柴胡疏肝散对慢性应激抑郁模型大鼠行为及血浆促肾上腺皮质激素释放激素和促肾上腺皮质激素的影响.docx

1、柴胡疏肝散对慢性应激抑郁模型大鼠行为及血浆促肾上腺皮质激素释放激素和促肾上腺皮质激素的影响柴胡疏肝散对慢性应激抑郁模型大鼠行为及血浆促肾上腺皮质激素释放激素和促肾上腺皮质激素的影响（作者:_单位: _邮编: _） 作者：李云辉, 张春虎, 王素娥, 邱娟, 胡随瑜, 肖桂林【摘要】 目的：探讨柴胡疏肝散对慢性应激抑郁模型大鼠行为学及血浆促肾上腺皮质激素释放激素（corticotropin releasing hormone，CRH）和促肾上腺皮质激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）浓度的影响。方法：40只雄性SD大鼠随机分为空白对照组、模型组、氟西汀组及柴胡

2、疏肝散组。采用慢性轻度不可预见性应激加孤养复制大鼠抑郁模型（4周）。所有大鼠在造模第15天开始灌胃，分别灌服等体积生理盐水（空白对照组、模型组）或氟西汀（1.8 mg/kg）及柴胡疏肝散（5.9 g/kg）药液，连续2周。选用敞箱实验得分和液体消耗量等指标评价各组大鼠行为学改变，采用放射免疫法检测各组血浆CRH和ACTH浓度。结果：与空白对照组比，模型组大鼠体质量增加缓慢，敞箱实验中的水平运动、垂直运动得分、清洁动作次数显著减少，中央格停留时间显著延长，糖水消耗明显下降，纯水消耗显著增多，血浆CRH和ACTH浓度增高, 差异有统计学意义（P0.05）。柴胡疏肝散组大鼠抑郁样行为显著改善，血浆C

3、RH和ACTH浓度较模型组显著降低，差异有统计学意义（P0.01）。结论：慢性轻度不可预见性应激可使大鼠行为及神经内分泌发生异常改变，引起抑郁；柴胡疏肝散可调节慢性应激引起的HPA轴功能亢进，具有抗抑郁作用。 【关键词】 柴胡疏肝散; 抑郁; 慢性应激; 神经行为学表现; 促肾上腺皮质激素释放激素; 促肾上腺皮质激素; 大鼠Objective: To investigate the effects of Chaihu Shugan San (CHSGS), a compound traditional Chinese herbal medicine, on behavior and plasm

4、a levels of corticotropin releasing hormone (CRH) and adrenocorticotropic hormone (ACTH) of rats with chronic mild unpredicted stress depression.Methods: Forty male Sprague Dawley rats were randomly divided into 4 groups: normal control group, untreated group, fluoxetine group and CHSGS group. Excep

5、t the normal control group, rats were singly housed and exposed to an unpredicted sequence of mild stressor for continuous 4 weeks to induce depression. Since the fifteenth day, rats were intragastrically administered with equal volume agents respectively for 2 weeks normal saline for the normal con

6、trol group and the untreated group, fluoxetine (1.8 mg/kg) for the fluoxetine group and CHSGS (5.9 g/kg) for the CHSGS group. Behavioral scores of rats were detected by open field test and sucrose preference test, and the plasma levels of CRH and ACTH in different groups were detected by radioimmuno

7、assay.Results: Compared with the normal control group, body weights of the rats in the untreated group were significantly decreased. Scores of crossing, rears and grooming in open field test were reduced significantly. Pure water consumption in sucrose preference test was increased significantly. Th

8、e levels of plasma CRH and ACTH were significantly increased. The depressive behaviors of the rats were improved significantly and the levels of plasma CRH and ACTH were obviously reduced in the CHSGS group.Conclusion: Chronic mild unpredicted mild stress can affect the neuroendocrine and behavior a

9、nd cause depression in rats. CHSGS can regulate HPA hyperactivity of rats caused by chronic stress and has antidepressive effects.Keywords: Chaihu Shugan San; depression; chronic stress; neurobehavioral manifestations; corticotropin releasing hormone; adrenocorticotropic hormone; rats抑郁症是最常见的心境障碍，普通

10、人群中抑郁症的年发病率约为200/10万，且发病率呈逐年上升趋势。据世界卫生组织估计，2020年抑郁症将成为第二大疾病1。抑郁症属中医学郁病范畴，运用中医辨证论治治疗抑郁症具有明显优势。中医证候临床流行病学调查显示，肝郁气滞证为抑郁症最常见的证候类型，居各证之首2。柴胡疏肝散是治疗肝郁气滞证最具代表性的经典方之一，全方具有疏肝行气、活血止痛的功效。临床研究表明柴胡疏肝散治疗抑郁症具有良好的效果3，4。慢性应激可以引起人类及动物的下丘脑 垂体 肾上腺皮质（hypothalamic pituitary adrenocortical，HPA）轴功能亢进，且出现抑郁状态5。本实验通过采用慢性轻度不可预

11、见性应激与孤养相结合的方法，研究柴胡疏肝散对慢性应激抑郁模型大鼠行为及促肾上腺皮质激素释放激素（corticotropin releasing hormone，CRH）和促肾上腺皮质激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）的影响，旨在探讨柴胡疏肝散抗抑郁的作用机制。1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 实验动物 筛选行为学指标相近的SD雄性成年大鼠40只，体质量（20020）g，由中南大学实验动物学部提供，合格证号为SCXX(湘)4343232。自由饮食，光/暗周期为12 h/12 h(光照时间6001800)，背景噪音（4010）dB，温度（203）。 1

12、.1.2 主要药物及试剂 柴胡疏肝散处方及方中各组成中药剂量按中华人民共和国药典2005年版一部常规用量（柴胡9 g、陈皮9 g、川芎9 g、香附9 g、枳壳9 g、芍药15 g、甘草5 g），药材均由湘雅医院药剂科统一购买，饮片经专家鉴定，符合药典一部要求。煎煮、浓缩、真空干燥，制成干膏，每克含生药量8 g，用时配制成1.0 g/mL的药液。由湘雅医院药剂科制剂室负责完成。盐酸氟西汀胶囊，由礼来苏州制药有限公司提供，20 mg/粒，批准文号为国药准字J20080016。CRH和ACTH放射免疫分析试剂盒，由上海泛柯生物科技有限公司提供。1.1.3 主要仪器 低温高速离心机，美国Sigma公司

13、生产；GC 911 放射免疫计数器，中国科技大学实业总公司生产；自制敞箱。1.2 实验方法1.2.1 动物分组 实验前用敞箱实验（open field test, OFT）法对每只大鼠进行行为学评分，选择各项行为学指标得分相近的40只大鼠，适应环境饲养1周后，随机分为空白对照组、模型组、氟西汀组和柴胡疏肝散组，每组10只。组间体质量及OFT评分比较，差异无统计学意义。1.2.2 模型复制及灌胃 空白对照组大鼠正常条件饲养，其余各组用于造模，参照文献方法6，7并加以改进。每笼1只孤养，共接受28 d随机的应激，包括电击足底（电流强度10 mA，每隔1分钟刺激1次，每次持续10 s，共30次）、冰

14、水游泳（4 ，5 min）、热应激（45 ，5 min）、摇晃（1次/s，15 min）、夹尾（1 min）、禁水（24 h）、禁食（48 h）和昼夜颠倒等刺激，每日给予1种刺激，使大鼠不能预料刺激的发生，以避免发生适应性。空白对照组、模型组灌服等体积蒸馏水，每天1次，连续14 d；柴胡疏肝散组大鼠灌服柴胡疏肝散药液，剂量为生药5.9 g/kg（临床用量按体表面积折算），每天1次，连续14 d；氟西汀组灌服氟西汀药液，剂量为1.8 mg/kg，为70 kg成人常规临床用药的等效量，每天1次，连续14 d治疗。各组灌胃时间均为慢性应激第15天至造模结束当天上午900，连续灌胃14 d。1.2.3

15、 行为学观察1.2.3.1 体质量观察 分别于实验第0、15和29天称取大鼠体质量。1.2.3.2 敞箱实验 参照文献方法8并改进，分别于实验第0、15和29天进行3次。实验所用的敞箱装置由木材制成，底面为100 cm100 cm的正方形且被等分为25个等边方格，周围为高40 cm的木墙，内由黑色漆料涂满。上午700900之间在安静的房间内进行敞箱实验。将大鼠放入中心方格内，固定数码摄影机于敞箱上方（以排除人为干扰因素），自动记录3 min内大鼠在中央格的停留时间、穿越格数（四爪均进入的方格才记数，为水平运动得分）、后肢直立次数（两前爪腾空或攀附墙壁，为垂直运动得分）、清洁运动记数。彻底清洁敞

16、箱后再进行下一次观察。1.2.3.3 液体消耗实验 参照文献方法6，实验在安静的房间内，在每次敞箱实验前72 h进行。在第一个24 h，每笼同时放置两个水瓶，两瓶均装有1蔗糖水；第二个24 h，一瓶装1%蔗糖水，一瓶装纯水；禁食禁水24 h后，进行基础消耗和纯水消耗实验，同时给予每只大鼠事先定量好的两瓶水，一瓶1%蔗糖水，一瓶纯水。60 min后，取两瓶水定量，计算大鼠的总液体消耗、糖水消耗和纯水消耗量。1.2.4 标本采集及指标测定 实验第29天，将所有大鼠颈椎迅速脱臼，然后开胸从左心房抽取5 mL血，2 mL注入含30 L 10% EDTANa2和20 L抑肽酶的试管中(待测ACTH)，另

17、外3 mL注入含肝素钠40 L的试管中（待测CRH），混匀，4 下3 000 r/min离心10 min，分离血浆，移至一新Ep管内，置于70 低温冰箱中保存。测定均严格按照试剂盒说明书进行操作。1.3 统计学方法 计量资料数据用xs表示，同一指标不同时间点比较采用重复测量的方差分析，两组间比较用最小显著差异法，所有资料采用SPSS 15.0统计软件完成。检验水准=0.05。 2 结果2.1 造模前及治疗前后各组大鼠行为学及体质量 各组动物在造模前行为学指标及体质量组间比较，差异均无统计学意义（P0.05），具有可比性，见表1。各组大鼠经过14 d的轻度不可预见性应激后，均有不同程度的抑郁样改

18、变。敞箱实验中模型组、氟西汀组及柴胡疏肝散组水平得分、垂直得分显著降低，中央格停留时间明显增加，糖水消耗减少，体质量增加缓慢，与空白对照组比，差异有统计学意义（P0.05，P0.01）。各组大鼠经过14 d的灌胃处理后，氟西汀组、柴胡疏肝散组大鼠的抑郁样行为得到显著改善，敞箱实验中氟西汀组及柴胡疏肝散组水平得分、垂直得分显著提高，中央格停留时间明显缩短，糖水消耗增加，体质量增加明显，与模型组相比，差异有统计学意义（P0.05，P0.01）。表1 造模前及治疗前后各组大鼠行为学及体质量（略）Table 1 Behaviors and body weight before duplicating

19、model and pretherapy and post therapy in ratsGHSGS: Chaihu Shugan San. *P0.05, *P0.01, vs normal control group; P0.01, vs untreated group.2.2 治疗后各组大鼠血浆CRH及ACTH浓度比较 治疗后各组血浆CRH和ACTH含量比较，差异有统计学意义（P0.01）。模型组大鼠血浆CRH和ACTH的含量均高于空白对照组，差异有统计学意义（P0.01）。柴胡疏肝散组大鼠血浆CRH和ACTH含量低于模型组，差异有统计学意义（P0.01）。见表2。表2 治疗后各组大鼠血

20、浆CRH和ACTH比较（略）Table 2 Comparison of the levels of CRH and ACTH in plasma in post treatment ratsGHSGS: Chaihu Shugan San. *P0.01, vs normal control group; P0.01, vs untreated group.3 讨论 抑郁症的年发病率呈逐年上升趋势，已成为威胁人类健康的第四大疾病，属中医“郁证”、“癫”的范畴。多由情志不舒，肝气郁结而引起五脏气机不和。证治汇补郁证说：“郁病虽多，皆因气不周流，法当顺气为先”指出郁证初病体实，病变以气滞为主，病位

21、多在肝；七情内伤久郁，始而伤气，继必及血；治疗以疏通气机为原则。柴胡疏肝散始载于明张介宾景岳全书古方八阵卷五十六，是治肝郁气滞证的代表方之一。方中柴胡、枳壳、香附和陈皮疏肝解郁，理气畅中；川芎、白芍和甘草活血定痛，柔肝缓急。肝气郁结日久，由气分累及血分，血行不畅而致血瘀。方中配伍活血化瘀之品，能加强理气药行气解郁之功效。临床研究表明柴胡疏肝散治疗抑郁症具有良好的效果9。 慢性轻度不可预见应激模型是目前国内外通用的抑郁动物模型，该模型不仅可模拟抑郁症的核心症状，即兴趣丧失，快感缺乏，运动能力、探索行为能力及性行为能力等下降；同时存在HPA轴的亢奋，其抑郁状态持续时间长，符合实验研究的要求。该模型

22、目前已被国内外学者广泛应用于抑郁症的发病及抗抑郁药作用机制研究6，8，10。本实验选择28 d的慢性应激加孤养复制抑郁大鼠模型，实验中可见模型组大鼠体质量增加减慢，敞箱实验中水平得分、垂直得分及清洁次数均较空白对照组明显减少，中央格停留时间延长，糖水消耗量降低，提示模型组动物食欲减退，活动能力下降，兴趣丧失，快感缺乏。经过抗抑郁剂氟西汀治疗后上述症状明显改善，证明大鼠抑郁模型复制成功。 应激导致HPA轴被激活，肾上腺分泌的糖皮质激素有利于机体度过短期恶劣环境。但若机体长期处于应激状态，HPA轴功能持续亢进，必将严重影响机体健康，使机体出现抑郁症状5。研究显示，抑郁症患者血浆ACTH和CRH浓度

23、均升高，而经抗抑郁治疗后，随着抑郁程度的缓解两者浓度下降11。海马是HPA轴应激反应的高位调节中枢，海马内含有较高密度的糖皮质激素受体，长期过量的糖皮质激素使海马神经元萎缩死亡，而海马神经元的损害将打断正常应激反应时海马对HPA轴的抑制作用而形成恶性循环5。本实验提示，模型组大鼠血浆CRH和ACTH含量较空白对照组显著升高，表明应激可导致HPA轴功能的紊乱。 针对抑郁症常见病证特征，本研究选用柴胡疏肝散处理慢性应激抑郁模型大鼠，结果显示柴胡疏肝散能够显著增加慢性应激抑郁大鼠体质量，增加其在敞箱实验中的水平运动、垂直运动得分和清洁动作次数，减少中央格停留时间，显著提高糖水消耗，而且使抑郁模型大鼠

24、血浆CRH和ACTH含量趋于正常。这为柴胡疏肝散治疗抑郁症提供了药效学依据，我们将继续研究柴胡疏肝散对抑郁模型大鼠海马神经元的发生及超微结构的影响，从而探讨柴胡疏肝散的抗抑郁作用机制。【参考文献】 1 Duman RS, Kehne JH. Depression. CNS Neurol Disord Drug Targets. 2007; 6(3): 161 162. 2 Hu SY, Zhang HG, Zheng L, Zhang HN, Chen ZQ, Chen CH, Zhao ZF, Wang XB, Liu FR, Li SM, Huang XC, Feng JL, Zhang

25、J. Analysis of TCM different syndromes composition ratio in 1 977 patients with depression. Zhongguo Yi Shi Za Zhi. 2003; 5(10): 1312 1314. Chinese with abstract in English. 胡随瑜, 张宏耕, 郑林, 张海男, 陈泽奇, 陈昌华, 赵志付, 王新本, 刘发荣, 李顺民, 黄信初, 俸建林, 张捷. 1 977例抑郁症患者中医不同证候构成比分析. 中国医师杂志. 2003; 5(10): 1312 1314. 3 He XM

26、, Zhang YK. Clinical investigation of Chaihu Shugan San combined with fluoxetine for treatment of 36 patients with poststroke depression. Xin Zhong Yi. 2007; 39(10): 22 23. Chinese. 贺新民, 张益康. 柴胡疏肝散加味联合百忧解治疗中风后抑郁症36例疗效观察. 新中医. 2007; 39(10): 22 23. 4 Yan HX, Ren F, Gu J. Effects of Chaihu Shugan San o

27、n rats of liver qi depression. Zhong Yao Yao Li Yu Lin Chuang. 2006; 22(6): 5 6. Chinese. 严亨秀, 任昉, 顾健. 柴胡疏肝散对实验性肝郁证大鼠的影响. 中药药理与临床. 2006; 22(6): 5 6. 5 Szymaska M, Budziszewska B, Jaworska Feil L, Basta Kaim A, Kubera M, Le kiewicz M, Regulska M, Laso W. The effect of antidepressant drugs on the HPA

28、axis activity, glucocorticoid receptor level and FKBP51 concentration in prenatally stressed rats. Psychoneuroendocrinology. 2009; 34(6): 822 832. 6 Benelli A, Filaferro M, Bertolini A, Genedani S. Influence of sadenosly 1 methionine on chronic mild stress induced anhedonia in castrated rats. Br J P

29、harmacol. 1999; 127(3): 645 654. 7 Gr nli J, Bramham C, Murison R, Kanhema T, Fiske E, Bjorvatn B, Ursin R, Portas CM. Chronic mild stress inhibits BDNF protein expression and CREB activation in the dentate gyrus but not in the hippocampus proper. Pharmacol Biochem Behav. 2006; 85(4): 842 849. 8 Pap

30、p M, Nalepa I, Antkiewicz Michaluk L, S nchez C. Behavioural and biochemical studies of citalopram and WAY 100635 in rat chronic mild stress model. Pharmacol Biochem Behav. 2002; 72(1 2): 465 474. 9 Wei ZJ. Chaihu Shugan powder plus psychotherapy for depressive disorder: observation of 35 cases. Zho

31、ngguo Yi Yuan Yong Yao Ping Jia Yu Fen Xi. 2007; 7(5): 379 380. Chinese with abstract in English. 尉志军. 柴胡疏肝散加味配合心理治疗抑郁症35例. 中国医院用药评价与分析. 2007; 7(5): 379 380. 10 Hu SY, Zhang CH, Cao MQ, Peng GJ, Huang CY. Anti depressive effect of Baisong tablets on the chronic mild unpredicted stress depression in

32、rats. Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. 2006; 31(5): 676 681. Chinese with abstract in English. 胡随瑜, 张春虎, 曹美群, 彭贵军, 黄川原. 白松片对大鼠慢性应激抑郁模型的抗抑郁实验研究. 中南大学学报(医学版). 2006; 31(5): 676 681. 11 Meyer U, van Kampen M, Isovich E, Flgge G, Fuchs E. Chronic psychosocial stress regulates the expression of both GR and MR mRNA in the hippocampal formation of tree shrews. Hippocampus. 2001; 11(3): 329 336.