课题共振瑞利散射在生物大分子中的应用.docx

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课题共振瑞利散射在生物大分子中的应用课题共振瑞利散射在生物大分子中的应用共振瑞利散射在生物大分子中的应用摘要:

共振光散射技术（RLS）是一种新的分析方法,具有高灵敏度、良好的选择性、简便的操作、安全无毒及便宜的试剂等优点。

而且，共振光散射的研究不需要专门的仪器,在普通的荧光分光光度计上选择合适的激发和发射通带宽度,采用相等的激发和发射波长同时扫描激发和发射单色器所得的同步光谱（即=0）,即为光散射粒子的共振散射光谱。

由于共振光散射光谱属于同步光谱,可看作散射粒子是能发射出与激发光相等波长的发光体,故而共振光散射信号属于同步发光。

本实验主要研究了表面活性剂十二烷基磺酸钠（SDBS）、十六烷基三甲基溴化铵（CTMAB）的水溶液和乙醇溶液的散射现象。

结果表明，SDBS、CTMAB在水和乙醇中随着体系的浓度增加而形成胶束，胶束的散射现象可以通过RLS信号的变化表征。

而且，表面活性剂SDBS、CTMAB的乙醇溶液的CMC也可以通过同步散射光谱得出与文献相近的数据。

由此，RLS技术可以作为一种新的表面活性剂CMC的测定方法，但能否用于定量分析还有待研究。

关键词：

共振光散射技术，SDBS，CTMAB，荧光分光光度计，CMCAbstract:

Resonancelightscatteringtechnique（RLS）isanewanalysistechnicswiththeadvantagesofhighsensitivity,goodselectivity,easyoperation,safeandnon-toxic,inexpensivereagents,etc.Moreover,theresonancelightscatteringstudydoesnotrequirespecialequipment,choosesasuitableexcitationandemissionbandpassinacommonfluorescencespectrophotometer,meanwhileadoptsthesamewavelengthsofexcitationandemissiontoscanexcitationmonochromatorandemissionmonochromator，thenobtainssynchronizationspectrum（namely=0）whichisthescatteringspectraoftheresonancelightscatteringparticles.Asaresultofresonancelightscatteringspectraissynchronizationspectrum,whichareconsiderdaslightemittersofradiatingexcitationwavelengthsthatarethesameasemissionwavelengths,sotheresonancelightscatteringsignalsaresynchronous.TheexperimentalmainlyhavestudiedthescatteringphenomenonofsurfactantsolutionsaboutSDBSandCTMABinwaterorethanol.TheresultsshowthatSDBSandCTMABinthewaterorethanolbothfomemicellewiththeincreaseoftheirconcentrations,andthescatteringphenomenoncanbecharacterizedbychangedRLSsignals.Morover,thesurfactantsolutionofSDBSandCTMABintheerhanolcangetroughlythesameresultsasliteraturebysynchronouslightscatteringspectrum.therefore,RLStechniqueasanewwaycanbeusedtomeasureCMCofsurfactants,butweneedmorestudiestoconfirmwhetheritcanbeusedforquantitativeanalysisofsurfactants.Keywords:

RLS,SDBS，CTMAB,Fluorescencespetrophotometer,CMC目录1引言411散射现象412散射原理513同步发光方程52实验部份621实验药品622实验仪器723实验样品配制724实验操作8241十二烷基磺酸钠水溶液8242SDBS-乙醇水溶液8243十六烷基三甲基溴化铵CTMAB8244CTMAB-乙醇溶液8245pH对十二烷基磺酸钠水溶液的影响83结果与讨论94结论16参考文献18致谢附录附录一：

文献综述附录二：

翻译及原文1引言表面活性剂CMC的测定方法在不断丰富，常见的方法有测临界胶束聚集数用的稳态荧光探针法，测定反胶束溶液CMC用的正电子湮灭法、染料吸附法、介电增量法、1HNMR法，表面张力法，紫外吸收光度法，溶解度法，电导法，蒸汽压法等。

但是，他们有着自己各自的缺点，如：

荧光探针法用的芘探针易燃有毒、萃灭剂二苯酮不稳定，正电子湮灭法技术难度大，电导法的测量体系不能有过量的无机盐或其他导电性较强的杂质存在，染料吸附法中不同的表面活性剂需要不同的染料，而且不适应非离子表面活性剂CMC的测定，等等。

RLS技术的出现，它的高灵敏度、良好的试剂选择性、简便操作、安全无毒和所用试剂便宜等优点得到了广大研究人员的重视，而且所需要的仪器就是普通的荧光分光光度计。

目前RLS技术除主要用于生物大分子的研究和测定,还广泛用于痕量金量、表面活性剂、药物的分析以及纳米材料和血液方面的研究。

文献中已有记载，RLS成功应用于蛋白质分子的定量测定，包括分析了蛋白质与不同表面活性剂发生作用形成了胶束，从而导致了RLS信号强度增强或减弱。

而表面活性剂自身也能团聚形成胶束，在这个从小分子到胶束的过程中，可以推断出，RLS信号也会随着胶束浓度的增加而发生变化。

11光散射现象光散射现象广泛存在于光与粒子的作用过程中，是指当光通过介质时在入射光方向以外的各个方向上所观察到的光现象。

它源于光电磁波的电场振动而导致的分子中电子产生的受迫振动所形成的偶极振子。

根据电磁理论，振动着的偶极振子是一个二次波源，它向各个方向发射的电磁波就是散射波。

光散射与介质的不均匀性有关，除了真空之外的其它所有介质都有一定程度的不均匀性，从而产生散射光，只是由于介质中粒子大小不同，产生不同种类的散射。

当介质中粒子直径远大于入射光波长（。

）时，产生的散射可看成是反射和折射；如果介质中粒子直径与入射光波长相近，便产生了丁达尔散射；如果介质中粒子很小，如d20。

时，便产生以瑞利散射为主的分子散射。

分子散射是由于分子热运动造成的局部密度涨落引起的。

分子散射比达丁尔散射要弱得多。

但是，即使十分纯净的液体和气体都能产生分子散射。

根据入射光和散射光波长的不同，光散射又可以分为弹性光散射、非弹性光散射和准弹性光散射。

其中弹性光散射又称为经典散射或静态散射。

瑞利散射是d20。

的弹性散射，浑浊介质的丁达尔散射和透明介质的分子散射都是弹性散射。

发射光波长与入射光波长不同的瑞利散射是光与分子振动交换能量的非弹性散射，而瑞利散射是由于热声波引起的非弹性散射。

对多原子分子或基团，荧光是高能电子激发态跃迁到电子基态中的各振动转动态产生的电子振动跃迁而形成的宽带发射谱，所以在共振光散射测定中，荧光将产生干扰。

对于入射光频率和发射光频率仅有微小差别的准弹性散射，是由于散射质点不停的做布朗运动所引起的多普勒效应使散射光频率以入射光频率为中心而展宽，即动态光散射。

12散射原理当光射入分散体系中，只有一部分光线能够自由通过，另一部分被吸收、散射或者反射。

对光的吸收主要取决于体系的化学组成，而散射和反射的强弱与质点大小有关。

低分子真溶液的散射极弱；质点大小在胶体范围内，则发生明显的散射现象，即通常说的光散射；当质点直径远大于入射波长时（如悬浮体），则主要发生反射，体系呈浑浊。

如果用超显微镜用聚光器将强烈的光线经由细缝投射在高倍率显微镜下面的胶体溶液。

若使显微镜与光线成直角，可以观察到普通显微镜无法看到的胶体粒子存在及其运动状态，可以观察到10-8米的任何颗粒的形状。

荧光分光光度计中RLS信号强弱，正是在检测器与单色器成90度这个条件下观察到的。

13同步发光方程共振散射光是源于等波长入射光激发散射粒子时产生的，因此散射粒子实际上是能发射出与激发光波长相等的新发光体，故而共振光散射信号属于同步发光信号。

根据同步发光方程:

ISL=KcbEex（ex）Eem（ex+）

（1）式

（1）中Eex是在给定激发光波长处（ex=em-）的激发函数,Eem是在对应的发射波长处（em=ex+）的发射函数,K是与仪器条件有关的常数,b是液池厚度。

当=0时,即得共振光散射强度为IRLS=KcbEex（ex）Eemex

（2）由公式

（2）可知在仪器条件一定时,共振光散射强度与散射粒子的浓度c成正比,据此可以用于散射粒子的分析测定。

2实验部分21实验药品十二烷基磺酸钠（Dodecylsulfonicacidsodiumsalt，SDBS，分析纯）（上海盛众精细化工有限公司，上海）是洗洁精的主要成分。

分子式：

CH3（CH2）10CH2SO3Na分子量：

272.38性状：

白色或浅黄色结晶或粉末。

易溶于水；溶于热乙醇；和微溶于乙醚；不溶于石油醚。

密封保存。

熔点：

300。

有特殊气味。

在湿热空气中分解。

十六烷基三甲基溴化铵（CTMAB，分析纯）（上海金山经纬化工有限公司，上海）是一种阳离子去污剂。

分子式C16H33（CH3）3NBr分子量364.446熔点:

250-237水溶性13g/L（20C）纯度（含量）99%性质:

本品呈白色或浅黄色结晶体至粉末状，易溶于异丙醇，可溶于水,震荡时产生大量泡沫，能与阳离子、非离子、两性表面活性剂有良好的配伍性。

本品化学稳定性好，耐热、耐光、耐压、耐强酸强碱。

磷酸（H3PO4，85%）硼酸（B（OH）3，分析纯）分子量：

61.83冰乙酸（C2H4O2，分析纯）分子量：

60.05氢氧化钠（NaOH，分析纯）分子量：

40.00Britton-Robinson缓冲液：

磷酸、硼酸和冰乙酸均为0.04mol/L，混合，用0.2mol/LNaOH调节所需的pH缓冲液无水乙醇，去离子水22实验仪器:

970CRT荧光分光光度计，1cm玻璃比血皿23溶液样品的配制

（1）1.010-1mol/LSDBS：

分析天平称取2.7238gSDBS,用蒸馏水溶解并稀释到100mL的容量瓶中。

1.010-2mol/LSDBS：

移取10ml10-1mol/LSDBS稀释成100ml。

（2）分别用移量管移取2.00，2.50，5.00，7.50，10.0，12.50，15.00ml的1.010-2mol/LSDBS到25ml的容量瓶中,用蒸馏水稀释到刻度,形成0.810-3,1.010-3,2.010-3,3.010-3,4.010-3,5.010-3，6.010-3mol/LSDBS系列溶液。

其中5.010-3、6.010-3mol/LSDBS有晶体析出，弃置不用。

（3）分别移取2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5ml10-1mol/LSDBS到10ml容量瓶中，用乙醇稀释，配制成2010-3，2510-3，3010-3，3510-3，4010-3，4510-3，5010-3，5510-3mol/LSDBS的乙醇溶液。

其中，4510-3、5010-3、510-3mol/LSDBS的乙醇溶液中有颗粒析出，不能作为实验测量对象。

（4）称0.1822gCTMAB，配制成50ml0.01mol/L的CTMAB水溶液（5）移取0.50，0.75，1.00，1.25，1.50，1.75，2.00ml0.01mol/L的CTMAB水溶液,用水稀释到50ml的容量瓶中，所得溶液的浓度分别为10.010-5,15.010-5,20.010-5,25.010-5,30.010-5,35.010-5,40.010-5mol/L。

其中40.010-5mol/L的CTMAB水溶液中有晶体析出。

（6）10-4mol/LCTMAB-乙醇：

1ml0.01mol/L的CTMAB到100ml的容量瓶中，用乙醇稀释到刻度。

配制CTMAB-乙醇系列溶液：

分别移取1.00ml，5.00ml，6.00ml，7.00ml，8.00ml，9.00ml10-4mol/LCTMAB-乙醇,用无水乙醇稀释成10.00ml。

（7）按比例配制BR缓冲溶液，用酸度计调试pH。

得到pH分别为3.0，4.0，5.0，6.0的BR缓冲液。

其中测量过程中，SDBS与BR以体积比1：

1摇匀测量。

24实验操作2.41测定十二烷基磺酸钠SDBS水溶液的RLS信号：

通过调试设定实验条件缝宽5nm、灵敏度3，分别测量浓度为0.810-3，1.010-3，2.010-3，3.010-3，4.010-3，5.010-3mol/L的SDBS的共振光散射信号。

2.42测定SDBS-乙醇水溶液的RLS信号：

实验条件缝宽5nm，灵敏度2，测量SDBS-乙醇水溶液浓度分别为2010-3，2510-3，3010-3，3510-3，4010-3，4510-3mol/L。

2.43测定CTMAB水溶液的RLS信号：

CTMAB水溶液的浓度分别为10.010-5,15.010-5,20.010-5,25.010-5,30.010-5,35.010-5mol/L，实验条件缝宽5nm，灵敏度分别为3、1、1、2、2、2。

2.44测定CTMAB-乙醇溶液的RLS信号：

实验条件缝宽5nm，灵敏度3，CTMAB-乙醇的浓度分别为1.0010-5，5.0010-5，6.0010-5，7.0010-5，8.0010-5，9.0010-5mol/L。

2.45BR缓冲液对SDBS水溶液的影响：

缝宽5nm，灵敏度3，SDBS浓度5.010-3mol/L（该浓度的SDBS水溶液RLS信号的测定所需灵敏度为2，而不是3，选择5.010-3mol/LSDBS不观察pH的影响，是因为它的稳定性和所需条件较低）在BR的pH分别是3.0，4.0，5.0，6.0时的RLS信号。

注意：

所有测定均为同步扫描Ex：

300-800nm，Em：

300-800nm。

平行测定3-4次，结果取平均值。

3.结果与讨论3.1十二烷基磺酸钠水溶液十二烷基水溶液配制2h后，进入测量。

每组数据平衡测量4次，其中第一个数据在样品放入比血皿中1min后开始测量。

实验条件为缝宽均为5nm，灵敏度3，同步扫描，波长范围300nm-800nm。

取平均值，做图1，得到不同浓度下的SDBS的共振光散射信号。

从图中可以看出，最高峰在607.8nm处，且随着浓度的增加，峰值也在增加。

在760.9nm处还有一个很小的峰，峰值变化同于最高峰处的变化。

其中，当SDBS水溶液浓度达到2.010-3mol/L时，突跃最大。

从而可以推导出，SDBS水溶液的CMC应该在2.010-3mol/L附近，因为物质从分子聚集成胶束的时候粒子性非常明显，从而当散射光通过体系时会出现较强的散射现象。

从图可知，3.010-3mol/L的SDBS共振光散射信号最强，即粒子性最强。

但是再随着浓度的增加，粒子的RLS信号开始慢慢变弱，这可能是由于粒子颗粒变大，出现了较强的反射现象。

从图2，做两段曲线的切线，相交于2.010-3mol/L附近。

所以，SDBS水溶液的CMC=2.010-3mol/L。

与文献CMC相同。

图1SDBS水溶液的RLS信号强度变化，最高峰的浓度从上到下依次为3.010-3,4.010-3,2.010-3,1.010-3,0.810-3mol/L。

图2不同浓度的SDBS最高峰的变化趋势，两条曲线上的点从左到右浓度依次增加，分别为：

0.810-3,1.010-3,2.010-3,3.010-3,4.010-3mol/L。

242SDBS-乙醇水溶液图3是SDBS-乙醇水溶液在不同浓度下的RLS信号变化。

从图3可以看出，RLS信号随着浓度的增加而增加，而且在2510-3mol/L处发生了很大的突跃。

由此可知，SDBS乙醇水溶液在此浓度形成了胶束。

由图4可以得到一个结论，SDBS乙醇水溶液的RLS信号随着浓度的增加表现出线性关系：

y=23.396x-466.24，R2=0.9634。

同样的，SDBS乙醇水溶液的最大强收峰在604.7nm,而且在760.9nm波长也有一个随浓度增加而升高的峰。

两个不同波长处峰值的变化，正是由于SDBS在乙醇水体系中形成了胶束，而且颗粒逐渐增大。

相比于单纯的SDBS水溶液的共振光谱来说，加入乙醇有利于SDBS的增溶，而且也使得体系的稳定性变得更加良好。

这可能是因为SDBS的结构决定的。

SDBS是阳离子表面活性剂，水溶液中，由于SDBS相互团聚形成胶束而表现出粒子性；醇水溶液中，相对来说，减弱了SDBS相互间的作用。

这个环境能使SDBS增溶，是因为形成的胶束大小不同。

虽然仍然只是SDBS相互团聚才表现出的颗粒性，但是醇水体系相对密度比水小，胶束粒子运动受到的阻力更小，所要消耗的吉布斯自由能变小。

也可能是因为醇水体系比水的折射率小，从而增大了胶束粒子与价质的折射率差值，因此表现出较强的散射光RLS信号强度。

SDBS乙醇水溶液的CMC=2510-3mol/L。

文献中没有找到相关的CMC。

图3SDBS-乙醇水溶液RLS信号强度，浓度从下到上依次为2010-3，2510-3，3010-3，3510-3，4010-3mol/L图4SDBS醇水溶液最强峰的线性关系，从左到右浓度依次增加243十六烷基三甲基溴化铵CTMABCTMAB是一种阴离子表面活性剂，它的分子式为C16H33（CH3）3NBr，分子量364.45。

可溶于水,震荡时产生大量泡沫。

本课题研究了浓度分别为1010-5，1510-5，2010-5，2510-5，3010-5，3510-5mol/L的CTMAB的共振光散射情况。

但是几乎每一种浓度的CTMAB测量出RLS信号所需的条件不一样。

只有一种大概的变化趋势，谈不上有规律。

本实验重复做了4次，结论基本相同。

随着CTMAB浓度的增加，总体大的变化是RLS信号增强了，且在1510-5mol/L处达到了最高峰。

但之后出现一个低谷，接着又出院一个小的峰，然后再降下去。

在整个实验中，的确出现了胶束粒子，而且从1010-5mol/L到1510-5mol/L，中间出现了2个灵敏度的差距。

文献中，常温下，十六烷基三甲基溴化铵的CMC=9.1210-5mol/L。

由此，只能确定CTMAB的CMC数量级相同，数值相近。

至于为何出现如此大的突跃以及RLS信号随着浓度增加出现波浪式的变化，没有找到有利的证据。

我想，可能是由于CTMAB从小分子状态变成胶束粒子的过程中，形成的粒子直径很大，达到几个甚至几十个纳米。

分子状态CTMAB呈直锯齿状，而N-端因呈立体结构而显得较大，电离出Br-后的N-端带正电荷，与水形成氢键。

随着CTMAB单位体积中质点的增多，通过氢键作用抱在一起的CTMAB分子大量增加，从而使它的胶束粒子直径迅速变大。

这也就能解释为什么在1010-5mol/L到1510-5mol/L如此小的浓度差范围内，出现了2个灵敏度的差距。

但是共振光散射强度与粒子的大小息息相关。

当粒子达到一定程度的时候，粒子表现为反射、折射，从而导致了体系的RLS信号削弱。

前文中提到过，粒子的折射率与周围介质的折射率相差越大，粒子的散射光越强。

当粒子反射的光越来越多的时候，RLS信号就非常弱了。

所以，在后面的几个测量数据中，灵敏度增加了，RLS相应出现上升的变化，但没增加多少又迅速削弱了。

244CTMAB-乙醇溶液在恰当的实验条件下测量取平均值，绘制了图5、图6。

图5CTMAB乙醇溶液RLS信号峰随浓度的变化.最高峰浓度从上到下，依次递减。

图6相同散射波长处不同浓度的CTMAB乙醇溶液的RLS信号强度变化，从左到右，6个点的浓度分别为110-5，510-5，610-5，710-5，810-5，910-5mol/L。

从图5可以得出结论，随时着浓度的增加，CTMAB乙醇溶液的RLS信号增强。

在910-5mol/L达到最大值，并且从810-5mol/L发生了较大有突跃。

从图5中还可以看出，共振光散射峰最大的波长在607.8nm处，同时，在760.9nm和401.6nm都出现了一个峰，变化趋势都是随着CTMAB-乙醇体系浓度的增加而使得它们所表现出来的RLS信号增强。

最明显的是401.6nm的峰，从110-5mol/L处平坦到910-5mol/L处一个大峰的变化，可以看出，CTMAB-乙醇体系发生了明显的变化。

结合图6可知，CTMAB在乙醇溶液中的CMC=810-5mol/L，所以在该浓度处发生了RLS信号的突变和910-5mol/L浓度的CTMAB多出了一个明显的峰，正是胶束形成的有力证据。

为什么会在401.6nm表现出较强的RLS信号强度？

这是因为胶束的散射光强度与入射光波长的4次方成反比，即波长越短的光越容易被散射。

而胶束自始至终，都是一个同步发光体。

245pH对十二烷基磺酸钠SDBS的影响在缝宽5nm，灵敏度3的实验条件下，研究了BR缓冲液pH=3、4、5、6对5.010-3mol/LSDBS的影响。

图7BR缓冲液对SDBS的影响。

从上到下，分别是pH=3，4，5，6时的RLS信号。

从图7可以看出，随着BR缓冲液酸性的减弱，SDBS的RLS信号减弱。

这表明酸性环境有利于SDBS间的相互作用。

但是根据前面的实验，5.010-3mol/LSDBS的测量是在缝宽5nm、灵敏度2的实验条件下测定的。

而本实验是在缝宽5nm，灵敏度3的实验条件下进行的。

由此可知，酸性环境在一定程度上酸性的增强有利于SDBS的团聚结合，但是仍然是抑制SDBS的团聚结合的。

这是因为酸性条件下一方面SDBS的团聚结合受到抑制，另一方面酸性环境有利于SDBS胶束的稳定。

本实验中RLS信号最强处的波长为606.3nm，