MiRSNP与结直肠癌发生发展及化疗疗效的相关性研究.docx

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MiRSNP与结直肠癌发生发展及化疗疗效的相关性研究

MiR-SNP与结直肠癌发生发展及化疗疗效的相关性研究

摘要：

目的：

观察MiR-SNP与结直肠癌发生发展及化疗疗效的相关性。

方法：

选择2013年5月-2015年1月至苏州大学各附属医院住院部进行结直肠癌放化疗治疗的患者549例作为病例组。

随机选择同一时期至我院进行健康体检的健康人群714例作为对照组，病例组及对照组mircoRNA相关的SNPs位点均采用TYPER4.0软件分析质谱图，进行基因分型。

使用计算机统计软件分析结直肠癌患者和健康人群miRSNPs基因型分布；观察rs174561基因型分布在病例组和对照组之间的差异，观察rs174561基因型与卡贝他滨疗效关系。

结果：

在rs174561的等显性模型和隐性模型中，C/C分布在患病人群为14.1%，健康人群为23.3%，具有统计学意义（P<0.05）。

这其中，与rs174561的等显性模型中的T/T基因型相比，C/C基因型（OR=0.516，95%CI=0.370-0.718）疾病易感性更低；在肿瘤大小上，C/C基因型（OR=2.167，95%CI=1.261-3.723）患病的肿瘤尺寸>5cm的风险更高。

在TNM分期上，与rs174561超显性基因模型中T/T-C/C相比，C/T基因型（OR=0.655，95%CI=0.445-0.965）患病的pT3+pT4风险更低。

在病理类型上，与等显性模型中T/T基因型相比，C/C基因型（OR=0.464，95%CI=0.217-0.990）患病的Ulcertype风险更低。

在肿瘤类型上，与rs174561显性基因模型中T/T相比，C/T-C/C基因型（OR=0.669，95%CI=0.467-0.960）患病的Rectal风险更低。

在直肠癌肿瘤浸润深度、淋巴转移、远处转移、分化程度、上，rs174561各分型与其无明显相关性。

在疗效方面，卡培他滨化疗中rs174561等显性模型中疗效差的基因型C/T为27.0%和C/C为9.0%，疗效好的基因型C/T为31.1%和C/C为32.0%；在5-FU的疗效上，与rs174561等显性模型中T/T基因型相比，C/C基因型（OR=0.280，95%CI=0.087-0.901）患者的疗效较好。

在奥沙利铂的疗效上，疗效好的基因型C/T-C/C为62.1%，与T/T基因型相比，C/T-C/C基因型（OR=1.906，95%CI=1.260-2.886）患者的疗效差。

在不良反应中，卡培他滨化疗时rs174561显性模型中无不良反应的基因型C/T-C/C为56.8%，有不良反应的基因型C/T-C/C为42.9%，与T/T基因型相比，C/T-C/C基因型（OR=0.569，95%CI=0.330-0.982）患者的不良反应更小。

所有基因模型与5-FU、奥沙利铂不良反应的关系无统计学差异。

结论：

MiR-SNP与结直肠癌的发生发展密切相关，同时也与化疗药物的敏感性、不良反应密切相关。

对于MiR-SNP的研究能够为结直肠癌的治疗提供新的方向，具有重要的研究价值。

关键词：

MiR-SNP；结直肠癌；易感性；化疗疗效

结直肠癌是临床常见的消化道恶性肿瘤，从全球范围来看，其发病率在女性恶性肿瘤中排名第二，男性中排名第三，在中国其死亡率排名第五，而且患病率呈逐年提升的趋势。

结直肠癌的的发生发展规律目前尚未完全清楚，但是与基因的关系是临床研究的主要方向之一[1-2]。

microRNA是在真核生物中普遍存在的非编码RNA序列，参与到细胞分化、调节、应激、凋亡等多个过程，SNP是人类最为常见的遗传标记物，个体因素所致的肿瘤发生、发展和药物化疗疗效差异，都与SNP有很大关系[3]。

MiRNA的相关SNP（MiR-SNP）不仅影响目标碱基对与miRNA的互补程度，也能影响miRNA对靶基因的调控功能，临床研究发现MiR-SNP共有rs174561、rs2043556、rs2289030和rs6505162四种基因模型，而rs174561与结直肠癌联系更为密切，为了观察其与结直肠癌发生发展及化疗疗效的相关性，笔者进行了本次研究。

1.资料与方法

1.1患者选择

选择2013年5月-2015年1月至苏州大学各附属医院住院部进行结直肠癌放化疗治疗的患者549例作为病例组。

其中男性患者301例，女性患者204例，年龄45-73岁，平均年龄（54.52±6.81）岁。

低分化66例，中、高分化338例，肿瘤≤5cm256例，>5cm113例，TNM分期为I+II期163例，III+IV期273例。

其中使用卡培他滨化疗患者214例，使用5-FU化疗171例，使用奥沙利铂化疗164例。

随机选择同一时期至我院进行健康体检的健康人群714例作为对照组，其中男性403例，女性313例，年龄45-75岁，平均年龄（55.06±7.33）岁。

两组研究人员性别、年龄无统计学差异（P>0.05）。

纳入标准[4]：

（1）进行结直肠癌化疗的患者。

（2）结直肠是原发病灶的患者。

（3）对本次研究知情同意。

排除标准[5]：

（1）来诊前进行过放化疗治疗的患者。

（2）结直肠是转移病灶。

（3）无结直肠癌家族史。

（4）不同意参与本次研究。

1.2方法

1.2.1研究方法

1.2.1.1全血DNA提取

病例组及对照组患者进行全血DNA提取。

首先取0.5ml抗凝全血，其中加入细胞裂解液，混匀，使DNA充分裂解，再加入1ml无菌双蒸水混匀，使用3000r/min离心机离心3min，去上清液，将DNA稀释缓冲液加入沉淀中，20%SDS，5MNaCl充分混匀，加入适量无菌双蒸水及酚-氯仿混合液，进行混合萃取，再离心分层，取水相转移至另外离心管，在其中加入无水乙醇，析出NDA。

将DNA采用离心方法分离，使用70%乙醇混合去盐，使用灭菌双蒸水溶解，最后对提取的DNA浓度进行测定。

1.2.1.2基因型测定

mircoRNA相关的SNPs位点均采用TYPER4.0软件分析质谱图，进行基因分型。

以DNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增产物与8.5USAP酶37℃孵育40分钟，85℃孵育5分钟，热灭活。

将单碱基引物加入到iPLEX反应体系中进行延伸，用树脂对单碱基延伸产物脱盐。

样品从384孔板中转移到飞行时间质谱平台（MALDI-TOF）芯片上，由质谱仪检测。

在飞行时间质谱平台分析质谱图，获取基因型数据。

1.2.2分析指标[6]

使用计算机统计软件分析结直肠癌患者和健康人群miRSNPs基因型分布；观察rs174561基因型分布在病例组和对照组之间的差异，观察rs174561基因型与肿瘤大小、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、远处转移、分化程度、TNM分期、病理类型、肿瘤类型的相关性，观察rs174561基因型与卡培他滨、5-FU、奥沙利铂化疗疗效及不良反应的相关性。

评估基因型与CRC的差异性，判定P<0.05为结果有显著性差异。

根据比值比（oddsradios,ORs）和95％可信区间（95%confidenceintervals,95%CI），比较相应的等位基因与CRC相关性程度高低；采用HWE（Hardy-weinberg）平衡，评价SNPs位点的基因型频率，判定P>0.05为统计具有群体代表性[4]。

化疗疗效根据实体瘤的疗效评价标准（RECIST）判定[5]，分为完全缓解（completeremission，CR）、部分缓解（partialremission，PR）、病情稳定（steadydisease，SD）和病情进展（progressdisease，PD）四个等级。

化疗疗效好判定为CR和PR，用R表示；化疗疗效差为判定SD和PD，用D表示。

化疗不良反应评价标准根据WHO化疗药物毒性反应分度标准制定，共分为0度、I度、II度、III度、IV度5个等级。

1.3数据处理

用SPSS19.0统计学数据处理软件处理研究中所有相关数据，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，并采用t检验，计数资料采用（n，%）表示，采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1两组rs174561基因型与结直肠癌易感性之间关系

在rs174561的等显性模型和隐性模型中，C/C分布在患病人群为14.1%，健康人群为23.3%，具有统计学意义（P<0.05）。

这其中，与rs174561的等显性模型中的T/T基因型相比，C/C基因型（OR=0.516，95%CI=0.370-0.718）疾病易感性更低。

详见表1。

表1rs174561的基因型分布

Model

Genotype

Cancer

Control

OR（95%CI）

P-value

Codominant

T/T

236（45.5%）

250（38.9%）

1.00

C/T

210（40.5%）

243（37.8%）

0.915（0.708-1.183）

0.500

C/C

73（14.1%）

150（23.3%）

0.516（0.370-0.718）

＜0.001

Dominant

T/T

236（45.5%）

250（38.9%）

1.00

C/T-C/C

283（54.5%）

393（61.1%）

0.763（0.603-0.964）

0.024

Recessive

T/T-C/T

446（85.9%）

493（76.7%）

1.00

C/C

73（14.1%）

150（23.3%）

0.538（0.395-0.732）

＜0.001

Overdominant

T/T-C/C

309（59.5%）

400（62.2%）

1.00

C/T

210（40.5%）

243（37.8%）

1.119（0.883-1.418）

0.353

2.2rs174561与结直肠癌肿瘤大小的相关性

在肿瘤大小上，rs174561等显性模型中尺寸≤5cm的基因型C/T为44.6%和C/C为11.1%，尺寸＞5cm的基因型C/T为71.4%和C/C为29.8%；与rs174561等显性模型中T/T基因型相比，C/T基因型（OR=0.276，95%CI=0.159-0.478）患病的肿瘤尺寸>5cm的风险更低，而C/C基因型（OR=2.167，95%CI=1.261-3.723）患病的肿瘤尺寸>5cm的风险更高。

详见表2。

表2rs174561与肿瘤大小的相关性

Model

Genotype

Tumorsize≤5cm

Tumorsize>5cm

OR（95%CI）

P-value

Codominant

T/T

136（44.3%）

72（55.0%）

1.00

C/T

137（44.6%）

20（15.3%）

0.276（0.159-0.478）

＜0.001

C/C

34（11.1%）

39（29.8%）

2.167（1.261-3.723）

0.005

Dominant

T/T

136（44.3%）

72（55.0%）

1.00

C/T-C/C

171（55.7%）

59（45.0%）

0.652（0.432-0.983）

0.041

Recessive

T/T-C/T

273（88.9%）

92（70.2%）

1.00

C/C

34（11.1%）

39（29.8%）

3.404（2.030-5.708）

＜0.001

Overdominant

T/T-C/C

170（55.4%）

111（84.7%）

1.00

C/T

137（44.6%）

20（15.3%）

0.224（0.132-0.379）

＜0.001

2.3rs174561与结直肠癌肿瘤TNM分期的相关性

在TNM分期上，rs174561隐性基因模型中pT1+pT2的基因型C/C为9.0%，pT3+pT4的基因型C/C为17.7%；rs174561超显性基因模型中pT1+pT2的基因型C/T为45.8%，pT3+pT4的基因型C/T为35.6%；与rs174561隐性模型中T/T-C/T基因型相比，C/C基因型（OR=2.161，95%CI=1.166-4.005）患病的pT3+pT4风险更高；与rs174561超显性基因模型中T/T-C/C相比，C/T基因型（OR=0.655，95%CI=0.445-0.965）患病的pT3+pT4风险更低。

详见表3。

表3rs174561与TNM分期的相关性

Model

Genotype

pT1+pT2

pT3+pT4

OR（95%CI）

P-value

Codominant

T/T

70（45.2%）

156（46.7%）

1.00

C/T

71（45.8%）

119（35.6%）

0.752（0.500-1.130）

0.170

C/C

14（9.0%）

59（17.7%）

1.891（0.990-3.613）

0.054

Dominant

T/T

70（45.2%）

156（46.7%）

1.00

C/T-C/C

85（54.8%）

178（53.3%）

0.940（0.641-1.377）

0.750

Recessive

T/T-C/T

141（91.0%）

275（82.3%）

1.00

C/C

14（9.0%）

59（17.7%）

2.161（1.166-4.005）

0.014

Overdominant

T/T-C/C

84（54.2%）

215（64.4%）

1.00

C/T

71（45.8%）

119（35.6%）

0.655（0.445-0.965）

0.032

2.4rs174561与结直肠癌肿瘤病理类型的相关性

在病理类型上，rs174561等显性模型中Infiltratingtype的基因型C/T为37.3%，Polyptype的基因型C/T为54.2%，与等显性模型中T/T基因型相比，C/T基因型（OR=2.108，95%CI=1.067-4.166）患病的Polyptype风险更高；rs174561等显性模型中Polyptype的基因型C/T为54.2%和C/C为16.9%，Ulcertype的基因型C/T为33.6%和C/C为12.5%，与等显性模型中T/T相比，C/T基因型（OR=0.332，95%CI=0.200-0.548）和C/C基因型（OR=0.394，95%CI=0.199-0.782）患病的Ulcertype风险更低；rs174561等显性模型中Infiltratingtype的基因型C/C为20.9%，Ulcertype的基因型C/C为12.5%，与等显性模型中T/T基因型相比，C/C基因型（OR=0.464，95%CI=0.217-0.990）患病的Ulcertype风险更低。

详见表4-1、4-2、4-3。

表4-1rs174561与病理类型的相关性

Model

Genotype

Infiltratingtype

Polyptype

OR（95%CI）

P-value

Codominant

T/T

28（41.8%）

34（28.8%）

1.00

C/T

25（37.3%）

64（54.2%）

2.108（1.067-4.166）

0.032

C/C

14（20.9%）

20（16.9%）

1.176（0.505-2.743）

0.707

Dominant

T/T

28（41.8%）

34（28.8%）

1.00

C/T-C/C

39（58.2%）

84（71.2%）

1.774（0.947-3.324）

0.074

Recessive

T/T-C/T

53（79.1%）

98（83.1%）

1.00

C/C

14（20.9%）

20（16.9%）

0.773（0.361-1.653）

0.506

Overdominant

T/T-C/C

42（62.7%）

54（45.8%）

1.00

C/T

25（37.3%）

64（54.2%）

1.991（1.078-3.677）

0.028

表4-2rs174561与病理类型的相关性

Model

Genotype

Polyptype

Ulcertype

OR（95%CI）

P-value

Codominant

T/T

34（28.8%）

125（53.9%）

1.00

C/T

64（54.2%）

78（33.6%）

0.332（0.200-0.548）

＜0.001

C/C

20（16.9%）

29（12.5%）

0.394（0.199-0.782）

0.008

Dominant

T/T

34（28.8%）

125（53.9%）

1.00

C/T-C/C

84（71.2%）

107（46.1%）

0.346（0.216-0.557）

＜0.001

Recessive

T/T-C/T

98（83.1%）

203（87.5%）

1.00

C/C

20（16.9%）

29（12.5%）

0.700（0.377-1.299）

0.258

Overdominant

T/T-C/C

54（45.8%）

154（66.4%）

1.00

C/T

64（54.2%）

78（33.6%）

0.427（0.272-0.672）

＜0.001

表4-3rs174561与病理类型的相关性

Model

Genotype

Infiltratingtype

Ulcertype

OR（95%CI）

P-value

Codominant

T/T

28（41.8%）

125（53.9%）

1.00

C/T

25（37.3%）

78（33.6%）

0.699（0.380-1.285）

0.249

C/C

14（20.9%）

29（12.5%）

0.464（0.217-0.990）

0.047

Dominant

T/T

28（41.8%）

125（53.9%）

1.00

C/T-C/C

39（58.2%）

107（46.1%）

0.615（0.355-1.065）

0.083

Recessive

T/T-C/T

53（79.1%）

203（87.5%）

1.00

C/C

14（20.9%）

29（12.5%）

0.541（0.267-1.095）

0.088

Overdominant

T/T-C/C

42（62.7%）

154（66.4%）

1.00

C/T

25（37.3%）

78（33.6%）

0.851（0.484-1.497）

0.575

2.5rs174561与结直肠癌肿瘤类型的相关性

在肿瘤类型上，rs174561等显性基因模型中Colon的基因型C/T为42.3%，Rectal的基因型C/T为34.3%；rs174561显性基因模型中Colon的基因型C/T-C/C为58.1%，Rectal的基因型C/T-C/C为48.1%；与rs174561等显性模型中T/T基因型相比，C/T基因型（OR=0.655，95%CI=0.442-0.970）患病的Rectal风险更低；与rs174561显性基因模型中T/T相比，C/T-C/C基因型（OR=0.669，95%CI=0.467-0.960）患病的Rectal风险更低。

详见表5。

表5rs174561与肿瘤类型的相关性

Model

Genotype

Colon

Rectal

OR（95%CI）

P-value

Codominant

T/T

117（41.9%）

109（51.9%）

1.00

C/T

118（42.3%）

72（34.3%）

0.655（0.442-0.970）

0.035

C/C

44（15.8%）

29（13.8%）

0.707（0.414-1.210）

0.206

Dominant

T/T

117（41.9%）

109（51.9%）

1.00

C/T-C/C

162（58.1%）

101（48.1%）

0.669（0.467-0.960）

0.029

Recessive

T/T-C/T

235（84.2%）

181（86.2%）

1.00

C/C

44（15.8%）

29（13.8%）

0.856（0.515-1.421）

0.547

Overdominant

T/T-C/C

161（57.7%）

138（65.7%）

1.00

C/T

118（42.3%）

72（34.3%）

0.712（0.491-1.032）

0.073

2.6rs174561与结直肠癌肿瘤浸润深度的相关性

在直肠癌肿瘤浸润深度上，rs174561各分型与其无明显相关性。

详见表6。

表6rs174561与浸润深度的相关性

Model

Genotype

T1+T2

T3+T4

OR（95%CI）

P-value

Codominant

T/T

32（46.4%）

194（46.2%）

1.00

C/T

23（33.3%）

167（39.8%）

1.198（0.674-2.127）

0.538

C/C

14（20.3%）

59（14.0%）

0.695（0.348-1.389）

0.303

Dominant

T/T

32（46.4%）

194（46.2%）

1.00

C/T-C/C

37（53.6%）

226（53.8%）

1.008（0.605-1.679）

0.997

Recessive

T/T-C/T

55（79.7%）

361（86.0%）

1.00

C/C

14（20.3%）

59（14.0%）

0.642（0.336-1.228）

0.180

Overdominant

T/T-C/C

46（66.7%）

253（60.2%）

1.00

C/T

23（33.3%）

167（39.8%）

1.320（0.771-2.259）

0.311

2.7rs174561与结直肠癌肿瘤淋巴转移的相关性

在直肠癌肿瘤淋巴转移上，rs174561各分型与其无明显相关性。

详见表7。

表7rs174561与淋巴转移的相关性

Model

Genotype

Lymphnodemetastasis=no

Lymphnodemetastasis=yes

OR（95%CI）

P-value

Codominant

T/T

89（45.9%）

137（46.4%）

1.00

C/T

81（41.8%）

109（36.9%）

0.874（0.591-1.294）

0.502

C/C

24（12.4%）

49（16.6%）

1.326（0.760-2.314）

0.320

Dominant

T/T

89（45.9%）

137（46.4%）

1