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氨基酸笔记

生化笔记

求甘氨酸等电点

•将Ka1和Ka2相乘，得：

•Ka1Ka2=[H+]2[A-]/[A+]

•等电点时，[A+]=[A-],因此：

•[H]2=Ka1Ka2，两边取负对数，得

•pI=（pKa1+pKa2）/2

•甘氨酸等电点=（2.34+9.60）/2=5.97

甘氨酸酸性强于乙酸

甘氨酸中与羧基相邻的α-NH3+基是一个强吸引电子的基团，产生一个强场效应而稳定羧基阴离子；

α-COO-基的存在影响α-NH3+的解离，甘氨酸的α-氨基的碱基明显低于乙胺。

氨基酸的解离常数可用测定滴定曲线的实验方法求得。

标准氢氧化钠溶液进行滴定，以加入的氢氧化钠的摩尔数对pH作图，则得滴定曲线B段，在pH9.60处有一个拐点。

从甘氨酸的解离公式

（2）,Ka2=[A-][H+]/[A0]可知，当滴定至甘氨酸的兼性离子有一半变成阴离子，即[A0]=[A-]时，则Ka2=[H+]，两边各取负对数得pKa2=pH，这就是曲线B段拐点处的pH9.60。

如果用标准盐酸滴定，以加入的盐酸的摩尔数对pH作图，则得滴定曲线A段，在Ph2.34处有一个拐点。

从解离公式

（1）Ka1=[A0][H+]/[A+]，当滴定至甘氨酸的兼性离子有一半变成阳离子，即[A0]=[A+]时，则Ka1=[H+]，两边各取负对数得pKa1=pH，这就是曲线B段拐点处的pH2.34。

氨基酸滴定

•向氨基酸例如甘氨酸溶液中加入过量的甲醛，用标准氢氧化钠滴定时，由于甲醛与氨基酸中的一NH2作用形成一NH·CH20H，一N（CH20H）2等羟甲基衍生物，而降低了氨基的碱性，滴定终点也移到pH9附近。

亦即酚酞指示剂的变色区域。

总结

•先解离α-COOH,随后其他-COOH；

•再解离α-NH3+,随后其他-NH3+；

•羧基解离度大于氨基

•脂肪酸的-COOH基pKa值一般4-5，脂肪胺中-NH3+基pKa值一般10-11

•二元酸（侧链不解离的中性氨基酸）：

•三元酸（酸性和碱性氨基酸）：

R基不解离的氨基酸都具有类似甘氨酸

R侧链基团不解离的氨基酸PI=（PK1+PK2）/2

（一氨基一羧基的氨基酸）

一氨基二羧基的氨基酸PI=（PK1+PKR）/2

二氨基一羧基的氨基酸PI=（PK2+PKR）/2

◆找到净电荷为零的兼性离子，将其两侧的pK求和除2即为等电点。

◆对于三级以上的电离平衡，远处的pK值与兼性离子两侧的pK值相比差别较小时，不再适用。

1.在pH10的谷氨酸溶液中，下列哪一种结构占优势？

E

A.羧基氨基都解离

B.羧基氨基都不解离

C.只α-羧基解离

D.只γ-羧基解离

E.α-羧基和γ-羧基都解离

2.氨基酸等电点时，主要以（）离子形式存在，在pH大于pI的溶液中，大部分以（）离子形式存在，在pH小于pI的溶液中，大部分以（）离子形式存在。

两性阴阳

如何计算多肽的等电点和电荷情况（不同pH情况下）？

测试题：

某氨基酸溶液中，有四种氨基酸A、B、C、D，其等电点分别为10、4、7、5，如不考虑次要因素，

1）采用阳离子交换柱并用盐浓度或pH梯度进行洗脱，将按何种顺序被洗脱？

2）采用阴离子交换柱并用盐浓度或pH梯度进行洗脱，将按何种顺序被洗脱？

3）你能用什么办法将它们分离开

答案：

1、最先流出B—D—C—A

2、最先流出A—C—D—B

蛋白质迁移取决于它的大小和形状

●变性电泳：

在电泳缓冲液、凝胶中含有十二烷基磺酸钠（SDS）；上样缓冲液中含有SDS和二硫键还原剂（如巯基乙醇，二硫苏糖醇[DTT]）,电泳前样品加热煮沸一般约5分钟。

该电泳英文缩写：

SDS-PAGE

变性电泳特点

●

（1）SDS能够与蛋白质结合，导致蛋白质变性。

不同蛋白质-SDS复合物形状相似，都呈椭圆状；

●

（2）大量SDS的负电荷使不同蛋白质本身所带电荷忽略不计，蛋白分子越大结合的SDS越多，各蛋白质-SDS复合物的电荷密度（ρ）趋于一致；

●（3）蛋白质-SDS复合物的电泳迁移率取决于蛋白质（亚基）分子量的大小。

●SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。

而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。

在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。

蛋白质测序策略

•酸解测定氨基酸含量

•拆分蛋白质成多肽链（N/C）

•断开链内二硫键

•裂解多肽链成小的片段

•测定各肽段氨基酸顺序

•Edman化学降解法（Edman，1950，FITC）

•酶降解法：

末端附件很少几个残基

•质谱法：

电喷射电离串联质谱法

•

•确定二硫键位置

•确定二硫键位置一般选用胃蛋白酶水解，因为它的专一性比较低，切点多，生成的肽段包括含有二硫桥的肽段比较小，对于后面的分离鉴定比较容易。

其次胃蛋白酶作用pH在酸性范围（大约2），有利于二硫键发生交换反应造成的麻烦。

对角线电

•泳分离进行分离，把水解后的混合肽段点到滤纸中央，在ph6.5下进行第一向电泳，肽段将按照大小及电荷的不同分离开，然后滤纸暴露在过甲酸蒸汽中，是s-s断裂，每个含二硫键的肽段被氧化成一对含磺基丙氨酸的肽。

滤纸旋转90度，进行第二向电泳。

含磺基丙氨酸的成对肽段比原来含二硫键的肽小而负电荷增加，结果偏离了对角线，肽斑用茚三酮显色确定，将未用茚三酮显色显色的肽段分别取下，进行氨基酸分析，然后与多肽链序列比较，即可推算出肽间和肽内二硫键的位置。

•

•

•利用Edman降解，一次连续测出60-70个残基序列

•Edman降解法测定顺序操作程序麻烦，工作量大

•蛋白质测序仪：

微量测序分析（5pmol）

作业：

某肽经CNBr水解得到三个肽段，这三个肽段的结构分别是：

Asn-Trp-Gly-Met,Thr-Leu-Ala,Val-Arg-Tyr-Asn-Met;用胰凝乳蛋白酶水解此肽也得到三个肽段，其中一个为四肽，用6mol/L盐酸水解此四肽只得到（Asp）2和Met三个氨基酸，试写出此肽的氨基酸排列顺序。

（胰凝乳蛋白酶断裂Phe、Trp、Tyr羧基端的肽段）

✦Invariantresidues（不变氨基酸残基/identities）:

在序列的某些位置上种类不变的氨基酸残基.

✦Variableresidues:

（可变氨基酸残基）：

在序列的某些位置上种类可变的氨基酸残基

Conservativeresidues（保守氨基酸残基/Positives）:

在序列的某些位置上，可替换的相似氨基酸残基（e.g.,Arg↔Lys,bothofwhicharepositivelycharged

同源蛋白质（2个含义）：

•在不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质；

•具有明显氨基酸序列同源的蛋白质，

例如各种脊椎动物中的氧转运蛋白—血红蛋白。

✦Ortholog（直系/垂直同源）:

指位于不同的物种间的，在物种形成过程中源自某一共同祖先的基因；这类基因通常具有相同的功能，但并非绝对；所以，当比较一对直系同源基因时，可能会发现有的已经丧失了固有的功能或者进化出了新的功能.

✦Paralog（旁系/并行同源）:

指在一个特定的基因组中（即同一物种中）由于基因复制产生的同源。

通常比较这些基因时，它们可能已经彼此具有了新的（不同）功能，也可能已经成为假基因了.

疏水作用在生理温度范围内随温度升高而加强

超过一定温度后（50-60℃）又趋减弱（水分子有序降低，疏水基团进入水中）

非极性溶剂和去污剂是破坏疏水作用，属变性剂

尿素和盐酸胍既能破坏氢键，又能破坏疏水键，属强变性剂

•某些二硫键被破坏，蛋白质生物活性丧失

•另一些二硫键与蛋白活性无关，与维持蛋白质稳定有关

肽键刚性结构

反式比顺式稳定（R基空间位阻）

脯氨酸例外（顺式）

•C-N短于平常，不能旋转

•6个原子一个平面

•O和H成为小的电偶极子

●ϕ：

绕N—Cα键旋转的角度

●ψ：

绕Cα—C键旋转的角度

●0度因位阻作用不存在

●-180o≤ϕ,ψ≤180o

•N-Cα和Cα-C键可旋转，计算ϕ和ψ值

•可允许的ϕ和ψ值：

拉氏构象图，判断结构模型正误

•针对非甘氨酸来说，如是甘氨酸（R基为H原子），范围会扩大很多（7.7%与20.3%）

•由于空间位阻，肽链实际构象的范围是非常有限的

•一般认为驱动蛋白质折叠的主要动力：

熵效应

•结果：

疏水基团埋藏在分子内部，亲水基团暴露在分子表面

•矛盾:

疏水核心会带入部分亲水的主链

•能量平衡：

分子内部主链极性基团被氢键中和，分子表面主链极性基团与水形成氢键

L氨基酸既可以形成右手α-helix也可形成左手α-helix，但天然α-helix全部为右手a-helix

右手比左手稳定！

右手螺旋空间位阻较小。

注意

（1）第n个氨基酸α-氨基上的H与第n+4个氨基酸上的α-羰基O形成氢键，使α-helix内部的氢键数目达到最大；

（2）α-helix只能由L氨基酸或D氨基酸构构成，天然蛋白的α-helix当然只能由L氨基酸构成；

（3）影响α-helix稳定的因素：

相邻R基团间的静电作用、范德瓦尔斯作用、疏水相互作用或位阻作用；

影响-螺旋形成的因素

①R基大小：

较大的难形成，如多聚Ile

甘氨酸由于侧链太小，构象不稳定，是α螺旋的破坏者（Coiledstructure）；

②R基的电荷性质：

不带电荷易形成；连续存在带相同电荷的氨基酸残基；（多聚Ala、Lys、Glu？

）

③Pro吡咯环的形成（α-helixN-末端和C-末端紧邻氨基酸R基团的性质对螺旋稳定性的影响？

？

）

C-N/C-N不能旋转

无法形成链内氢键

在一个连续的螺旋中80个氨基酸的多肽链有多长？

5.4Å/3.6×80=120Å

•由4个连续的AA残基组成

•第一个残基C=O

•第四个残基NH

β转角蛋白

●主要存在于球状蛋白分子中（约1/4）

●多数处在蛋白质分子的表面

●脯氨酸因自身结构角度迫使beta转角出现，甘氨酸因为灵活容易出现beta转角

圆二色性与椭圆率

若光学活性物质能吸收某一波段的光，则对左右旋圆偏振光具有不同的吸收率，即圆二色性（circulardichroism）。

因此，左右旋圆偏振光的振幅不再相等，出射光将成为椭圆偏振光（入射光为平面偏振光或左右旋偏振光）。

纤维状蛋白质

Ø是支架和外保护，规则的线性结构。

含有一种二级结构元件

Ø占脊椎动物体内蛋白质总量的一半或一半以上。

毛发结构元件：

Alpha螺旋，初原纤维（三股右手向左缠绕，2nm），微原纤维（9+2电缆模式，8nm），大原纤维（200nm）

-角蛋白的伸缩性能很好：

被过度拉伸时氢键被破坏不能复原。

此时-角蛋白转变成-折叠结构，称为-角蛋白（限于软角蛋白）

•α-角蛋白：

毛发中主要蛋白质，伸缩性能好，氢键和二硫键，二硫键数目越大，刚性越强，如犀牛角（18%）。

烫发：

还原卷发氧化

角蛋白在湿热条件下伸展转变为—构象，

冷却干燥时可自发地恢复原状。

•侧链R基一般较大，不适于处在—构象

•螺旋多肽链间有着很多的二硫键交联

——交联键使外力解除后肽链恢复原状

胶原蛋白

1．脊椎动物和无脊椎动物体内含量最丰富的蛋白质，属结构蛋白质。

2.使腱、骨、软骨、牙、皮和血管等结缔组织具有机械强度。

3．胶原蛋白的组织分布与类型：

I型——XII型。

-chain:

特有的次级结构（左手螺旋），不是α-螺旋，更伸展，左手

-chain每个残基上升0.29nm三股右手螺旋

肽链氨基酸组成特点：

Gly-X-Y重复序列，X常见为Pro或Leu，Y常见为HyPro

胶原蛋白（Collagen）中的AA

1.皮肤中Gly（33%）,Pro（13%）,4-OH-Pro（9%）,3-OH-Pro（0.1%）,5-OH-Lys（0.6%）

2.不常见氨基酸是多肽链合成后由Pro和Lys修饰而成。

（酶：

氧，Vc，α-KG，Fe（二价））

3.胶原蛋白是糖蛋白，少量糖与5-OH-Lys的—OH共价连接。

胶原蛋白分子间通过Lys和HyLys交联形成胶原纤维

•随着年龄增长，在原胶原的三股螺旋内和三股螺旋间形成的共价交联越来越多，使得结缔组织的胶原纤维越来越硬而脆，改变了肌腱、韧带和软骨的机械性能，使骨头变脆，眼球角膜透明度降低。

丝心蛋白：

反平行式β折叠片

抗张强度高

质地柔软

不能拉伸

●侧链交替地分布在折叠片的两侧

●伸展肽链沿纤维轴平行排列成反向-折叠

●分子中不含-螺旋

●肽链常由多个六肽单元重复而成

-（Gly-Ser-Gly-Ala-Gly-Ala）n

•很高的抗张强度：

Gly和Ala片层表面彼此连锁—张力并不直接作用于肽键；

•柔软特性：

非键合的范德华力维系（弱），无二硫键；

•不能拉伸：

肽键处于相当伸展的状态。

球状蛋白三维结构

•含有两种或以上的二级结构元件

•具有明显的折叠层次

•二级结构-超二级结构-结构域或三级结构（单体结构域蛋白或亚基）-亚基缔合成四级结构（如血红蛋白）

•是紧密的球状或椭圆状实体（小空腔：

水分子；大空腔：

构象容易变化）

•疏水侧链埋藏在分子内部，亲水侧链暴露在分子表面（熵驱动，球状蛋白是水溶性的）

•分子表面有一个空穴（结合配体）

-

1Motif/supersecondarystructure基序:

超二级结构，介于二级和三级结构（afewhundredmotifs）

2Domain结构域：

foldstablyandindepently，inapolypeptidechain

3StructuralClass结构种类：

basedonmotifs

4Subunit亚基：

一般一条多肽链

5Quaternarystructure&symmetry四维结构与对称性

•结构域：

多肽链在二级结构和超二级结构基础上形成三级结构的局部折叠，它是相对独立的紧密球状实体。

•较小的球状蛋白：

结构域=三级结构

•较大的球状蛋白：

三级结构由两个或多个结构域缔合而成。

结构域之间常有柔性的铰链连接，结构域容易相对运动，如别构效应。

亚基缔合和四级结构

•亚基一般是一条多肽链，大多为偶数

•球状蛋白质通过非共价键（疏水作用，氢键和离子键）缔合

•单体，寡聚，多聚或多亚基蛋白质

•强变性剂使血红蛋白解离成亚基，温和的变性条件使血红蛋白解离成αβ二聚体

•四级结构的对称性（单体和亚基是手性分子）

四级结构在结构和功能的优越性

•增强结构稳定性（为什么通过逐步折叠？

）

•提高遗传经济性和效率（HIV蛋白酶是一个相同亚基的二聚体）

•使催化基团汇集（色氨酸合成酶α2β2两个反应）

•具有协同性和别构效应（酶的活性借助亚基相互作用）

结构域：

多肽链在二级结构和超二级结构基础上形成三级结构的局部折叠，它是相对独立的紧密球状实体。

较小的球状蛋白：

结构域=三级结构

较大的球状蛋白：

三级结构由两个或多个结构域缔合而成。

结构域之间常有柔性的铰链连接，结构域容易相对运动，如别构效应。

NMR结构参数

化学位移：

电子对核自旋的屏蔽作用

→原子核在分子中的位置

自旋耦合：

核自旋间的相互作用

→原子核之间的键合关系

→化学键之间的夹角二面角

NOE效应:

核的空间距离

1.Lossofstructureresultsinlossoffunction

2.Denaturationofsomeproteinsisreversible

3.Polypeptidesfoldrapidlybystepwiseprocess

4.Deathbymisfolding:

theprion（朊病毒）

5.Proteinfoldinginvivo

变性是协同过程

尿素破坏疏水相互作用

高浓度巯基乙醇破坏二硫键

变性蛋白质特点

A.生物活性丧失

B.侧链基团暴露:

易与化学试剂反应

C.理化性质改变:

疏水基外露溶解度

分子相互凝集,形成沉淀

D.生化性质改变：

结构伸展易被酶解

复性（renaturation）

——除去变性因素变性蛋白

重新回复到天然结构的现象。

•核糖核酸酶变性与复性实验

•二硫腱稳定蛋白质构象

•为什么大多数蛋白不含二硫键？

•含有二硫键的蛋白主要是分泌到细胞外的蛋白质如核糖核酸酶和胰岛素，可能是因为细胞内的环境是相当还原的，它倾向于保持巯基处于还原态。

氨基酸顺序决定蛋白质结构

多肽链的二级结构由R基的短程顺序决定，当一组在肽链上相邻的氨基酸残基具有适当的顺序时，能自发形成α-螺旋和β-折叠，并处于稳定状态。

多肽链的三级结构由氨基酸的长程顺序决定，如产生特异转弯的氨基酸残基（Pro、Thr、Ser）的精确位置决定多肽链转弯形成的方向和角度。

同源蛋白质的不变残基决定蛋白质的高级结构。

RNase的变性、复性实验，证明蛋白质的三维构象归根结底是复杂生物大分子的“自我装配”。

•蛋白质折叠不是通过随机搜索找到自由能最低的构象

•许多蛋白质折叠时间不到1s

•如何研究蛋白质折叠？

D2O王镜岩P237

•体内蛋白质折叠有异构酶和伴侣蛋白质参加

活体蛋白质折叠

Need：

1Proteindisulfideisomerase（PDI）

2Peptidylprolylisomerases（PPIases）

3Molecularchaperonesareproteinsthatinteractwithpartiallyfoldedorimproperlyfoldedpolypeptides,facilitatingcorrectfoldingpathwaysorprovidingmicroenvironmentsinwhichfoldingcanoccur

小结

•蛋白质的功能是蛋白质天然构象所具有的性质

•天然构象是生理条件下热力学上最稳定的即自由能最低的三维结构

•蛋白质受到物理和化学因素作用，引起蛋白质变性

•非共价键破裂，天然构象改变

•有些变性是可逆的

•一级结构决定三维结构

•蛋白质折叠不是通过随机搜索找到自由能最低的构象

•多肽链折叠存在中间体，并有异构酶和伴侣蛋白质参加