Mega的使用以及进化树的绘制.docx
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Mega的使用以及进化树的绘制
1.MEGA构建系统进化树的步骤
2.CLUSTALX进行序列比对
1.MEGA构建系统进化树的步骤
1.将要用于构建系统进化树的所有序列合并到同一个fasta格式文件，注意：
所有序列的方向都要保持一致（5’-3’）。
如图：
2.打开MEGA软件，选择"Alignment"-"AlignmentExplorer/CLUSTAL"，在对话框中选择Retrievesequencesfromafile,然后点OK，找到准备好的序列文件并打开，如图：
。
3.在打开的窗口中选择”Alignment”-“AlignbyClustalX”进行对齐，对齐过程需要一段时间，对齐完成后，最好将序列两端切齐，选择两端不齐的部分，单击右键，选择delete即可，如图：
。
4.关闭当前窗口，关闭的时候会提示两次否保存，第一次无所谓，保存不保存都可以，第二次一定要保存，保存的文件格式是.meg。
根据提示输入Title，然后会出现一个对话框询问是否是Protein-codingnucleotidesequencedata,根据情况选择Yes或No。
最后出现一个对话框询问是否打开，选择Yes，如图：
。
5.回到MEGA主窗口，在菜单栏中选择”Phylogeny”-“BootstrapTestofPhylogeny”-“Neighbor-joining”，打开一个窗口，里面有很多参数可以设置，如何设置这些参数请参考详细的MEGA说明书，不会设置就暂且使用默认值，不要修改，点击下面的Compute按钮，系统进化树就画出来了，如图：
在菜单栏中选择”Phylogeny”-“BootstrapTestofPhylogeny”–“Minimun-evolution”,如图：
在菜单栏中选择”Phylogeny”-“BootstrapTestofPhylogeny”–“Maximun-parsimony”,如图：
在菜单栏中选择”Phylogeny”-“BootstrapTestofPhylogeny”–“UPGMA”，
如图：
6.最后，使用TreeExplorer窗口中提供的一些功能可以对生成的系统进化树进行调整和美化。
CLUSTALX进行序列比对
1.将下载的序列放入一个Text文本文档中，序列按一定的格式，
>pig
AGAGACGGCCGCATCTTCTTGTGCAGTGCCAGCCTCGTCCCGTAGACAAAATGGTGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGGCCGTATTGGGCGCCTGGTCACCAGGGCTGCCATTTGCAGTGGCAAAGTGGAGATTGTTGCCATCAA的格式复制过来，放在一个文本文档里。
注意：
CLustal1.83分析出了全序列比对，彩色比对区上门的*越多，表示这段序列越保守
2.在sequence载入序列,如图所示
3.Alignment进行全序列比对--
4.点击align
5.
在桌面上即可生成aln格式的文本文档（用于下面Mega5.02进行进化树构建）
Mega5.02序列比对和建进化树
序列比对
1.用文本格式的序列数据进行比对
2.Align---editalignment即新建一个数据---0k---DNA
3.
Edit--insertsequencefrom选择文本文档
4.Alignent---AlignbyciustW--ok---关闭序列比对--并保存在桌面上---Phylogeny--MAX
5.两种不同的方法最大释然和邻近法
邻近法更准确
建进化树
1.tomega
2.
3.点击文件夹从桌面载入aln格式的文本文档
4.
5.点击OK，再命名
6.
7.
8.关闭窗口
9.点击OK
10.phylogen--textneighbor-joiningtree-或者Maximum的方式进行构建--从桌面上选择刚命名的文件
11.
点击打开
12.
13.
14.点击Yes
15.
16.
17.将Testphylogery中的None改成如图
18.
19.
20.进化树就构建成功--点击横线进行细节修改
21.
22.点击左边第五个蓝色的图标
进行细节修改
23.可以双击分类后的名称，进行名称修改，如
Primer5设计引物
1.sequence
2.将序列复制过来（序列的格式必须是文本格式）--asis--OK
3.点击Primer
4.点击S--
5.一般将长度设置为20，然后根据需要可以适当提到21或者降到19
Length设置为20
点击OK
6.Search
7.type--both-PCRsize100-1000--primerlength25-5--OK
、
点击OK
8.选择打分高的，且退火温度在55℃左右的温度。
9.可通过手动调节上面的序列，使得二者的打分最高，如退火温度较高，则可以把序列长度降低一点，如19，点击EditPrimer--可以把引物序列复制下来
引物的基本原则
1.引物的长度18-28，不能太长。
引物越长特征性高，要求的退火温度越高，但是扩张效率较低，容易形成引物二聚体。
2.G、C的含量在45-55%左右，但有时也可能比较高或者比较低，不是很重要，45-55%的范围只是最好的。
G、C含量高，退火温度高。
3.3’端是最重要的，是起始阶段。
最好是A、T、C、G随机均一分布，不能集中的分布；特别3‘端前段最好不要连续3个以上的G、C出现，不能很好的促发反应，只要3’端的前10个碱基结合得好就行。
5‘不是很重要，可以很多不配对。
实际上3‘端连续出现G/C但是效果也比较好。
GCCTCGTCCCGTAGACAAAAT
CCAGGGGGGCTAAGCAGTT
10.
11.外套和内套的设计使得特异性更高
要没有falsepriming
打分不一定都要100分
退火温度在55度以上都行
内套序列必须位于外套内
设计外套228-818senseCACGGCAAGTTCAACGGCAC
Anti-SenseTTTCTCCAGGCGGCAGGTCAG
设计内套310-585
SenseCTGCCAACATCAAGTGGGGTG
Anti-senseGTCCCTCCACGATGCCAAAG
一般先用外套引物进行扩增，再用内套引物扩增。
12.设计交叉序列的引物（温度相差不超过5度）
注意;这两个引物必须包括整个序列的90%以上的序列。
31-944
SensseCCGTAACTTCTGTGCTGTGCCA
AntisenseAGAAGAGTGAGTGTCGCTGTTGAAGT
226-1029
SenseGCAAGTTCAACGGCACAGTCAA
Anti-senseTGCTGTAGCCAAATTCATTGTCGTA
13.双重PCR设计同时进行两个PCR扩增两对引物之间碱基序列相差100左右
31-24763.5-63.5100分
SenseCCGTAACTTCTGTGCTGTGCCA
Anti-senseTTGACTGTGCCGTTGAACTTGC
311-62887分62.1-62.4
SenseTGCCAACATCAAGTGGGGTG
Anti-senseACAGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT
14.上游引物试剂盒已知的：
如规定退火温度在73.2℃，则设计下游引物序列的温度在73℃左右，最好一样，不能超过或者少于2℃，可以改变引物长度提高退火温度，但是最高不能超过26
外套位点464
Anti-senseCATCACAAACATGGGGGCATCGGC
内套位点101
Anti-senseGCCGAATCCGTTCACTCCGACCTT
注意：
关键不能错配，如果有错配可以看下错配的位点，如果和引物是反向不相交的，则不需考虑。
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