（如光学性质）或化学性质（如氧化还原性质）而被定量出检测。
由记录仪将组分的保留特性及相对含量以洗脱曲线的形式记录下来，其出峰时间和峰面积作为各组分定性定量的依据。
高压液相色谱分析分离速度快，分辨率高，分离效果好，重现性好和不破坏样品。
[五]仪器
1.HP-1050高效液相色谱仪
2.配溶剂输送系统
3.自动进样器
4.恒温柱室
5.200×2.1nm5μHypcrsilDos微径分析柱
若以HP-1050M二级管阵列检测器，波长330nm可做为一级氨基酸衍生物的辨别和检测。
而波长为266nm则为二级氨基酸的辨别与检测。
HP=1046A可编程荧光检测器使能发挥无比的效用，以230nm激发波长及455nm放射波长来检验一级氨基酸，260nm激发波长及315nm放射波长可为二级氨基酸的检测。
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