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婴幼儿配方奶粉中强化维生素B12的检测技术

本科毕业设计说明书（论文）

（xxx届）

题目：

婴幼儿配方奶粉中强化维生素B12的检测技术

研究

学生姓名

学号

指导教师

专业班级应用化学专业

所在学院化学工程学院

提交日期xxx年xx月

婴幼儿配方奶粉中强化维生素B12的检测技术研究

摘要

本实验采用免疫亲和柱/超高效液相色谱（UPLC）与免疫亲和柱/超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）测定婴幼儿配方奶粉中维生素B12的含量。

样品用0.05mol/L的醋酸钠除蛋白，采用免疫亲和柱对样品进行净化，滤液通过WatersAcquityUPLCBEHC18　（2.1mm×100mm×1.7μm）色谱柱分离，进样体积5μL，柱温35℃，流速0.2mL/min，UPLC的流动相为0.03mol/L磷酸二氢钾溶液（用磷酸调至pH3.5）-乙腈（85:

15）等度洗脱。

UPLC-MS/MS的流动相为0.1%的甲酸水和甲醇梯度洗脱，采用电喷雾离子源（ESI）正离子扫描模式，多反应监测（MRM），定量离子（m/z）为678.3/147。

维生素B12在10μg/L-500μg/L范围内有良好的线性，相关系数R达到0.999，检出限为0.5ng/g，定量限为1.5ng/g。

UPLC法测定维生素B12的相对标准偏差为0.2-3.0%，加标回收率在92.0-93.1%（n=3），UPLC-MS/MS法测定维生素B12的相对标准偏差为3.4-8.7%，加标回收率在85.0-110.3%（n=3）。

本方法分析速度快，灵敏度高，重复性好，适用于婴幼儿奶粉中低含量维生素B12的检测。

关键词：

维生素B12，免疫亲和柱，婴幼儿配方奶粉，超高效液相色谱，超高效液相色谱-质谱

StudyONTHEDETECTIONofvitaminB12ininfantformulamilkpowder

ABSTRACT

ThemethodforthedeterminationofvitaminB12ininfantformulamilkpowderwasestablishedbyimmunoaffinitycolumn/ultraperf-　ormanceliquidchromatography（UPLC）andimmunoaffinitycolumn//ultraperformanceliquidchromatography-massspectrometry（UPLC　-MS/MS）.Afterbeingtreatedby0.05mol/Lsodiumacetatetoprecipitatethemilkprotein,thesamplewaspurifiedbyimmunoaffinitycolumn,thefiltratewasseparatedbyWatersAcquityUPLCBEHC18（2.1mm×100mm×1.7μm）column,theinjectionvolumewas5μLataflow-rateof0.2mL/minandthecolumntemperaturewas35oC.ThemobilephaseofUPLCconsistedof0.03mol/Lpotassiumdihydrogenphosphate（pH3.5）andacetonitrile（85:

15）withisocraticelution,themobilephaseofUPLC-MS/MSconsistedof0.1%formicacidwaterandmethanolgradientelution.Thesamplewasanalyzedbyusingmultiplereactionmonitoring（MRM）mode,electrosprayionization（ESI）sourceandselecting（m/z）678.3/147asquantitativeproduction.Thecalibrationcurvewaslinearintherangeof10-500μg/L,withacorrelationcoefficientof0.999.Thedetectionlimitofmethodwas0.5ng/gandthequantificationlimitwas1.5ng/g.TherelativestandarddeviationofthedeterminationofvitaminB12byUPLCwas0.2-3.0%,therecoveryratewasbetween92.0%-93.1%（n=3）,therelativestandarddeviationofthedeterminationofvitaminB12byUPLC-MS/MSwas3.4-8.7%,therecoveryratewasbetween85.0%-110.3%（n=3）.Duetoitsshortoperationtime,highsensitivityandgoodreproducible,theproposedmethodcanbeusedtodeterminevitaminB12ininfantformulamilkpowder.

Keywords:

vitaminB12,immunoaffinitycolumn,infantformulamilkpowder,ultrahighperformanceliquidchromatography,ultrahighperformanceliquidchromatography-massspectrometry

第一章绪论

1.1维生素B12的概述及功能

维生素B12又称抗恶性贫血维生素，是一种由含钴的卟啉类化合物组成的B族维生素。

维生素B12是经过20年的研究，在1948年才从肝脏中分离出来，它是一种具有控制恶性贫血效果的红色晶体物质，是B族维生素中发现最晚的一种。

维生素B12在pH值4.5-5.0弱酸条件下能够稳定存在，易溶于乙醇和水，强酸（pH<2）或碱性溶液中容易分解，遇到热结构会受到一定程度的破坏，但在短时间内的高温消毒影响不大，遇紫外线或强光容易被破坏。

维生素B12广泛存在于肾脏、鱼类、动物肝脏、蛋、牛肉、牛奶等。

人体对维生素B12的需求量很少，每天3μg就能满足人体的需求，是所有必需维生素中最少的。

维生素B12有两个重要的生理功能：

①维生素B12可促进蛋白质的生物合成，作为甲基转移酶的辅因子，参与胸腺嘧啶和蛋氨酸等的合成，因此，缺乏时会对婴幼儿的生长发育有影响。

②保护叶酸在细胞内的贮存和转移，维生素B12缺乏时则会影响到叶酸的利用受，导致人体周围神经炎。

儿童缺少维生素B12的初期表现是表情呆板、情绪异常、反应迟钝，最终致使贫血。

根据国家标准中的规定，维生素B12在婴幼儿配方奶粉中最低含量为8.0μg/kg［1］。

1.2维生素B12检测技术研究意义

维生素B12是生成红血球不可缺少的重要元素。

其中，氰钴胺素是最常见的维生素B12合成物质，作为营养素添加于婴幼儿乳粉和功能性饮料等食品和保健品。

国家规定标签对于维生素B12等营养成分有明确表示，美国FDA要求标签的标注量不得低于食品中强化维生素的量。

来自美国丹佛的科罗拉多大学和纽约的哥伦比亚大学的专家对若干名缺乏维生素B12的人进行了跟踪考察，发现这些人中有将近一半的人出现了不同程度的精神性症状和神经损伤。

其中症状有痴呆、记忆障碍、抑郁、平衡功能失调等，严重的还有精神分裂症的表现。

当研究者给这些人补充维生素B12后，大部分患者的精神性症状完全消失。

儿童缺乏维生素B12的首发症状一般是神经系统改变而血液系统改变不典型。

但人体对维生素B12的需求量是所有B族维生素中最少的，摄取过量的维生素B12会产生毒副作用。

根据相关报导，维生素B12摄取过量可出现哮喘、湿疹、脸部浮肿等过敏性反应，也有可能会出现神经兴奋和心悸的症状。

同时还会导致叶酸的缺乏。

因此，研究新的更精确，更敏感的维生素B12检测方法显得尤为重要。

这对早期诊断治疗有着关键作用，特别是对婴幼儿健康。

1.3国内外对维生素B12的检测方法

维生素B12的检测至今仍是国际上食品分析的难题之一。

首先是动物食品中的维生素B12有多种结构形式，如氰基钴胺素、羟钴胺素、甲基钴胺素、腺苷钴胺素等，传统的检测分析方法很难准确测定其实际含量；其次是维生素B12在食品中的含量很低，牛肝为迄今检测最高含量为60μg/100g，通常维生素B12在食品中的含量在0.4-3μg/100g；再者，样品中其他水溶性维生素由于其色谱行为与维生素B12相近，会对它的分离、检测造成很大干扰。

根据国内外相关资料，目前现检测维生素B12主要有5种方法：

微生物法[2-3]、固相萃取一二维液相色谱法、高效液相色谱法[4]、高效液相色谱串联质谱法[5]及荧光光度法。

1.3.1微生物法

微生物分析法测定维生素B12的研究工作在国际上已经有几十年的历史了，是较为原始也是最早的方法，在美国发展的尤其迅速，但是我国这方面的报导还不是很多。

到目前为止，美国药典（USP）、公职分析化学家协会（AOAC）和中国国家标准GB/T5413.14-2010都将微生物法作为作为检测维生索B12的仲裁和主要方法。

微生物法是食品国家安全标准（GB/T5413.14-2010）对婴幼儿乳品和食品中维生素B12的测定方法，检测限为0.1μg/100g，适合维生素B12含量低样品的测定。

微生物法定量检测出样品中维生素B12含量的基本原理是，使用莱士曼氏乳酸杆菌对维生素B12的灵敏性和特异性，在检测用的培养基中加入除维生素B12之外的全部营养成分，微生物生长所产生的透光率就会同未知待测液和标准工作液中维生素B12含量相对应了。

以系列标准溶液浓度的透光率为横坐标，相对应各标准物质的浓度为纵坐标绘制标准工作曲线，根据标准曲线就可测定试样中维生素B12的含量。

微生物做为一种活试剂，具有灵敏度高［6］和特异性强而使测定结果更加准确。

由于这些特点而使得微生物分析法在研究领域始终倍受青睐，这是仪器分析无法与之比拟的。

微生物分析法不需要特殊的技巧和设备，具备微生物室常规仪器即可。

但由于微生物法操作复杂，很多因素会影响测定结果，且对检验人员和实验室的要求较高，所以微生物法没有在企业中推广。

有被仪器分析方法替代的趋势。

近年来，有研究者采用采用德国IFP维生素B12式剂盒对婴幼儿配方奶粉中维生素B12进行测定。

由于该方法降低了菌种在保存和传代中发生突变和污染的可能性。

与国家标准方法相比具有前处理简单，实验操作步骤简单，实验过程时间短，可以提高微生物方法测定维生素B12的稳定性和准确性。

1.3.2固相萃取一二维液相色谱法

多维分离的概念是Giddings在1984年提出的，多维分离技术随着色谱方法的改进、完善及微加工技术的发展得到了较快的发展,并已在诸多领域得到应用，如环境科学、生命科学等。

全二维液相色谱在天然药物中提取有效成分研究，石油的分离等方面已有明显的优势，是最先商品化的多维分离技术。

高的分辩率及快速自动化等是多维液相色谱的优点，与其他色谱分离技术相比，具有更开阔的应用前景,在复杂样品研究中有着重要的作用。

样品在两种分离模式之间的转换是多维液相色谱实现的关键技术，接口与控制技术是难点。

目前，已经开发出多种柱切换模式。

二维液相色谱的原理是将两根色谱柱串联起来构成的分离系统，而这两根色谱柱的分离机理是不同而且又相互独立。

样品通过第一维的色谱柱后，经浓缩、捕集或切割后被切换到第二维色谱柱和检测器，从而达到分离和检测的目的。

二维液相色谱在分离样品时常选用两种不同的分离机理。

第一，利用样品的不同特性把复杂混合物样分成单一组分，其中这些属性有亲水性、等电点、分子大小、特殊的分子间的亲和等，在一维分离系统中不能完全分离的组分，可以在二维系统中得到更好的分离。

这样分辨率、分离能力就得到了很大的提高。

二维液相色谱大多使用两根或多根色谱柱，样品在柱间切换，达到分离目的是通过柱结合技术实现的。

柱切换又可分为部分和整体两种切换模式。

二维分离又可分为离线和在线两种方式。

早期先在容器中收集一维洗脱产物，再进样到第二维中，这就是离线模式。

而随着现代仪器的发展,目前二维色谱大多采用在线方式，使一维洗脱产物直接进入到第二维柱系统中进行分离分析。

储小军等[7]利用固相萃取一二维液相色谱法测定婴幼儿奶粉中的维生素B12。

结果表明，维生素B12在2-40ng/mL浓度范围内有良好的线性关系，其线性系数大于0.999，检出限为1.0μg/kg，定量下限为2.5μg/kg，加标回收率在88.0%-94.8%。

通过2次净化和浓缩样品实验，灵敏度大大提高，且该方法定量准确、实验成本小、重现性好，为婴幼儿配方食品中维生素B12的测定提供了较为灵敏、实用的方法。

固相萃取一二维液相色谱方法相对于使用免疫亲和柱净化样品，其大大降低实验成本，同时也避免了被测物浓缩倍数受SPE载荷条件的限制。

二维液相色谱在聚合物分析、环境分析的应用越来越多，特别是在生命科学，如蛋白质组学的研究。

对于蛋白质的分离，如果分离模式采用一维电泳或液相色谱是达不到理想的分离效果。

而选用二维聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，利用蛋白质等电点和分子尺寸的差异进行正交分离，不仅分辨率高,且重现性也好。

同时易与质谱链接，具有自动化程度高、分析速度快、高灵敏度和等优点。

1.3.3超高效液相色谱-质谱联用法

高效液相色谱质谱联用技术始于20世纪70年代。

该检测方法的技术难点是在于接口。

在研究接口方面前后已经研究了20多种，有直接导入界面，离子束界面等，但都有不同方面的缺陷和限制。

直到大气压电离技术（API）发展成熟，HPLC-MS才能快速发展。

液相色谱-质谱联用技术是当代最重要的分析方法之一，由于该方法可以完成分离，定性和定量的工作，所以在维生素的检测中发挥着重要作用。

质谱法[7]是利用离子化技术，将不同构型的维生素B12经过离子化分别电离成相应的离子，然后再根据质荷比的不同而达到构型分离的一种高灵敏的检测分析方法。

超高效液相色谱-质谱联用仪主要是由超高效液相色谱仪，接口装置（HPLC与MS的连接装置），质谱仪组成。

混合样品通过液相色谱的进样系统，经过色谱柱分离，再经过接口进入质谱仪的离子源并被离子化，离子被聚焦在质量分析系统中，不同的质荷比从小到大依次被检测器接收，然后离子信号转变成电信号，根据数据系统处理就可以得到所有M/Z离子的质谱图。

Luo等[8]曾经用HPLC-ESI-MS方法对维生素B12进行检测分析，回收率在93%以上。

徐双阳等[9]建立了的超高效液相色谱-质谱联用测定婴幼儿配方奶粉中维生素B12的方法。

维生素B12在0.2-10.0ng/mL的浓度范围内有良好的线性关系，方法的检出限为0.45ng/g，定量限为1.5ng/g，加标回收率在94.1%-105.4%，精密度在2.1%范围内。

实验证明该方法灵敏度高，分析速度快，重复性好，为婴幼儿配方奶粉中维生素B12检测提供了可行方法。

本试验采用超高效液相色谱-质谱联用，建立了婴幼儿配方奶粉中强化维生素B12的测定方法。

本方法分析速度快，灵敏度高，定量准确，方法检出限为0.5ng/g，定量限为1.5ng/g，能满足婴幼儿奶粉中维生素B12强化不少于8ng/g的要求。

本方法为新测定婴幼儿配方奶粉中维生素B12方法的建立提供了可行性。

但由于HPLC-MS仪器价格昂贵、运行费用较高，一些小型企业承担不起那么高的成本费，而且技术尚不够完善，所以目前还不能在国内的大多数实验室中普及。

但该方法能够对分析物进行准确定量，在不久得将来，它将成为维生素分析检测必不可少的技术。

1.3.4荧光光度法

1852年，Stokes提出荧光分析，发展到20世纪50年代，荧光分析已经发展成为一种比较成熟的分析技术，而到了70年代，随着仪器技术发展，荧光分析仪器就不断更新换代，荧光检测技术得到了广泛的应用。

最近，荧光检测技术与其他仪器联用的技术研究十分活跃，出现了流动注射荧光分析技术，液相色谱、离子色谱、薄层色谱等与荧光分析的联用技术，以及各荧光新技术之间的联用。

上述方法比一般荧光分析方法具有更快的分析速度，更高的灵敏度和选择性。

为检测维生素B12技术的发展开辟了新的途径。

荧光反应法[10]是指自身具有发射荧光的物质可以直接或增敏后用于检测，有些没有荧光物质的可以通过酸碱条件、改变结构加以敏化衍生，特定的衍生试剂将本身不具有荧光的维生素B12进行衍生化处理，得到的衍生物具有荧光。

当用紫外或红外照射时，其能发出共振的荧光以及比光源波长较长的紫外或红外荧光，从而达到间接测定的一种分析方法。

展念芹[11]等人在碱性环境中发现钴与硫胺素产生荧光物质，其荧光光谱的发射波长为440nm，激发波长为375nm。

周迅雷等[12]，建立荧光反应法测定婴幼儿配方奶粉中的维生素B12，以361nm作为检测波长。

该方法在0.051-3.24μg/mL范围内有很好的线性关系，相对标准偏差为2.1%，回收率在92.2%-96.7%，Li等[13]选择275nm作为激发波长，以305nm作为发射波长，对婴儿配方奶粉中的维生素B12进行了检测。

实验结果表明，使用荧光光度法测定维生素B12时，最佳酸碱度为pH=7.0，该方法检出限为0.1μg/L。

荧光光度法所用仪器较为普遍，但由于在处理衍化转化过程中会有干扰物质，需要对样品进行处理。

对维生素B12拥有高的选择性和灵敏度，并且具有使用试样少，线性范围宽等特点，但是荧光光度法易受温度、内部所含重金属原子和溶剂极性的影响而造成荧光淬灭等现象。

荧光分析法最主要的优势是选择性好和高的灵敏度，当要准确测定微量和痕量药物时，荧光分析法就显示出了极大的优越性。

首先分析物需要通过衍生化转变为具有紫外吸收或可产生荧光的物质，然后再使用色谱方法进行分离和检测，高灵敏度的荧光法分析作为间接检测方法，克服了直接检测方法的缺点，实现了微量和痕量分析，且又有高的灵敏度和选择性。

荧光分光光度法也有不足之处，如该方法相对复杂，不宜进行大规模的样品分析，所以无法在实验室里推广。

1.3.5免疫亲和柱净化/高效液相色谱法

免疫亲和柱净化是一种新型分离富集以及净化待测维生素B12的方法，随着免疫亲和净化技术的发展，其专一性与吸附性能大幅度提高，可以去除样品中大量的基质干扰。

吴楠等，建立了免疫亲和柱净化/高效液相色谱法测定乳粉中维生素B12的方法，该方法具有样品处理简单方便、重现性好、灵敏度高、分析时间短等优点，能满足调制乳粉及婴幼儿配方奶粉中微量维生素B12含量的测定要求。

免疫亲和法是利用抗原抗体特异性结合特性的固相萃取技术，根据抗原抗体的高选择性，从复杂的待测样品中提取所需要的目标化合物，是一种新型分离富集以及净化待测维生素B12的方法。

样品经过酶解和氰钴铵素构型转化后，提取液可直接使用免疫亲和柱进行净化与富集。

免疫亲和柱可净化处理食品中维生素B12的萃取液，且性能稳定，操作方便迅速，柱内含有维生素B12抗体，以共价键形式粘附于凝胶颗粒上。

全部水状溶液均可作为样品检测，但要确保其pH为7±0.5，否则，先用1N盐酸或氢氧化钠调节pH。

如果样品不够清澈，需要先离心，取上清液，或是先用专用滤纸过滤再过柱，以免阻塞免疫亲和柱。

维生素B12免疫亲和柱的技术参数：

回收率：

97％；饱和量：

>200ng；储存条件：

2-8℃，切勿冷冻。

本实验采用免疫亲和柱作为样品前处理技术。

维生素B12免疫亲和柱的操作流程示图如图1.1所示。

图1.1维生素B12免疫亲和柱的操作流程示图

吴楠等[14]建立了免疫亲和柱净化/高效液相色谱法测定婴幼儿配方奶粉中维生素B12的方法。

采用磷酸盐缓冲液使样品完全溶解后，通过维生素B12免疫亲和柱、甲醇洗脱、浓缩富集后就可直接测定。

经过条件优化后，维生素B12在20-300μg/L范围内呈现良好的线性关系，相关系数R为0.9997，检出限为0.6μg/kg；相对标准偏差为1.1%-2.4%；样品的加标回收率为90%-96%。

Marley等[15]的研究中使用了EASI-EXTRA免疫亲和柱对功能性饮料等样品进行提取分析，配合HPLC-UV检测，取得了较好的重现性。

检测限0.44μg/100g，变异系数在0.8%-10%之间。

Heudi等［16］使用免疫亲和柱对奶粉中维生素B12进行测定，定量限为2.5ng/g，回收率为94%-100%。

已经能满足调制乳粉及婴幼儿配方奶乳粉中微量维生素B12含量的测定要求。

免疫亲和法由于其自身特性，适合对高杂质、低含量样品中的维生素B12进行分析，结合液相色谱且具有操作简单、重现性、准确与灵敏度高等特点，可满足乳粉类复杂基质样品中微量维生素B12的测定要求。

但是免疫亲合法具有处理样品量少、价格不菲，免疫亲和柱保存条件苛刻的缺点。

第二章实验部分

2.1主要仪器与装置

AcquityTM超高液相色谱仪、XevoTMTQ-MS质谱仪[配有电喷雾电离接口（ESI）及Masslynx数据处理系统]（美国Waters公司）和固相萃取装置（美国Waters公司）,Milli-Q超纯水器（美国Milipore公司），高速离心机（美国Thermo公司），氮吹仪（天津市恒奥科技有限公司），涡旋混合器（太仓市华利达实验设备有限公司），WhatmanS&S5971/2滤纸。

2.2主要试剂与材料

维生素B12标准品（纯度大于99.5%），购于德国Dr.EhrenstorferGmbH公司；EASI-EXTRACTVITAMINB12（LGE）维生素B12免疫亲合柱（德国R-Biopharm）。

甲醇、乙腈:

色谱纯（德国Merck公司）；甲酸，磷酸二氢钾：

色谱纯（美国TEDIA）公司；醋酸钠：

分析纯（国药集团化学试剂有限公司），水为Milli-Q系统纯化水。

pH=4.0的醋酸钠溶液的配制：

称取4.1g醋酸钠于1L的烧杯中，加950mL去离子水，完全溶解后用醋酸调节pH=4.0，再用去离子水定容至1000mL。

pH=3.5磷酸二氢钾溶液的配制：

称取4.1g磷酸二氢钾于1L的烧杯中，加800mL去离子水，完全溶解后用磷酸调节pH=3.5。

2.3样品预处理

样品提取：

称取1.00g样品至锥形瓶中，加入50mL醋酸钠缓冲液，将样品液均匀移入两个50mL离心管中，涡旋混匀，超声提取5min，震摇10min，10000r/min条件下离心5min，取上层液，使用WhatmanS&S5971/2滤纸过滤，得到澄清滤液。

免疫亲和柱净化与富集：

将免疫亲和柱置于固相萃取装置上，放出柱中的保存液后（不能流干），将全部滤液经过免疫亲和柱，中间不能有样液流完现象，用10ml蒸馏水淋洗免疫柱，吹干柱内残留液。

加入3mL100%甲醇，盖上密封帽浸泡10min，用15mL玻璃管接收洗脱液，排干柱内