MiRSNP与结直肠癌发生发展及化疗疗效的相关性研究.docx

1、MiRSNP与结直肠癌发生发展及化疗疗效的相关性研究MiR-SNP与结直肠癌发生发展及化疗疗效的相关性研究摘要：目的：观察MiR-SNP与结直肠癌发生发展及化疗疗效的相关性。方法：选择2013年5月-2015年1月至苏州大学各附属医院住院部进行结直肠癌放化疗治疗的患者549例作为病例组。随机选择同一时期至我院进行健康体检的健康人群714例作为对照组，病例组及对照组mircoRNA相关的SNPs位点均采用TYPER 4.0 软件分析质谱图，进行基因分型。使用计算机统计软件分析结直肠癌患者和健康人群miRSNPs 基因型分布；观察rs174561基因型分布在病例组和对照组之间的差异，观察rs174

2、561基因型与卡贝他滨疗效关系。结果：在rs174561的等显性模型和隐性模型中，C/C分布在患病人群为14.1%，健康人群为23.3%，具有统计学意义（P5cm的风险更高。在TNM分期上，与rs174561超显性基因模型中T/T-C/C相比，C/T基因型（OR=0.655，95%CI=0.445-0.965）患病的pT3+pT4风险更低。在病理类型上，与等显性模型中T/T基因型相比，C/C基因型（OR=0.464，95%CI=0.217-0.990）患病的Ulcer type风险更低。在肿瘤类型上，与rs174561显性基因模型中T/T相比，C/T-C/C基因型（OR=0.669，95%CI

3、=0.467-0.960）患病的Rectal风险更低。在直肠癌肿瘤浸润深度、淋巴转移、远处转移、分化程度、上，rs174561各分型与其无明显相关性。在疗效方面，卡培他滨化疗中rs174561等显性模型中疗效差的基因型C/T为27.0%和C/C为9.0%，疗效好的基因型C/T为31.1%和C/C为32.0%；在5-FU的疗效上，与rs174561等显性模型中T/T基因型相比，C/C基因型（OR=0.280，95%CI=0.087-0.901）患者的疗效较好。在奥沙利铂的疗效上，疗效好的基因型C/T-C/C为62.1%，与T/T基因型相比，C/T-C/C基因型（OR=1.906，95%CI=1.

4、260-2.886）患者的疗效差。在不良反应中，卡培他滨化疗时rs174561显性模型中无不良反应的基因型C/T-C/C为56.8%，有不良反应的基因型C/T-C/C为42.9%，与T/T基因型相比，C/T-C/C基因型（OR=0.569，95%CI=0.330-0.982）患者的不良反应更小。所有基因模型与5-FU、奥沙利铂不良反应的关系无统计学差异。结论：MiR-SNP与结直肠癌的发生发展密切相关，同时也与化疗药物的敏感性、不良反应密切相关。对于MiR-SNP的研究能够为结直肠癌的治疗提供新的方向，具有重要的研究价值。关键词：MiR-SNP；结直肠癌；易感性；化疗疗效结直肠癌是临床常见的消

5、化道恶性肿瘤，从全球范围来看，其发病率在女性恶性肿瘤中排名第二，男性中排名第三，在中国其死亡率排名第五，而且患病率呈逐年提升的趋势。结直肠癌的的发生发展规律目前尚未完全清楚，但是与基因的关系是临床研究的主要方向之一1-2。microRNA是在真核生物中普遍存在的非编码RNA序列，参与到细胞分化、调节、应激、凋亡等多个过程，SNP是人类最为常见的遗传标记物，个体因素所致的肿瘤发生、发展和药物化疗疗效差异，都与SNP有很大关系3。MiRNA的相关SNP（MiR-SNP）不仅影响目标碱基对与miRNA的互补程度，也能影响miRNA对靶基因的调控功能，临床研究发现MiR-SNP共有rs174561、r

6、s2043556、rs2289030和rs6505162四种基因模型，而rs174561与结直肠癌联系更为密切，为了观察其与结直肠癌发生发展及化疗疗效的相关性，笔者进行了本次研究。1.资料与方法1.1患者选择选择2013年5月-2015年1月至苏州大学各附属医院住院部进行结直肠癌放化疗治疗的患者549例作为病例组。其中男性患者301例，女性患者204例，年龄45-73岁，平均年龄（54.526.81）岁。 低分化66例，中、高分化338例，肿瘤5cm256例，5cm113例，TNM分期为I+II期163例，III+IV期273例。其中使用卡培他滨化疗患者214例，使用5-FU化疗171例，使用

7、奥沙利铂化疗164例。随机选择同一时期至我院进行健康体检的健康人群714例作为对照组，其中男性403例，女性313例，年龄45-75岁，平均年龄（55.067.33）岁。两组研究人员性别、年龄无统计学差异（P0.05）。纳入标准4：（1）进行结直肠癌化疗的患者。（2）结直肠是原发病灶的患者。（3）对本次研究知情同意。排除标准5：（1）来诊前进行过放化疗治疗的患者。（2）结直肠是转移病灶。（3）无结直肠癌家族史。（4）不同意参与本次研究。1.2方法1.2.1研究方法1.2.1.1全血DNA提取病例组及对照组患者进行全血DNA提取。首先取0.5ml抗凝全血，其中加入细胞裂解液，混匀，使DNA充分裂

8、解，再加入1ml无菌双蒸水混匀，使用3000r/min离心机离心3min，去上清液，将DNA稀释缓冲液加入沉淀中，20%SDS，5M NaCl充分混匀，加入适量无菌双蒸水及酚-氯仿混合液，进行混合萃取，再离心分层，取水相转移至另外离心管，在其中加入无水乙醇，析出NDA。将DNA采用离心方法分离，使用70%乙醇混合去盐，使用灭菌双蒸水溶解，最后对提取的DNA浓度进行测定。1.2.1.2基因型测定mircoRNA相关的SNPs位点均采用TYPER 4.0 软件分析质谱图，进行基因分型。以DNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增产物与8.5 U SAP酶37 孵育40分钟，85 孵育5分钟，热灭活。将

9、单碱基引物加入到iPLEX反应体系中进行延伸，用树脂对单碱基延伸产物脱盐。样品从384孔板中转移到飞行时间质谱平台（MALDI-TOF）芯片上，由质谱仪检测。在飞行时间质谱平台分析质谱图，获取基因型数据。1.2.2分析指标6使用计算机统计软件分析结直肠癌患者和健康人群miRSNPs 基因型分布；观察rs174561基因型分布在病例组和对照组之间的差异，观察rs174561基因型与肿瘤大小、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、远处转移、分化程度、TNM分期、病理类型、肿瘤类型的相关性，观察rs174561基因型与卡培他滨、5-FU、奥沙利铂化疗疗效及不良反应的相关性。评估基因型与CRC的差异性，判定P0.

10、05 为统计具有群体代表性4。化疗疗效根据实体瘤的疗效评价标准（RECIST）判定5，分为完全缓解(complete remission，CR)、部分缓解 (partial remission，PR)、病情稳定(steady disease，SD) 和病情进展(progress disease， PD) 四个等级。化疗疗效好判定为 CR和PR ，用R表示；化疗疗效差为判定SD和 PD，用D表示。化疗不良反应评价标准根据WHO化疗药物毒性反应分度标准制定，共分为0度、I度、II度、III度、IV度5个等级。1.3数据处理用SPSS19.0统计学数据处理软件处理研究中所有相关数据，计量资料用均数标

11、准差（xs）表示，并采用 t 检验，计数资料采用（n，%）表示，采用2检验，以 P 0.05 为差异有统计学意义。2.结果2.1两组rs174561基因型与结直肠癌易感性之间关系在rs174561的等显性模型和隐性模型中，C/C分布在患病人群为14.1%，健康人群为23.3%，具有统计学意义（P5cm的风险更低，而C/C基因型（OR=2.167，95%CI=1.261-3.723）患病的肿瘤尺寸5cm的风险更高。详见表2。表 2 rs174561与肿瘤大小的相关性ModelGenotypeTumor size 5cmTumor size 5cmOR (95% CI)P-valueCodomin

12、antT/T136(44.3%)72(55.0%)1.00 C/T137(44.6%)20(15.3%)0.276(0.159-0.478)0.001C/C34(11.1%)39(29.8%)2.167(1.261-3.723)0.005DominantT/T136(44.3%)72(55.0%)1.00C/T-C/C171(55.7%)59(45.0%)0.652(0.432-0.983)0.041RecessiveT/T-C/T273(88.9%)92(70.2%)1.00C/C34(11.1%)39(29.8%)3.404(2.030-5.708)0.001OverdominantT/T

13、-C/C170(55.4%)111(84.7%)1.00C/T137(44.6%)20(15.3%)0.224(0.132-0.379)0.0012.3 rs174561与结直肠癌肿瘤TNM分期的相关性在TNM分期上，rs174561隐性基因模型中pT1+pT2的基因型C/C为9.0%，pT3+pT4的基因型C/C为17.7%；rs174561超显性基因模型中pT1+pT2的基因型C/T为45.8%，pT3+pT4的基因型C/T为35.6%；与rs174561隐性模型中T/T-C/T基因型相比，C/C基因型（OR=2.161，95%CI=1.166-4.005）患病的pT3+pT4风险更高；与

14、rs174561超显性基因模型中T/T-C/C相比，C/T基因型（OR=0.655，95%CI=0.445-0.965）患病的pT3+pT4风险更低。详见表3。表 3 rs174561与TNM分期的相关性ModelGenotypepT1+pT2pT3+pT4OR (95% CI)P-valueCodominantT/T70(45.2%)156(46.7%)1.00C/T71(45.8%)119(35.6%)0.752(0.500-1.130)0.170C/C14(9.0%)59(17.7%)1.891(0.990-3.613)0.054DominantT/T70(45.2%)156(46.7%

15、)1.00C/T-C/C85(54.8%)178(53.3%)0.940(0.641-1.377)0.750RecessiveT/T-C/T141(91.0%)275(82.3%)1.00C/C14(9.0%)59(17.7%)2.161(1.166-4.005)0.014OverdominantT/T-C/C84(54.2%)215(64.4%)1.00C/T71(45.8%)119(35.6%)0.655(0.445-0.965)0.0322.4 rs174561与结直肠癌肿瘤病理类型的相关性在病理类型上，rs174561等显性模型中Infiltrating type的基因型C/T为37.

16、3%，Polyp type的基因型C/T为54.2%，与等显性模型中T/T基因型相比，C/T基因型（OR=2.108，95%CI=1.067-4.166）患病的Polyp type风险更高；rs174561等显性模型中Polyp type的基因型C/T为54.2%和C/C为16.9%，Ulcer type的基因型C/T为33.6%和C/C为12.5%，与等显性模型中T/T相比，C/T基因型（OR=0.332，95%CI=0.200-0.548）和C/C基因型（OR=0.394，95%CI=0.199-0.782）患病的Ulcer type风险更低；rs174561等显性模型中Infiltrat

17、ing type的基因型C/C为20.9%，Ulcer type的基因型C/C为12.5%，与等显性模型中T/T基因型相比，C/C基因型（OR=0.464，95%CI=0.217-0.990）患病的Ulcer type风险更低。详见表4-1、4-2、4-3。表 4-1 rs174561与病理类型的相关性ModelGenotypeInfiltrating typePolyp typeOR (95% CI)P-valueCodominantT/T28(41.8%)34(28.8%)1.00C/T25(37.3%)64(54.2%)2.108(1.067-4.166)0.032C/C14(20.9%

18、)20(16.9%)1.176(0.505-2.743)0.707DominantT/T28(41.8%)34(28.8%)1.00C/T-C/C39(58.2%)84(71.2%)1.774(0.947-3.324)0.074RecessiveT/T-C/T53(79.1%)98(83.1%)1.00C/C14(20.9%)20(16.9%)0.773(0.361-1.653)0.506OverdominantT/T-C/C42(62.7%)54(45.8%)1.00C/T25(37.3%)64(54.2%)1.991(1.078-3.677)0.028表 4-2 rs174561与病理类型

19、的相关性ModelGenotypePolyp typeUlcer typeOR (95% CI)P-valueCodominantT/T34(28.8%)125(53.9%)1.00C/T64(54.2%)78(33.6%)0.332(0.200-0.548)0.001C/C20(16.9%)29(12.5%)0.394(0.199-0.782)0.008DominantT/T34(28.8%)125(53.9%)1.00C/T-C/C84(71.2%)107(46.1%)0.346(0.216-0.557)0.001RecessiveT/T-C/T98(83.1%)203(87.5%)1.0

20、0C/C20(16.9%)29(12.5%)0.700(0.377-1.299)0.258OverdominantT/T-C/C54(45.8%)154(66.4%)1.00C/T64(54.2%)78(33.6%)0.427(0.272-0.672)0.001表 4-3 rs174561与病理类型的相关性ModelGenotypeInfiltrating typeUlcer typeOR (95% CI)P-valueCodominantT/T28(41.8%)125(53.9%)1.00C/T25(37.3%)78(33.6%)0.699(0.380-1.285)0.249C/C14(20

21、.9%)29(12.5%)0.464(0.217-0.990)0.047DominantT/T28(41.8%)125(53.9%)1.00C/T-C/C39(58.2%)107(46.1%)0.615(0.355-1.065)0.083RecessiveT/T-C/T53(79.1%)203(87.5%)1.00C/C14(20.9%)29(12.5%)0.541(0.267-1.095)0.088OverdominantT/T-C/C42(62.7%)154(66.4%)1.00C/T25(37.3%)78(33.6%)0.851(0.484-1.497)0.5752.5 rs174561

22、与结直肠癌肿瘤类型的相关性在肿瘤类型上，rs174561等显性基因模型中Colon的基因型C/T为42.3%，Rectal的基因型C/T为34.3%；rs174561显性基因模型中Colon的基因型C/T-C/C为58.1%，Rectal的基因型C/T-C/C为48.1%；与rs174561等显性模型中T/T基因型相比，C/T基因型（OR=0.655，95%CI=0.442-0.970）患病的Rectal风险更低；与rs174561显性基因模型中T/T相比，C/T-C/C基因型（OR=0.669，95%CI=0.467-0.960）患病的Rectal风险更低。详见表5。表 5 rs174561

23、与肿瘤类型的相关性ModelGenotypeColonRectalOR (95% CI)P-valueCodominantT/T117(41.9%)109(51.9%)1.00C/T118(42.3%)72(34.3%)0.655(0.442-0.970)0.035C/C44(15.8%)29(13.8%)0.707(0.414-1.210)0.206DominantT/T117(41.9%)109(51.9%)1.00C/T-C/C162(58.1%)101(48.1%)0.669(0.467-0.960)0.029RecessiveT/T-C/T235(84.2%)181(86.2%)1.

24、00C/C44(15.8%)29(13.8%)0.856(0.515-1.421)0.547OverdominantT/T-C/C161(57.7%)138(65.7%)1.00C/T118(42.3%)72(34.3%)0.712(0.491-1.032)0.0732.6 rs174561与结直肠癌肿瘤浸润深度的相关性在直肠癌肿瘤浸润深度上，rs174561各分型与其无明显相关性。详见表6。表 6 rs174561与浸润深度的相关性ModelGenotypeT1+T2T3+T4OR(95%CI)P-valueCodominantT/T32(46.4%)194(46.2%)1.00C/T23(

25、33.3%)167(39.8%)1.198(0.674-2.127)0.538C/C14(20.3%)59(14.0%)0.695(0.348-1.389)0.303DominantT/T32(46.4%)194(46.2%)1.00C/T-C/C37(53.6%)226(53.8%)1.008(0.605-1.679)0.997RecessiveT/T-C/T55(79.7%)361(86.0%)1.00C/C14(20.3%)59(14.0%)0.642(0.336-1.228)0.180OverdominantT/T-C/C46(66.7%)253(60.2%)1.00C/T23(33.

26、3%)167(39.8%)1.320(0.771-2.259)0.3112.7 rs174561与结直肠癌肿瘤淋巴转移的相关性在直肠癌肿瘤淋巴转移上，rs174561各分型与其无明显相关性。详见表7。表 7 rs174561与淋巴转移的相关性ModelGenotypeLymph node metastasis=noLymph node metastasis=yesOR (95% CI)P-valueCodominantT/T89(45.9%)137(46.4%)1.00C/T81(41.8%)109(36.9%)0.874(0.591-1.294)0.502C/C24(12.4%)49(16.6%)1.326(0.760-2.314)0.320DominantT/T89(45.9%)137(46.4%)1