柴胡疏肝散对慢性应激抑郁模型大鼠行为及血浆促肾上腺皮质激素释放激素和促肾上腺皮质激素的影响.docx

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柴胡疏肝散对慢性应激抑郁模型大鼠行为及血浆促肾上腺皮质激素释放激素和促肾上腺皮质激素的影响

柴胡疏肝散对慢性应激抑郁模型大鼠行为及血浆促肾上腺皮质激素释放激素和促肾上腺皮质激素的影响

（作者:

___________单位:

___________邮编:

___________）

作者：

李云辉,张春虎,王素娥,邱娟,胡随瑜,肖桂林【摘要】目的：

探讨柴胡疏肝散对慢性应激抑郁模型大鼠行为学及血浆促肾上腺皮质激素释放激素（corticotropinreleasinghormone，CRH）和促肾上腺皮质激素（adrenocorticotropichormone，ACTH）浓度的影响。

方法：

40只雄性SD大鼠随机分为空白对照组、模型组、氟西汀组及柴胡疏肝散组。

采用慢性轻度不可预见性应激加孤养复制大鼠抑郁模型（4周）。

所有大鼠在造模第15天开始灌胃，分别灌服等体积生理盐水（空白对照组、模型组）或氟西汀（1.8mg/kg）及柴胡疏肝散（5.9g/kg）药液，连续2周。

选用敞箱实验得分和液体消耗量等指标评价各组大鼠行为学改变，采用放射免疫法检测各组血浆CRH和ACTH浓度。

结果：

与空白对照组比，模型组大鼠体质量增加缓慢，敞箱实验中的水平运动、垂直运动得分、清洁动作次数显著减少，中央格停留时间显著延长，糖水消耗明显下降，纯水消耗显著增多，血浆CRH和ACTH浓度增高,差异有统计学意义（P＜0.05）。

柴胡疏肝散组大鼠抑郁样行为显著改善，血浆CRH和ACTH浓度较模型组显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。

结论：

慢性轻度不可预见性应激可使大鼠行为及神经内分泌发生异常改变，引起抑郁；柴胡疏肝散可调节慢性应激引起的HPA轴功能亢进，具有抗抑郁作用。

【关键词】柴胡疏肝散;抑郁;慢性应激;神经行为学表现;促肾上腺皮质激素释放激素;促肾上腺皮质激素;大鼠　　Objective:

ToinvestigatetheeffectsofChaihuShuganSan（CHSGS）,acompoundtraditionalChineseherbalmedicine,onbehaviorandplasmalevelsofcorticotropinreleasinghormone（CRH）andadrenocorticotropichormone（ACTH）ofratswithchronicmildunpredictedstressdepression.　　Methods:

FortymaleSpragueDawleyratswererandomlydividedinto4groups:

normalcontrolgroup,untreatedgroup,fluoxetinegroupandCHSGSgroup.Exceptthenormalcontrolgroup,ratsweresinglyhousedandexposedtoanunpredictedsequenceofmildstressorforcontinuous4weekstoinducedepression.Sincethefifteenthday,ratswereintragastricallyadministeredwithequalvolumeagentsrespectivelyfor2weeks［normalsalineforthenormalcontrolgroupandtheuntreatedgroup,fluoxetine（1.8mg/kg）forthefluoxetinegroupandCHSGS（5.9g/kg）fortheCHSGSgroup］.Behavioralscoresofratsweredetectedbyopenfieldtestandsucrosepreferencetest,andtheplasmalevelsofCRHandACTHindifferentgroupsweredetectedbyradioimmunoassay.　　Results:

Comparedwiththenormalcontrolgroup,bodyweightsoftheratsintheuntreatedgroupweresignificantlydecreased.Scoresofcrossing,rearsandgroominginopenfieldtestwerereducedsignificantly.Purewaterconsumptioninsucrosepreferencetestwasincreasedsignificantly.ThelevelsofplasmaCRHandACTHweresignificantlyincreased.ThedepressivebehaviorsoftheratswereimprovedsignificantlyandthelevelsofplasmaCRHandACTHwereobviouslyreducedintheCHSGSgroup.　　Conclusion:

Chronicmildunpredictedmildstresscanaffecttheneuroendocrineandbehaviorandcausedepressioninrats.CHSGScanregulateHPAhyperactivityofratscausedbychronicstressandhasantidepressiveeffects.　　Keywords:

ChaihuShuganSan;depression;chronicstress;neurobehavioralmanifestations;corticotropinreleasinghormone;adrenocorticotropichormone;rats　　抑郁症是最常见的心境障碍，普通人群中抑郁症的年发病率约为200/10万，且发病率呈逐年上升趋势。

据世界卫生组织估计，2020年抑郁症将成为第二大疾病［1］。

抑郁症属中医学郁病范畴，运用中医辨证论治治疗抑郁症具有明显优势。

中医证候临床流行病学调查显示，肝郁气滞证为抑郁症最常见的证候类型，居各证之首［2］。

柴胡疏肝散是治疗肝郁气滞证最具代表性的经典方之一，全方具有疏肝行气、活血止痛的功效。

临床研究表明柴胡疏肝散治疗抑郁症具有良好的效果［3，4］。

慢性应激可以引起人类及动物的下丘脑垂体肾上腺皮质（hypothalamicpituitaryadrenocortical，HPA）轴功能亢进，且出现抑郁状态［5］。

本实验通过采用慢性轻度不可预见性应激与孤养相结合的方法，研究柴胡疏肝散对慢性应激抑郁模型大鼠行为及促肾上腺皮质激素释放激素（corticotropinreleasinghormone，CRH）和促肾上腺皮质激素（adrenocorticotropichormone，ACTH）的影响，旨在探讨柴胡疏肝散抗抑郁的作用机制。

　　1材料与方法　　1.1实验材料　　1.1.1实验动物筛选行为学指标相近的SD雄性成年大鼠40只，体质量（200±20）g，由中南大学实验动物学部提供，合格证号为SCXX（湘）4343232。

自由饮食，光/暗周期为12h/12h（光照时间6∶00～18∶00），背景噪音（40±10）dB，温度（20±3）℃。

　　　　1.1.2主要药物及试剂柴胡疏肝散处方及方中各组成中药剂量按中华人民共和国药典2005年版一部常规用量（柴胡9g、陈皮9g、川芎9g、香附9g、枳壳9g、芍药15g、甘草5g），药材均由湘雅医院药剂科统一购买，饮片经专家鉴定，符合药典一部要求。

煎煮、浓缩、真空干燥，制成干膏，每克含生药量8g，用时配制成1.0g/mL的药液。

由湘雅医院药剂科制剂室负责完成。

盐酸氟西汀胶囊，由礼来苏州制药有限公司提供，20mg/粒，批准文号为国药准字J20080016。

CRH和ACTH放射免疫分析试剂盒，由上海泛柯生物科技有限公司提供。

　　1.1.3主要仪器低温高速离心机，美国Sigma公司生产；GC911γ放射免疫计数器，中国科技大学实业总公司生产；自制敞箱。

　　1.2实验方法　　1.2.1动物分组实验前用敞箱实验（openfieldtest,OFT）法对每只大鼠进行行为学评分，选择各项行为学指标得分相近的40只大鼠，适应环境饲养1周后，随机分为空白对照组、模型组、氟西汀组和柴胡疏肝散组，每组10只。

组间体质量及OFT评分比较，差异无统计学意义。

　　1.2.2模型复制及灌胃空白对照组大鼠正常条件饲养，其余各组用于造模，参照文献方法［6，7］并加以改进。

每笼1只孤养，共接受28d随机的应激，包括电击足底（电流强度10mA，每隔1分钟刺激1次，每次持续10s，共30次）、冰水游泳（4℃，5min）、热应激（45℃，5min）、摇晃（1次/s，15min）、夹尾（1min）、禁水（24h）、禁食（48h）和昼夜颠倒等刺激，每日给予1种刺激，使大鼠不能预料刺激的发生，以避免发生适应性。

空白对照组、模型组灌服等体积蒸馏水，每天1次，连续14d；柴胡疏肝散组大鼠灌服柴胡疏肝散药液，剂量为生药5.9g/kg（临床用量按体表面积折算），每天1次，连续14d；氟西汀组灌服氟西汀药液，剂量为1.8mg/kg，为70kg成人常规临床用药的等效量，每天1次，连续14d治疗。

各组灌胃时间均为慢性应激第15天至造模结束当天上午9∶00，连续灌胃14d。

　　1.2.3行为学观察　　1.2.3.1体质量观察分别于实验第0、15和29天称取大鼠体质量。

　　1.2.3.2敞箱实验参照文献方法［8］并改进，分别于实验第0、15和29天进行3次。

实验所用的敞箱装置由木材制成，底面为100cm×100cm的正方形且被等分为25个等边方格，周围为高40cm的木墙，内由黑色漆料涂满。

上午7∶00～9∶00之间在安静的房间内进行敞箱实验。

将大鼠放入中心方格内，固定数码摄影机于敞箱上方（以排除人为干扰因素），自动记录3min内大鼠在中央格的停留时间、穿越格数（四爪均进入的方格才记数，为水平运动得分）、后肢直立次数（两前爪腾空或攀附墙壁，为垂直运动得分）、清洁运动记数。

彻底清洁敞箱后再进行下一次观察。

　　1.2.3.3液体消耗实验参照文献方法［6］，实验在安静的房间内，在每次敞箱实验前72h进行。

在第一个24h，每笼同时放置两个水瓶，两瓶均装有1％蔗糖水；第二个24h，一瓶装1%蔗糖水，一瓶装纯水；禁食禁水24h后，进行基础消耗和纯水消耗实验，同时给予每只大鼠事先定量好的两瓶水，一瓶1%蔗糖水，一瓶纯水。

60min后，取两瓶水定量，计算大鼠的总液体消耗、糖水消耗和纯水消耗量。

　　1.2.4标本采集及指标测定实验第29天，将所有大鼠颈椎迅速脱臼，然后开胸从左心房抽取5mL血，2mL注入含30μL10%EDTA·Na2和20μL抑肽酶的试管中（待测ACTH），另外3mL注入含肝素钠40μL的试管中（待测CRH），混匀，4℃下3000r/min离心10min，分离血浆，移至一新Ep管内，置于－70℃低温冰箱中保存。

测定均严格按照试剂盒说明书进行操作。

　　1.3统计学方法计量资料数据用x±s表示，同一指标不同时间点比较采用重复测量的方差分析，两组间比较用最小显著差异法，所有资料采用SPSS15.0统计软件完成。

检验水准α=0.05。

　　2结果　　2.1造模前及治疗前后各组大鼠行为学及体质量各组动物在造模前行为学指标及体质量组间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性，见表1。

各组大鼠经过14d的轻度不可预见性应激后，均有不同程度的抑郁样改变。

敞箱实验中模型组、氟西汀组及柴胡疏肝散组水平得分、垂直得分显著降低，中央格停留时间明显增加，糖水消耗减少，体质量增加缓慢，与空白对照组比，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。

各组大鼠经过14d的灌胃处理后，氟西汀组、柴胡疏肝散组大鼠的抑郁样行为得到显著改善，敞箱实验中氟西汀组及柴胡疏肝散组水平得分、垂直得分显著提高，中央格停留时间明显缩短，糖水消耗增加，体质量增加明显，与模型组相比，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。

　　表1造模前及治疗前后各组大鼠行为学及体质量（略）　　Table1Behaviorsandbodyweightbeforeduplicatingmodelandpretherapyandposttherapyinrats　　GHSGS:

ChaihuShuganSan.*P＜0.05,**P＜0.01,vsnormalcontrolgroup;△△P＜0.01,vsuntreatedgroup.　　2.2治疗后各组大鼠血浆CRH及ACTH浓度比较治疗后各组血浆CRH和ACTH含量比较，差异有统计学意义（P0.01）。

模型组大鼠血浆CRH和ACTH的含量均高于空白对照组，差异有统计学意义（P0.01）。

柴胡疏肝散组大鼠血浆CRH和ACTH含量低于模型组，差异有统计学意义（P0.01）。

见表2。

　　表2治疗后各组大鼠血浆CRH和ACTH比较（略）　　Table2ComparisonofthelevelsofCRHandACTHinplasmainposttreatmentrats　　GHSGS:

ChaihuShuganSan.**P＜0.01,vsnormalcontrolgroup;△△P＜0.01,vsuntreatedgroup.　　3讨论　　抑郁症的年发病率呈逐年上升趋势，已成为威胁人类健康的第四大疾病，属中医“郁证”、“癫”的范畴。

多由情志不舒，肝气郁结而引起五脏气机不和。

《证治汇补·郁证》说：

“郁病虽多，皆因气不周流，法当顺气为先……”指出郁证初病体实，病变以气滞为主，病位多在肝；七情内伤久郁，始而伤气，继必及血；治疗以疏通气机为原则。

柴胡疏肝散始载于明·张介宾《景岳全书·古方八阵》卷五十六，是治肝郁气滞证的代表方之一。

方中柴胡、枳壳、香附和陈皮疏肝解郁，理气畅中；川芎、白芍和甘草活血定痛，柔肝缓急。

肝气郁结日久，由气分累及血分，血行不畅而致血瘀。

方中配伍活血化瘀之品，能加强理气药行气解郁之功效。

临床研究表明柴胡疏肝散治疗抑郁症具有良好的效果［9］。

　　慢性轻度不可预见应激模型是目前国内外通用的抑郁动物模型，该模型不仅可模拟抑郁症的核心症状，即兴趣丧失，快感缺乏，运动能力、探索行为能力及性行为能力等下降；同时存在HPA轴的亢奋，其抑郁状态持续时间长，符合实验研究的要求。

该模型目前已被国内外学者广泛应用于抑郁症的发病及抗抑郁药作用机制研究［6，8，10］。

本实验选择28d的慢性应激加孤养复制抑郁大鼠模型，实验中可见模型组大鼠体质量增加减慢，敞箱实验中水平得分、垂直得分及清洁次数均较空白对照组明显减少，中央格停留时间延长，糖水消耗量降低，提示模型组动物食欲减退，活动能力下降，兴趣丧失，快感缺乏。

经过抗抑郁剂氟西汀治疗后上述症状明显改善，证明大鼠抑郁模型复制成功。

　　应激导致HPA轴被激活，肾上腺分泌的糖皮质激素有利于机体度过短期恶劣环境。

但若机体长期处于应激状态，HPA轴功能持续亢进，必将严重影响机体健康，使机体出现抑郁症状［5］。

研究显示，抑郁症患者血浆ACTH和CRH浓度均升高，而经抗抑郁治疗后，随着抑郁程度的缓解两者浓度下降［11］。

海马是HPA轴应激反应的高位调节中枢，海马内含有较高密度的糖皮质激素受体，长期过量的糖皮质激素使海马神经元萎缩死亡，而海马神经元的损害将打断正常应激反应时海马对HPA轴的抑制作用而形成恶性循环［5］。

本实验提示，模型组大鼠血浆CRH和ACTH含量较空白对照组显著升高，表明应激可导致HPA轴功能的紊乱。

　　针对抑郁症常见病证特征，本研究选用柴胡疏肝散处理慢性应激抑郁模型大鼠，结果显示柴胡疏肝散能够显著增加慢性应激抑郁大鼠体质量，增加其在敞箱实验中的水平运动、垂直运动得分和清洁动作次数，减少中央格停留时间，显著提高糖水消耗，而且使抑郁模型大鼠血浆CRH和ACTH含量趋于正常。

这为柴胡疏肝散治疗抑郁症提供了药效学依据，我们将继续研究柴胡疏肝散对抑郁模型大鼠海马神经元的发生及超微结构的影响，从而探讨柴胡疏肝散的抗抑郁作用机制。

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