禾谷镰刀菌拮抗菌筛选探究方案.docx
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禾谷镰刀菌拮抗菌筛选探究方案
由禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病是小麦重要病害之一，也是影响中国小麦生产的重要病害[2]。
小麦赤霉病别名红麦头、烂麦头、麦穗枯。
在全世界普遍发生，气候湿润多雨的温带地区受害比较严重，在潮湿和半潮湿区域发生率较高。
从幼苗到抽穗都可受害，主要引起苗枯、茎基腐、秆腐和穗腐，其中穗腐的危害最为严重。
小麦赤霉病的表现
小麦赤霉病主要引起穗腐、苗腐和杆腐等症状。
最常见的是穗腐。
初期在颖片和小穗上会出现浅褐色斑，小穗也会慢慢感染，接着蔓延到邻近小穗，导致小穗枯黄。
湿度大时，会产生红色霉层；湿度小时，病小穗枯白，没有霉层产生[3]。
种子带菌或土壤中病残体侵染小麦会产生苗腐，刚感染小麦会变得瘦小，时间长了可能会病死。
穗下第一、二节则容易发生杆腐，叶鞘上会先出现淡褐色斑点，再向节部内部蔓延，严重时不能抽穗。
小麦赤霉病的发病条件
在充足的湿度和空气条件下，赤霉病会形成子囊壳和子囊孢子，最适和的生长温度为24～25℃，最低9～10℃，最高32℃。
在适宜的条件下2～3d即可产生子囊壳，5～10d形成子囊孢子。
在小麦抽穗前后，子囊孢子会随风飘散，飘落在麦穗上，子囊孢子会在颖内花药上腐生，接着整个花器及小穗都会被感染。
还会产生分生孢子群，分生孢子会接着随风飘散，接着侵染其它小麦，使病害扩展蔓延[4]。
气象条件对小麦赤霉病的影响较大。
当平均气温为9℃以上，3～5d的雨天时，便形成了子囊孢子。
这会十分有利于子囊孢子的释放和侵染，小麦赤霉病很有可能大流行。
小麦赤霉病的危害
小麦赤霉病是造成农业损失的主要原因之一[5]，联合国粮农组织（FAO）统计，每年由植物病害引起的减产平均损失为总产量的10%～15%，而其中的80%的损失是由真菌引起的[6]。
小麦赤霉病会严重影响小麦的产量，同时还会降低小麦的品质。
该还能产生以脱氧雪腐镰刀菌烯醇为主的真菌毒素，能较大的危害人、畜。
当有4%的病麦时就不能使用了，这时小麦已经失去了利用价值。
1950年以来全国赤霉病大流行12年，中度流行17年，流行的频率为%。
1985年全国赤霉病又大流行，仅河南省发病面积就达×106hm2。
2000以来赤霉病在中国大流行频率不断增加，发病面积呈明显扩大趋势，有9个年份赤霉病的发生面积就超过了×106hm2。
其中仅河南省就有7年的发病面积超过×105hm2。
在2012年的赤霉病大流行中，山东省南部和西南部较重，河南省整体偏重，豫南更重，安徽和江苏普遍严重[7]。
赤霉病严重威胁小麦的安全生产，一般的流行年份可引起5%～10%的产量损失，大的流行年份可导致相当多的田块绝收。
根据调查2008～2009年度全国11个省的1018个饲料样品的毒素污染情况发现，DON毒素的检出率达%，超标率达%，其中西北地区的超标率高达%，华北和华中地区的超标率则分别为%和%[8]。
本课题便是用牛肉膏蛋白胨培养基涂布平板法从小麦根际土壤中分离出细菌，纯化后用平板对峙法进行初筛和复筛。
通过形态学方法、生理生化分析进行初步鉴定，研究其抗菌活性，为寻找有效抵御小麦赤霉病的方法奠定基础。
2材料与方法
供试病原菌和小麦根际土样
供试植物病原真菌：
禾谷镰刀菌（9435实验室保存）。
小麦根际土样：
河南工业大学西门大谢村麦田。
试剂及仪器
2.2.1试剂名称及生产厂家
试剂名称
规格
生产厂家
蛋白胨
蔗糖
牛肉浸膏
BR
AR
BR
北京双旋微生物培养基制品厂
天津市瑞金化学品有限公司
北京双旋微生物培养基制品厂
可溶性淀粉
BR
天津市瑞金特化学品有限公司
对二甲基氨基苯甲醛
AR
上海试剂三厂
氯化钠
AR
天津市德恩化学试剂有限公司
酵母膏
AR
北京奥博星生物技术有限责任公司
琼脂粉
BR
上海化学试剂厂有限公司
溴百里香酚兰
AR
上海三爱思试剂有限公司
葡萄糖
AR
天津市科密欧化学试剂有限公司
氢氧化钠
AR
天津市科密欧化学试剂有限公司
磷酸氢二钾
AR
天津市化学试剂三厂
柠檬酸钠
AR
湖南省医药公司化玻站
硫酸镁
AR
天津市永远化学试剂开发中心
乳糖
无水乙醇
AR
AR
天津市科密欧化学试剂有限公司
天津市永大化学试剂开发中心
磷酸二氢铵
AR
天津化学试剂三厂
二甲苯
AR
洛阳昊华化学试剂有限公司
硝酸钾
AR
天津市瑞金化学品有限公司
乙酸（冰醋酸）
AR
开封市芳晶化学试剂有限公司
浓盐酸
AR
洛阳昊华化学试剂有限公司
三氯化铁
AR
天津市化学试剂工厂
碘
AR
天津市科密欧化学试剂有限公司
甲基红
AR
天津市科密欧化学试剂有限公司
结晶紫
AR
天津市化学试剂三厂
次氯酸钠
AR
天津市光复精细化工研究所
番红花红T
AR
天津市科密欧化学试剂研究所
2.2.2实验仪器
仪器名称
仪器型号
生产公司
电热恒温鼓风干燥箱
XMTD-8222
上海精宏试验设备公司
高压蒸汽灭菌锅
SX-700
日本TOMY
震荡培养箱
HZQ-X100
哈尔滨市东联电子技术开发有限公司
电热恒温培养箱
DHP-9052
上海浦东荣本科学仪器有限公司
台式离心机
TDL-5A
上海菲恰尔分析仪器有限公司
漩涡混合器
HQ-60-Ⅱ
北京北方同正生物技术发展有限公司
无菌操作台
SW-CJ-2F
苏州净化设备有限公司
移液枪
KHB
上海科华实验系统有限公司
电子天平
JJ200
常熟市双杰测试仪器厂
冰箱
BCD-155TDGA
青岛海尔股份有限公司
BCD-232MA/X1
海信容声冰箱有限公司
洁净操作台
SW-CJ-1FD
苏净集团苏州安泰空气技术有限公司
万用电炉
DL-1
北京中兴伟业仪器有限公司
pH计
DELTA320
梅特勒-托利多（METTLERTOLEDO）
试验方法
2.3.1常用培养基的配制方法
１、牛肉膏蛋白胨培养基
配方：
牛肉膏ｇ；蛋白胨1ｇ；氯化钠ｇ；琼脂2ｇ；蒸馏水100mL；
pH～。
步骤：
（1）称量：
准确地称取牛肉膏、蛋白胨、氯化钠放入烧杯中。
牛肉膏要玻棒挑取，放在小烧杯中称量，用热水溶化后倒入三角瓶。
也可放在称量纸上，称量后直接放入三角瓶中，按比例加水后再稍微加热，牛肉膏便会溶于水中，然后立即取出称量纸。
另外称取蛋白胨时要迅速准确。
（2）融化：
可先加少许水量在电炉上加热使其溶解。
药品完全溶解后，再补充水分。
将琼脂加到融化的药品中，不断搅拌加热，防止琼脂糊底，烧杯破裂。
最后再补充所失的水分。
（3）调pH：
先用精密纸测量培养基的pH值，一般pH偏酸，再向培养基中逐滴加入1mol/L的NaOH，一边加一边搅拌，并不停的用pH试纸测其pH值，直至pH达～。
注意慢调，以避免过碱，再回调pH，否则，会影响培养基内各离子的浓度，还有可能破坏培养基的成分。
如果有pH计，还可以用pH计。
（4）分装，加塞，包装：
按要求可将培养基分装于试管内或三角烧瓶内。
分装时要注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，避免沾污棉塞而引起污染。
固体若装于试管，则其装量不应超过管高的1/5，灭菌倾斜放置，制成斜面。
三角瓶的装量不应超过容积的一半。
（5）灭菌，无菌检查：
将上述培养基以1.05kg/cm2，121.3℃，20分钟高压蒸汽灭菌。
如不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。
灭过菌后再将培养基放入37℃的温室中培养24～48小时，以检查灭菌是否彻底。
２、PDA培养基
配方：
马铃薯100ｇ；葡萄糖10ｇ；琼脂10ｇ；蒸馏水500mL；自然pH。
步骤：
（1）称量：
先把马铃薯洗干净，除去皮,再称取100ｇ马铃薯切成小块，加水煮烂（煮沸20～30分钟，能被玻璃棒戳破即可），用8层纱布过滤。
（2）溶解：
可加热后再加琼脂，搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖，搅拌均匀，稍微冷却后再补充水分至500mL。
分装、加塞、包扎、灭菌与上面的相似，如需备用，可冷存。
3、LB液体培养基
配方：
胰蛋白胨10ｇ；酵母提取物5ｇ；NaCl10ｇ；蒸馏水1000mL；pH：
步骤：
根据配方配置培养基，液体分装时不超过试管的1/4为宜，不超过三角瓶的1/2为宜，包扎灭菌等步骤与上面的相似。
2.3.2采取土样
在河南工业大学西门口的大谢村小麦地采取土样，用小铲挖取小麦根系土壤，选取５个点的小麦根系土壤，混合后备用。
2.3.3分离土样中的细菌
将采集到的麦田土壤作为内生细菌分离对象。
取采集到的10ｇ土样置于装有90ml无菌水的三角瓶中，200r/min震荡30min即成10-1菌悬液，将所得的菌悬液吸取10ml置于装有90ml的无菌水三角瓶中，依次稀释成10-4、10-5、10-6，取稀释液涂布于装有牛肉膏蛋白胨培养基的平板上。
4次重复，28℃培养3～4d，记录单菌落数量。
根据平板上长出菌落的形态、颜色、大小等特征挑取不同单菌落，反复纯化后接斜面保藏。
2.3.4筛选拮抗细菌
1、拮抗细菌的初筛
用对峙培养法，取直径为8mm的禾谷镰刀菌菌饼置于PDA培养基平板（d=90mm）中央，用接种环挑取细菌菌株点接在距离平板中央30mm处，28℃培养3～5d后测量抑菌带宽度，以仅接种禾谷镰刀菌的处理为对照，每个处理重复4次。
观察菌落的生长变化，根据公式计算抑制率，筛选出具有拮抗活性的菌株。
抑菌率（%）=[（对照菌落直径（mm）-处理菌落直径（mm））/对照菌落直径]×100%
2、拮抗细菌的复筛
对有明显抑菌效果的细菌接种于装有100mL液体LB培养基的三角瓶中，三角瓶置于37℃摇床中，培养2d，将混浊的菌悬液注入无菌离心管中离心10min（5000rpm）可得到上清液。
在无菌操作台上，抽取上清液，用细菌过滤器滤去上清液中的细菌。
取200uL无菌发酵液，涂布平板，待其凉干，接病原菌菌饼，每菌种三个重复并做对照，5～7d后观察对峙效果，测量抑菌圈直径或者半径。
2.3.5细菌的生理生化鉴定
１、形态学观察
采用插片法、埋片法,对该拮抗细菌的菌落形态特征作镜检观察。
用革兰氏染色进行油镜观察。
①革兰氏染色
溶液和试剂：
革兰氏染液，草酸铵结晶紫染液，卢戈式碘液，95%乙醇，番红复染液等。
试验步骤：
（1）涂片：
取活跃生长期菌种按常规方法涂片（不易过厚）、干燥和固定。
（2）初染：
滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位1～２min，用水冲洗至流出水无色。
（3）媒染：
先用卢戈氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖１min，倾去碘液，水洗至流出水无色。
（4）脱色：
在上述涂片上流加95%乙醇溶液（一般20～30s），当脱色至流出液无色时立即用水洗去乙醇。
（5）复染：
将玻片上残留水用吸水纸吸去，用番红复染液染色2min，水洗，用吸水纸吸去残水晾干。
（6）镜检：
用油镜观察。
②芽孢染色
（1）制片：
按常规方法涂片、干燥及固定。
（2）加热染色：
向载玻片滴加数滴5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，用夹子夹住载玻片在微火上加热至染液冒蒸汽并维持５min，加热时应注意补充染液，切勿让涂片干涸。
脱色：
待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水无色。
（3）复染：
用%番红水溶液复染2min。
（4）水洗：
用缓流自来水冲洗至无色。
（5）镜检：
晾干载玻片后油镜镜检。
③鞭毛染色（硝酸银染色法）
（1）载玻片准备：
将载玻片置于含洗衣粉或洗涤剂的水中煮沸20min，然后用清水充分洗净，再置于95%乙醇中浸泡，使用时取出在火焰上烧去乙醇及可能残留的油迹。
（2）菌液制备：
用接种环挑取菌落边缘菌体，悬浮于1～2mL无菌水中制成菌悬液，不能剧烈震荡。
（3）制片：
取一滴菌悬液滴到载玻片一侧，倾斜玻片，使菌悬液流向另一边，用吸水纸吸取多余的菌悬液，自然干燥。
（4）染色：
滴加硝酸银染色A液覆盖3～5min，用蒸馏水充分洗去A液，再滴加B液染色约1min，期间可用微火加热，当涂面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗。
自然干燥后用油镜观察。
菌体呈深褐色，鞭毛显褐色。
（5）镜检：
用油镜镜检观察。
A、B液需现用现配（4h内效果最佳，1d内可用）：
A：
单宁酸5ｇ，三氯化铁ｇ，蒸馏水100mL，加1%氢氧化钠1mL，15%甲醛2mL。
B：
硝酸银粉末2ｇ，水100mL，溶解匀均，取出10mL回滴用，往90mL溶液中加浓氨水到出现大量沉淀时再加浓氨水至溶液澄清。
加10mL回滴液回滴至出现薄雾。
２、糖类分解试验
配方：
蛋白胨ｇ；NaClｇ；%溴百里香酚兰；葡萄糖ｇ；蒸馏水100mL。
基本原理：
糖类分解实验是常用的鉴别微生物的生化反应，鉴定细菌能否利用分解某种糖产生有机酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氨气、甲烷、二氧化碳等）。
当发酵产酸是，指示剂可有紫色（）转变为黄色（）。
气体的产生可由倒置的小管中有无气泡来证明。
试验步骤：
用记号笔在试管外面分别标明发酵培养基名称和所接种的细菌的编号。
取盛有葡萄糖发酵培养基的试管，按编号接种细菌，每种细菌做两个平行，可留一个空白，作为对照。
在接种后要轻摇试管，防止倒置的小试管进入气泡。
再将将上述已接种的和对照管置37℃温室中培养2～3d。
观察颜色变化及小试管中有无气泡。
3、V-P试验
配方：
蛋白胨；葡萄糖；K2HPO4；蒸馏水300mL；pH：
基本原理：
此实验也是常用的检验细菌的生化反应之一。
某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境再被空气中的氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基生成红色化合物，称V-P反应。
试验步骤：
将被检菌接种于试验培养基中，培养2～7d后，于培养物中加入1mL10％的NaOH，混匀，再加入3～4滴2%氯化铁溶液。
数小时后，培养基表面的下层出现红色者，为阳性。
4、甲基红试验
配方：
与V-P试验的配方相同
基本原理：
某些细菌在糖代谢过程中，会分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸还可进一步分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基pH将至以下，当加入甲基红试剂则呈红色，为甲基红试验阳性。
若细菌分解葡萄糖产酸量小，或者产生的酸进一步转化为其它物质（如醇、酮、醚、气体和水等），则培养基的酸度仍会在以上，故加入甲基红指示剂呈黄色，为阴性。
试验步骤：
接种细菌于培养基，在37℃培养2～7d后，于培养物中加入几滴甲基红酒精溶液（ｇ甲基经溶于300mL95%乙醇中，加蒸馏水至500mL），如呈红色，表示阳性。
5、柠檬酸盐利用试验
配方：
柠檬酸钠1ｇ；硫酸镁ｇ；NaCl5ｇ；NH4H2PO41ｇ；K2HPO41ｇ；琼脂20ｇ；1％溴麝香草酚蓝酒精溶液10mL；蒸馏水1000mL。
基本原理：
柠檬酸盐试验是用来检测柠檬酸盐能否被利用。
细菌在分解柠檬酸盐及培养基中的磷酸铵后，产生碱性化合物，是培养基的pH升高，当加入1%溴麝香草酚蓝指示剂时，培养基就会有绿色转变为深蓝色。
溴麝香草酚蓝的指示范围为：
pH小于时呈黄色，pH在～时为绿色，pH大于时呈蓝色。
试验步骤：
将被检菌接种到Simmons固体柠檬酸盐培养基上，37℃下培养2～4d，能利用柠檬酸盐的细菌表现为有细菌生长，培养基变为蓝色，不能利用柠檬酸盐的细菌不生长，培养基不变色。
6、硝酸盐还原试验
配方：
硝酸钾ｇ；蛋白胨5ｇ；蒸馏水1000mL；pH：
。
甲液：
４-苯胺磺酸（对氨基苯磺酸）ｇ；5mol/L冰醋酸50mL。
乙液：
α-萘胺ｇ；5mol/L冰醋酸50mL。
基本原理：
某些细菌能还原硝酸盐为亚硝酸盐，亚硝酸盐与醋酸作用，生成亚硝酸，亚硝酸与试剂中的４-苯胺磺酸作用生成重氮基苯磺酸，后者与α-萘胺结合生成N-α萘胺偶苯磺酸。
试验步骤：
将被检细菌接种于硝酸盐培养基中，37℃培养1～2d，每管中先加入甲试剂，再加乙试剂数滴，如出现红色，表示阳性。
注：
本试验阴性的原因有三：
细菌不能还原硝酸盐；亚硝酸盐继续分解，生成氨和氮；培养基不适于细菌的生长。
如欲检查培养基中硝酸盐是否未被分解，可再加入锌粉少许，可使硝酸盐还原为亚硝酸盐而呈现红色。
7、淀粉水解试验
配方：
牛肉膏ｇ；蛋白胨1ｇ；氯化钠ｇ；可溶性淀粉ｇ；蒸馏水100mL；琼脂2ｇ；pH：
～。
基本原理：
有些细菌具有合成淀粉酶的能力，可以分泌胞外淀粉酶。
淀粉酶可以使淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖，淀粉水解后遇碘不再变蓝色。
试验步骤：
将细菌划线接种于平板上，37℃左右培养1～2d，生长后取出，在菌落处滴加革兰氏碘液少许，能水许解淀粉的细菌菌落周围有透明环，培养基会呈深蓝色。
8、吲哚（靛基质）试验
配方：
蛋白胨1ｇ；NaClｇ；蒸馏水1000mL；pH：
。
吲哚试剂自行配制：
对二甲基氨基苯甲醛；乙醇（95%）；浓盐酸10mL。
基本原理：
有些细菌可以产生色氨酸酶，分解色氨酸，产生吲哚和丙酮酸。
吲哚与二甲基氨基苯甲醛反应生成红色的玫瑰吲哚，因此可根据细菌能否分解色氨酸产生吲哚来鉴定菌种。
试验步骤：
将待检菌种接种于邓享氏蛋白质的胨溶液中，37℃培养1～2d。
于培养液中加入戊醇或二甲苯2～3mL，摇匀，静置片刻后，沿管壁加入吲哚试剂2ml，如出现红色沉淀，表示为阳性。
9、接触酶试验
配方：
牛肉膏蛋白胨培养基
基本原理：
具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和新生态氧，继而形成分子氧出现气泡。
试验步骤：
将1ml3%的H2O2倾注于生长物（菌落或菌苔）上，有气泡（O2）发生者为阳性。
也可于清洁小试管中加少量（30%），再用清洁无菌的细玻棒（或火焰封口的毛细管或镍铬做成的接种环）醮细菌少许，插入H2O2液面下，有气泡者为阳性。
也可在玻片上滴一滴H2O2蘸取少许培养物，混合，有气泡者为阳性。
2.3.6确定菌种类型
参考《伯杰氏细菌鉴定手册》（Buchanan＆Gibbons，1984）和《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠和蔡妙英，1999）确定菌种类型。
分子鉴定方法
升级会员 