婴幼儿配方奶粉中强化维生素B12的检测技术.docx

1、婴幼儿配方奶粉中强化维生素B12的检测技术本科毕业设计说明书（论文）（xxx届）题目： 婴幼儿配方奶粉中强化维生素B12的检测技术研究学生姓名 学 号 指导教师 专业班级 应用化学专业 所在学院 化学工程学院 提交日期 xxx年xx月 婴幼儿配方奶粉中强化维生素B12的检测技术研究摘要 本实验采用免疫亲和柱/超高效液相色谱（UPLC）与免疫亲和柱/超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）测定婴幼儿配方奶粉中维生素B12的含量。样品用0.05 mol/L的醋酸钠除蛋白，采用免疫亲和柱对样品进行净化，滤液通过Waters Acquity UPLC BEH C18（2.1 mm 100 m

2、m 1.7 m）色谱柱分离，进样体积5 L，柱温35 ，流速0.2 mL/min，UPLC的流动相为0.03 mol/L磷酸二氢钾溶液（用磷酸调至pH 3.5）-乙腈（85 : 15）等度洗脱。UPLC-MS/MS的流动相为0.1%的甲酸水和甲醇梯度洗脱，采用电喷雾离子源（ESI）正离子扫描模式，多反应监测（MRM），定量离子（m/z）为678.3/147。维生素B12在10 g/L - 500 g/L范围内有良好的线性，相关系数R达到0.999，检出限为0.5 ng/g，定量限为1.5 ng/g。UPLC法测定维生素B12的相对标准偏差为0.2 - 3.0%，加标回收率在92.0 - 93.

3、1% （n = 3），UPLC-MS/MS法测定维生素B12的相对标准偏差为3.4 - 8.7%，加标回收率在85.0 - 110.3%（n = 3）。本方法分析速度快，灵敏度高，重复性好，适用于婴幼儿奶粉中低含量维生素B12的检测。 关键词：维生素B12，免疫亲和柱，婴幼儿配方奶粉，超高效液相色谱，超高效液相色谱-质谱Study ON THE DETECTION of vitamin B12 in infant formula milk powderABSTRACTThe method for the determination of vitamin B12 in infant formul

4、a milk powder was established by immunoaffinity column/ultra perf-ormance liquid chromatography（UPLC）and immunoaffinity column/ /ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry（UPLC-MS/MS）.After being treated by 0.05 mol/L sodium acetate to precipitate the milk protein, the sample was puri

5、fied by immunoaffinity column, the filtrate was separated by Waters Acquity UPLC BEH C18 （2.1 mm 100 mm 1.7 m）column, the injection volume was 5 L at a flow-rate of 0.2 mL/min and the column temperature was 35 oC. The mobile phase of UPLC consisted of 0.03 mol/L potassium dihydrogen phosphate（pH 3.5

6、） and acetonitrile（85 : 15） with isocratic elution, the mobile phase of UPLC-MS/MS consisted of 0.1% formic acid water and methanol gradient elution. The sample was analyzed by using multiple reaction monitoring（MRM）mode, electrospray ionization（ESI）source and selecting（m/z）678.3/147 as quantitative

7、 production. The calibration curve was linear in the range of 10 - 500 g/L, with a correlation coefficient of 0.999. The detection limit of method was 0.5 ng/g and the quantification limit was 1.5 ng/g. The relative standard deviation of the determination of vitamin B12 by UPLC was 0.2 - 3.0%, the r

8、ecovery rate was between 92.0% - 93.1% (n = 3), the relative standard deviation of the determination of vitamin B12 by UPLC-MS/MS was 3.4 - 8.7%, the recovery rate was between 85.0% - 110.3% (n = 3). Due to its short operation time, high sensitivity and good reproducible, the proposed method can be

9、used to determine vitamin B12 in infant formula milk powder. Key words: vitamin B12, immunoaffinity column, infant formula milk powder, ultra high performance liquid chromatography, ultra high performance liquid chromatography-mass spectrometry 第一章 绪论 1.1 维生素B12的概述及功能 维生素B12又称抗恶性贫血维生素，是一种由含钴的卟啉类化合物组

10、成的B族维生素。维生素B12是经过20年的研究，在1948年才从肝脏中分离出来，它是一种具有控制恶性贫血效果的红色晶体物质，是B族维生素中发现最晚的一种。维生素B12在pH值4.5 - 5.0弱酸条件下能够稳定存在，易溶于乙醇和水，强酸（pH 200 ng；储存条件：2 - 8 ，切勿冷冻。本实验采用免疫亲和柱作为样品前处理技术。维生素B12免疫亲和柱的操作流程示图如图1.1所示。图1.1 维生素B12免疫亲和柱的操作流程示图吴楠等14建立了免疫亲和柱净化/高效液相色谱法测定婴幼儿配方奶粉中维生素B12的方法。采用磷酸盐缓冲液使样品完全溶解后，通过维生素B12免疫亲和柱、甲醇洗脱、浓缩富集后就

11、可直接测定。经过条件优化后，维生素B12在20 - 300 g/L范围内呈现良好的线性关系，相关系数R为0.9997，检出限为0.6 g /kg；相对标准偏差为1.1% - 2.4%；样品的加标回收率为90% - 96%。Marley 等15的研究中使用了EASI-EXTRA 免疫亲和柱对功能性饮料等样品进行提取分析，配合HPLC-UV检测，取得了较好的重现性。检测限0.44 g/100g，变异系数在0.8% - 10%之间。Heudi 等16使用免疫亲和柱对奶粉中维生素B12进行测定，定量限为2.5 ng/g，回收率为94% - 100%。已经能满足调制乳粉及婴幼儿配方奶乳粉中微量维生素B1

12、2含量的测定要求。免疫亲和法由于其自身特性，适合对高杂质、低含量样品中的维生素B12进行分析，结合液相色谱且具有操作简单、重现性、准确与灵敏度高等特点，可满足乳粉类复杂基质样品中微量维生素B12的测定要求。但是免疫亲合法具有处理样品量少、价格不菲，免疫亲和柱保存条件苛刻的缺点。 第二章 实验部分2.1 主要仪器与装置AcquityTM超高液相色谱仪、XevoTMTQ-MS质谱仪配有电喷雾电离接口（ESI）及Masslynx数据处理系统（美国Waters公司）和固相萃取装置（美国Waters公司）,Milli-Q超纯水器（美国Milipore公司），高速离心机（美国Thermo公司），氮吹仪（天

13、津市恒奥科技有限公司），涡旋混合器（太仓市华利达实验设备有限公司），Whatman S&S 5971/2滤纸。2.2 主要试剂与材料维生素B12标准品（纯度大于99.5%），购于德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；EASI-EXTRACT VITAMIN B12（LGE）维生素B12免疫亲合柱（德国R-Biopharm）。甲醇、乙腈:色谱纯（德国Merck公司）；甲酸，磷酸二氢钾：色谱纯（美国TEDIA)公司；醋酸钠：分析纯（国药集团化学试剂有限公司），水为Milli-Q系统纯化水。pH = 4.0的醋酸钠溶液的配制：称取4.1 g醋酸钠于1 L的烧杯中，加950 mL去离子水，

14、完全溶解后用醋酸调节pH = 4.0，再用去离子水定容至1000 mL。pH = 3.5磷酸二氢钾溶液的配制：称取4.1 g磷酸二氢钾于1 L的烧杯中，加800 mL去离子水，完全溶解后用磷酸调节pH = 3.5。2.3 样品预处理 样品提取：称取1.00 g样品至锥形瓶中，加入50 mL醋酸钠缓冲液，将样品液均匀移入两个50 mL离心管中，涡旋混匀，超声提取5 min，震摇10 min，10000 r/min条件下离心5 min，取上层液，使用Whatman S&S 5971/2滤纸过滤，得到澄清滤液。免疫亲和柱净化与富集：将免疫亲和柱置于固相萃取装置上，放出柱中的保存液后（不能流干），将全部滤液经过免疫亲和柱，中间不能有样液流完现象，用10 ml蒸馏水淋洗免疫柱，吹干柱内残留液。加入3 mL100%甲醇，盖上密封帽浸泡10 min，用15 mL玻璃管接收洗脱液，排干柱内