REACH法规 第五卷译稿3.docx

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REACH法规第五卷译稿3

C.2.水蚤急性中毒

1.方法

1.1.引言

本测试方法用于导致淡水水蚤静止的化学物质的中级有效浓度（EC50）的测定。

因此有必要尽可能掌握这些物质的水溶性、蒸汽压、化学稳定性、溶解常数和生物降解率等数据。

在设计测定方法和分析结果时还应考虑到其它信息（例如结构式，纯度，主要杂质的种类和百分比，添加物的存在和数量和正辛醇/水分配系数）。

1.2.定义和单位

水蚤的LC50的浓度的直接测定是通过如实验方法所述的EC50的测定来实现的。

本实验中的（导致水蚤）急性中毒的毒性是指导致（水蚤）静止的中级有效浓度（EC50），这个浓度按照原始数据值，表示在给定时间内接触该浓度的物质导致50％数量的测定水蚤静止。

静止：

动物在轻轻敲打实验容器后15秒内仍不能游动被认为已经处于静止状态。

所有测定物质的浓度用重量体积比表示（mg/L）。

也可以用重量比（mg/kg）表示。

1.3.参考物质

可以作为测定的参考物质指的是在实验室测定条件下，测定物的响应信号没有显著变化的物质。

用四种不同物质作EEC环形实验的结果总结在附录2中。

1.4.测定方法原理

极限测试需用100毫克每升进行测定从而保证EC50值大于此测定浓度。

将水蚤48小时置于一系列含有不同浓度的被测物质的水中，如做时间较短的实验，在实验报告中要指明修改部分。

除非在其他特定的实验条件下，以及足够的一系列不同的被测物质浓度，被测物质的不同浓度会对水蚤的游动能力造成不同平均程度的影响。

在实验最后，不同的浓度会造成不同百分比的水蚤不再游动。

导致0%或者100%水蚤静止的浓度直接来自实验的观察结果，而48小时的EC50值来自可能的计算。

这个实验使用一种统计系统，所以实验方法在水蚤与被测物质的接触过程中不能更新。

1.5.定量标准

定量标准适用于极限测试和整个测定方法和过程。

实验最后，对照实验的静止程度不能超过10%。

对照实验下的水蚤，不能被困在水面表层。

在整个实验过程中，实验容器中的溶解氧浓度必须始终保持在3mg/L以上，而且无论如何不能让溶解氧浓度低于3mg/L。

在整个实验持续过程中，被测物质的浓度必须保持在原浓度的80%以内。

对于那些易溶于测试介质的物质，溶解后形成稳定的溶液而且不发生显著的挥发、降解、水解或吸收的，可认为起始溶液浓度为标定浓度值。

要有证据能表明测定过程中浓度保持稳定并符合定量标准。

对于以下物质：

（i）在测定介质中溶解性差，或

（ii）能形成稳定的乳状液或悬浊液的，或

（iii）在水溶液中不稳定的，

起始浓度应在测定开始时在溶液中进行测定（或者，若技术条件不允许，应在水柱中测量）。

浓度测定应溶解平衡一段时间后进行，但应在加入被测有机体之前。

在这些情况下，在测试中应采取进一步措施确定接触物质的实际浓度，满足定量标准。

pH值变化不应超过一个单位。

1.6.测定方法概述

1.6.1试剂

1.6.1.1被测物质溶液

一定离子强度的储备液用去离子水或符合1.6.1.2标准水溶解测定物配制。

测定所需浓度的溶液用储备液稀释配制，如果测定的是高浓度的，可直接将物质溶于水。

通常测定的物质浓度取决其溶解度。

对一些物质（其水溶解度低或有高Pow值或形成的溶液实际为稳定的分散液的），可以不受其溶解度所限进行测定，从而保证获得其最大的可溶/稳定浓度数据。

需要注意的是，该浓度下测定系统不被破坏。

超声波分散，有机溶剂，乳化剂或分散剂可辅助用于一些水溶性差的物质储备液的配制，或有助于物质在介质中的分散。

当使用这些辅助物质时，测定浓度应包括相同数量的辅助物质，同时对照组中测定水蚤也应使用相同数量的辅助物质。

辅助物质的浓度应尽可能低，任何情况下不得大于100毫克每毫升。

测定过程中pH值不应改变。

如果有显著证据表明pH值发生了变化，建议调整pH值重新进行测定并报道结果。

在这种情况下，除非有特殊原因储备液的pH值应调整至稀释水的pH值。

最好用HCL和NaOH调节pH值。

pH值调节过程中，储备液中被测物的浓度不应发生显著变化。

如果调节过程中，测定化合物发生化学反应或物理沉淀现象应予以记录。

1.6.1.2.实验用水

本实验使用再造水（参照附录1和参考

（2）：

ISO6341）。

为避免在实验前有适应的需要，推荐使用与实验用水有相同质量（pH，硬度）的培养水。

1.6.2.仪器

应使用标准的实验仪器及用具。

与实验溶液接触的仪器最好完全是玻璃制的。

－测氧计（有微电极或其他用于测量小体积样品中溶解氧的合适仪器），

－足够的温度控制仪器，

－pH计，

－测量水硬度的仪器。

1.6.3.测定用有机体

magna水蚤是很好的测试种类，尽管puLex水蚤也可用于测试。

被测动物在实验开始时必须有少于24小时的寿命，是实验室培养的，没有明显疾病，以及有明确历史记录（如培养，以及任何预先处理等）。

1.6.4.测定步骤

测距技术用于确定整个测定过程中测定浓度的范围。

进行没有待测物质的对照组实验，如果有必要，还应进行含有辅助物质的对照组实验。

水蚤与化学物质接触如下：

－持续时间：

24小时；

－动物数量：

至少20个每一测试浓度，最好分为4批每批5个或2批每批10个；

－载量：

每个动物至少提供2mL测试溶液；

－测定浓度：

测试溶液必须在加入水蚤前即时配制，最好不用除了水以外的其他溶剂，浓度在不超过浓度比2.2的情况下构成一几何系列。

有足够的不同浓度在48小时后得到0和100%的静止以及一系列中间程度的静止状态，以便和对照实验一起计算48小时EC50值；

－水：

见1.6.1.2；

－光：

任意的亮-暗循环；

－温度：

实验温度必须在18至22℃之间，但在任何测定中温度变化不超过±1℃；

－通风：

测试溶液不能用气泡通风；

－喂食：

不需要。

对照测试与所有的测试浓度的pH值以及含氧量都要在实验最后测定。

测试溶液的pH值不能改变。

易挥发物质必须在完全密封的容器中进行实验，容器要足够大以防止缺氧。

至少24小时后观察一次水蚤，48小时后再观察一次。

极限测试

本测定方法描述的步骤中，极限测试用100毫克每升进行测定从而保证EC50值大于此测定浓度。

如果测定物质的性质决定了100毫克每升的测定浓度无法达到，那么极限测试应用与测定物质的在介质中溶解度一致的浓度值进行（或者是形成稳定分散液的最大浓度值）（还可见1.6.1.1）。

极限测试必须使用20个水蚤，分成两批或四批，与对照实验一样。

如果静止状态出现，则进行完整的分析。

2.结果和评估

每一观察记录的时间段（24和48小时），在对数概率纸以静止率百分数对浓度作图。

如有可能，对每一观察时间段，EC50值和置信界限（p＝0.05）应用标准步骤估算；这些数值应四舍五入为一位或最多两位有效数字（以两位有效数字为例：

173.5四舍五入为170；0.127四舍五入为0.13；1.21四舍五入为1.2）。

对于那些浓度/百分比曲线斜率过大不利于计算EC50值的情况，对图表EC50值的估算十分有效。

如果两个相差2.2个单位的浓度值分别对应0和100％的静止率，那么EC50值必然落在这两个浓度值区间内。

如果观察到测定物质无法保持稳定或均匀性，那么要报道结果并注意对结果进行处理转化。

3.结果报告

如有可能，结果报告应包含以下内容：

－测试有机体信息（学名，品系，供应商或种类，任何预处理，培养方法-包括来源，种类，喂食数量以及喂食频率）；

－稀释水的来源，主要化学物性质（如pH值，硬度，温度）；

－如果测定物水溶性差，配制储备液和测定液的方法过程；

－任何辅助物质的浓度；

－测定浓度列表，以及该浓度下测定液中测定物的稳定性等方面信息；

－使用任何化学分析手段的方法步骤和结果报告；

－如果进行了极限测定，报告结果；

－测定仪器的描述；

－光照制度；

－测试液的溶解氧浓度，pH值和温度；

－有证据表明测定方法符合定量标准；

－用表格表示每一浓度下累积的静止率值以及建议观察的每一时间段（24和48小时）对照组实验结果（如需要使用辅助物质也要报告）；

－测定结束后的浓度/百分数相应曲线的图表；

－如有可能，对建议观察的每一时间段，报告EC50值（置信度为95%）；

－测定EC50值的统计步骤描述；

－如使用参考物质，报告其结果；

－在测定过程中未引起静止的最大测定浓度；

－在测定过程中引起100％静止率的最小测定浓度；

4.参考文献

1）OECD,Paris,1981,TestGuidelines202,DecisionoftheCouncilC（81）30finaland

updates.

2）InternationalStandardISO,WaterQuaLity-Determinationofinhibitionofmobility

ofDaphniamagnaStraus,ISO6341-1989

3）AFNORInhibitionofmobilityofDaphniamagnaStraus（Cladocera-crustacea）NFT90301（January1983）.

4）VerfahrensvorschlagdesUmweltbundesamteszumakutenDapHnien-Test.Rudolph,

P.undBoje,R.ÖkotoxikoLogie,GrundLagenfurdieökotoxikoLogischeBewertungvonUmweltchemikaliennachdemChemikaliengesetz,ecomed1986.

5）DINTestverfahrenmitWasserorganismen38412（L1）und（LLL）.

6）Finney,D.J.StatisticalMethodsinBiologicalAssay.Griffin,Weycombe,U.K.,

1978.

7）Litchfield,J.T.andWilcoxon,F.Asimplifiedmethodofevaluatingdose-effectexperiments.J.Pharmacol.andExper.Ther.,1949,vol.96,99-113.

8）Sprague,J.B.Measurementofpollutanttoxicitytofish.IBioassaymethodsforacute

toxicity.WaterRes.,1969,vol.3,793-821.

9）Sprague,J.B.Measurementofpollutanttoxicitytofish.IIUtilisingandapplyingbioassayresults.WaterRes.1970,vol.4,3-32.

10）StepHan,C.E.MethodsforcalculatinganLC50.InAquaticToxicologyandHazardEvaLuation（editedbyF.I.MayerandJ.L.Hamelink）.AmericanSocietyforTestingandMaterials.ASTM,1977,STP634,65-84.

11）StepHan,C.E.,Busch,K.A.,Smith,R.,Burke,J.andAndrews,R.W.AcomputerprogramforcalculatinganLC50.USEPA.

附录1:

再造水

合适的稀释水（根据ISO6341）

所有化学物质都是分析纯。

分析用水都是优质的蒸馏水或者是电导率小于5μScm-1的水。

蒸馏仪器不得含有任何铜制造的部件。

储存液

CaC12.2H2O（二水氯化钙）:

溶于水中，配至1升

11.76g

MgSO4.7H2O（七水硫酸镁）:

溶于水中，配至1升

4.93g

NaHCO3（碳酸氢钠）:

溶于水中，配至1升

2.59g

KCI（氯化钾）:

溶于水中，配至1升

0.23g

再造稀释水

混合四种储备液各25毫升，配至1升。

往溶液中通气，使氧浓度与空气中的饱和浓度相同。

pH必须是7.8±0.2。

如果需要，用NaOH（氢氧化钠）或者HCL（盐酸）调节pH值。

准备好的稀释水放置12小时，不需要另外通气。

溶液中Ca和Mg离子浓度和是2.5毫摩尔每升，Ca与Mg离子比是4：

1，Na与K离子比是10：

1。

溶液总碱度是0.8毫摩尔每升。

任何准备稀释水过程中的偏差不能改变水的组成和性质。

附录2

1978年一个EEC循环测试的结果总结（同样在参考文献2中被引述）

注意：

循环测试的目的是EC5024小时的测定。

使用物质：

1）重铬酸钾

2）四丙基苯磺酸

3）四丙基苯磺酸，钠盐

4）三氯-2，4，5-苯氧基乙酸，钾盐

物质参与实验数目计算结果数目EC50-24小时mg/L平均值

1461291.5

23610827

3318427

43272770

附录3:

浓度试样:

静止百分比