发酵工程实验指导.docx
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发酵工程实验指导
实验1KLa的测定方式
氧是难溶气体，在25℃和1个大气压下，纯水中溶解度为mol/m3左右。
在好氧发酵进程中，氧气由气相传递到液相，为微生物消耗。
氧的传递进程限速阻力位液膜时期，现在Kla是描述氧的传递性能的重要参数。
把握利用亚硫酸盐测定容积氧体积传递系数的方式，了解氧传递在好氧发酵进程中的重要作用。
2原理
以Cu离子为催化剂，溶解于水中的O2能当即将水中的SO32-氧化为SO42-，其氧化反映的速度几乎与SO32-浓度无关。
事实上是O2一经溶入液相，当即就被还原掉。
这种反映特性使溶氧速度成为操纵氧化反映的因素。
其反映式如下：
Cu2+
2Na2SO3+O22Na2SO4
剩余的Na2SO3与过量的碘作用
Na2SO3+I2+H2ONa2SO4+2HI
剩余的I2用标准Na2S2O3溶液滴定。
I2+2Na2S2O3Na2S4O6+2NaI
O2~
Na2SO3~
I2~
Na2S2O3
1224
可见，每溶解1molO2，将消耗2molNa2SO3，将少消耗2molI2，将多消耗4molNa2S2O3。
因此可依照两次取样滴定消耗Na2S2O3的摩尔数之差，计算体积溶氧速度。
公式如下：
式中NV：
两次取样滴定消耗Na2S2O3体积之差，
M：
Na2S2O3浓度，
t：
两次取样时刻距离，h
V0：
取样分析液体积。
将上述NV值代入公式
即可计算出kLa
由于溶液中SO3-2在Cu2+催化下瞬即把溶解氧还原掉，因此在搅拌作用充分的条件下整个实验进程中溶液中的溶氧浓度C=0。
在（1atm）下，25ºC时空气中氧的分压为，依照亨利定律，可计算出C*=L，但由于亚硫酸盐的存在，C*的实际值低于L，因此一样规定C*=L。
因此kLa=NV/
亚硫酸钠氧化法的优势是不需专用的仪器，适用于摇瓶及小型实验设备中kLa的测定。
缺点是：
测定的是亚硫酸钠溶液的体积溶氧系数kLa，而不是真实的发酵液中的kLa。
3.试剂
a.LNa2S2O3溶液（需要标定），在利用前1-2周配置
b.淀粉溶液：
称取1g淀粉，放入100mL的水中加热搅拌煮沸2-3min.
的I2溶液：
称取30gKI，加入10mL,溶解，再称取碘搅拌充分溶解，定容（依如实验用量调剂），避光保留。
d.L硫酸铜溶液
4.仪器
吸管，50mL三角瓶、酸式滴定管、300-500mL三角瓶。
5.实验步骤及方式
测定Kla的反映装置，加入适当浓度，如xmol/L（~L）Na2SO3溶液，每升Na2SO3溶液加入1mlL硫酸铜溶液.。
在通风搅拌后开始计时（准确秒表）及距离准确时刻取样时，取样量略少于x,以便于取样为准。
取样时注意，迅速取样10mlNa2SO3溶液加入L的I2溶液25ml溶液中。
吸管必然要尽可能的靠近碘液液面。
然后用标准的LNa2S2O3溶液进行滴定。
6.实验记录及报告
反应液组成
Na2SO3：
mol/L
实验条件
反应器名称及规格
反应液体积
反应温度
转速、绝对气压
两次取样间隔t/s
两次滴定Na2S2O3溶液体积差
Kla（1/h）
Kla（1/h）平均值
试探题
1.实际发酵进程中可否用此法进行测定容积氧传递系数？
2.关于几十立方的发酵罐该法是不是可行？
3.什么缘故要吸管必然要尽可能的靠近碘液液面
实验2菌体生长动力学参数的求取（第一部份）
目的和要求
把握DNS法测定还原糖和多糖的方式，绘制出标准曲线。
一.原理
3，5-二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在必然范围内还原糖的量和反映液的颜色深度成正比。
因此，可利用分光光度计进行比色测定，求得样品的含糖量。
材料与试剂
a）材料：
葡萄糖（分析纯）、蒸馏水
b）试剂：
DNS液
1）以称取3,5-二硝基水杨酸（C7H4N2O7）g，氢氧化钠g充分溶解于500ml蒸馏水中（水先煮沸10分钟后冷却）
（2）加入酒石酸钾钠（C4H4O6KNa·4H2O），苯酚（在50℃水中融化），偏重亚硫酸钠（NaS2O5），搅拌至全溶，定容至1000ml。
（3）充分溶解后盛于棕色瓶中，放置10天后即可利用。
平常盛一小瓶放在外面利用，其它储于冰箱中。
此溶液每一个月配制一次。
c）器材：
容量瓶、吸管（1mL,5mL,25mL）、烘箱、试管架、吸耳球、称量纸、分光光度计、烧杯、恒温水浴锅、离心机、记号笔、电炉、搪瓷缸
二.操作方式
a）标准曲线的制作
管号
0
1
2
3
4
5
葡萄糖标准液（mL）
0
蒸馏水（mL）
2
DNS试剂（mL）
沸水浴（min）
5
冷却
流水冷却
蒸馏水（mL）
A540
三.结果
1.以吸光度为横坐标，葡萄糖质量为纵坐标作图。
并借助运算机计算出相关系数和曲线方程。
动力学参数求取（第二部份）
自20世纪40年代至今，微生物生理学者和生物化学工程学者提出了许多关于微生物生长的动力学模型。
这些生长模型依照Tsuchiya理论可分为
（1）确信论的非结构模型，是一种理想状况，不考虑细胞内部结构，每一个细胞之间无不同。
（2）确信论的结构模型，每一个细胞之间无不同，细胞内部有多个组分存在。
（3）概率论的非结构模型，不考虑细胞内部结构，每一个细胞之间有不同。
（4）概率论的结构模型，考虑细胞内部结构，每一个细胞之间有不同。
从工程角度看，理想的微生物生长模型应具有以下4个条件：
（1）要明确成立模型的目的。
（2）明确地给出成立模型的假定条件，如此才能明确模型的适用范围。
（3）希望所含有的参数，能够通过实验逐个确信。
（4）模型应尽可能简单。
目前，常利用确信论的非结构模型是Monod方程。
莫诺方程（Monod方程）
，式中：
μ：
生长比速（h-1）
μmax：
最大生长比速（h-1）
S:
单一限制性基质浓度（mol/L）
KS:
微生物对基质的半饱和常数（mol/L）
μ
S
μm
μm
KS
Scrit
依照细胞生长动力学，细菌生长速度能够表示为
依照细胞生长动力学，细菌的生长速度能够表示为
因此
在短时刻内上式可表示为
以
作图，为一直线那么符合monod方程，通过斜率和截距可求取动力参数Ks与rmax.
二、方式步骤
1.培育基配置：
葡萄糖30g，NaCl5g，牛肉膏5g，蛋白胨10g，水1000ml；分装值500ml三角瓶中装瓶量为200mL,蒸汽灭菌25min.
2.待培育基降至室温，无菌接入种子10mL,放置于37℃恒温摇床振荡培育；
时间t
发酵液中葡萄糖浓度S
菌体吸光度OD600nm
8h
9h
10h
11h
12h
注意：
葡萄糖浓度较高稀释后，（具体稀释倍数以吸光度测定值在02~之间为准）测定的吸光度乘以稀释倍数依照标准曲线进行换算为浓度。
一样当菌体浓度吸光度大于1时，要适当稀释（具体稀释倍数以吸光度测定值在02~之间为准）测定的吸光度乘以稀释倍数。
三．数据分析
序号
Δt
X
ΔX
1
1
（S8h+S9h）/2
（8h时的OD600nm~9h时的OD600nm）
9h时的OD600nm-8h时的OD600nm
（9h时的OD600nm+8h时的OD600nm）/2
求取方法见上
例如
2
3
4
以
作图，符合monod方程，通过斜率和截距可求取动力参数Ks与rmax.
五、实验分析
六、总结
实验3发酵罐的构造和操作原理
[目的要求]
了解生物发酵罐的大体结构和操作方式
[实验原理]
发酵罐是最多见和经常使用的生物反映器，已经实现生物发酵各类工艺参数的在位测定和自动操纵。
[内容]
发酵罐大体结构与操作方式。
发酵罐的大体结构：
生物发酵罐系统=罐体系统+操纵机箱+空气紧缩机+蒸汽发生器
操作流程：
开机→空罐灭菌→加入培育液→实罐灭菌→冷却→接种→工艺参数设定→运行：
发酵+通气→终点：
放料→清洗→关机。
1.罐体系统
罐身：
由硼硅玻璃和不锈钢（316L）加工而成。
密封件：
机械密封、硅橡胶“O”型圈。
罐盖：
排气冷凝器口、pH电极口、取样放料孔、取样回气孔、液位电极口、接种口、温度电极口、DO电极口、接地线插口、进气孔、单孔补料孔、三口补料孔、泡沫电极口。
2.管阀系统
管阀系统由EW—冷却水电磁阀、W1一溢流水阀、W2一排水排汽阀、S一进蒸汽调剂阀、G—气路调剂阀、不锈钢管路、优质胶管、接头等组成。
电极的校止进入pH电极校止后，显示界面如以下图所示。
pH：
**.**CALIB
TEMP：
***CAUTO
SLOPE：
*.**+/-
ZERO：
***+/-
校正时，温度补偿是自动的，校正温度应选择于发酵液工作温度周围。
操作人员须将随机提供的温
度电极和pH电极一同插入中性标准溶液，如pH=，通过面板调整零位ZERO，（用箭头键移动光标到
ZERO行的+/-上，按ENTER键即可）使屏幕上pH指示值接近，再将pH计和温度电极一路插入标准的酸性或碱性溶液，如pH=。
调整斜率SLOPE（用箭头键移动光标到SLOPE行的+/-上，按ENTER键即可）使pH指示接近4，再重复上述进程1--2次，使pH指示达到标准溶液的pH值即可。
斜率SLOPE的转变范围：
，零位ZERO的转变范围122-143，校正完毕用ESC键退出。
实罐灭菌后及发酵进程中应付pH电极进行在线校正。
从罐内掏出样品后，即用标准pH计检测样品
的pH值，再进入CALIB程序，调整零位ZERO，使液晶显示器显示的pH值与标准pH计显示值相同。
显然，你应保证这标准pH计是正确的。
4.DO2电极的校正
进入DO2电极校正后，显示界面如以下图所示。
DO2：
***%CALIB
TEMP：
***CAUTO
SLOPE：
*.**+/-
ZERO：
****+/-
校正时，温度补偿是自动的，校正温度应选择在发酵：
工作温度周围。
操作员将溶氧电极放入些遮酸钠趣盘遥遮，调整零位ZERO，使DO2指示接近于0%，最好为1%--2%，再将溶氧电极掏出，以空气作为100%溶氧量来标定，调楚斜率SLOPE使DO2达到100%，再重复上述进程1—2次即可。
SLOPE的调整范围：
—，ZERO的调整范围：
1—25。
校正完毕用ESC键退出。
实罐灭菌后，在接种发酵刚开始，
应付DO2电极进行在线校正，进入CALIB程序，调整斜率SLOPE，使液晶显示器显示的DO2值达到100%。
5.实罐灭菌
第一步装上已校正好的pH、DO电极
第二步按工艺要求在罐内放入发酵培育液。
第三步夹套加热，开启搅拌，待温度上升至90℃左右，停止夹套加热，关闭搅拌；
第四步空气过滤器、取样口通入蒸汽加热。
当灭菌接近15min左右终止时，关闭空气过滤器蒸汽，打开空气过滤器排污阀，启动空气紧缩机，通入空气过滤器。
第五步操纵蒸汽阀门和尾气阀门大小稳固罐体蒸汽压在至灭菌终止；
第六步打开冷却水关闭排污阀，启动搅拌，降温。
6接种
采纳火焰接种法
7.发酵操纵参数设定，进入发酵，按时取样分析，并操纵。
发酵终止，放罐，拔出电极并加以爱惜，清洗发酵罐，灭菌。
[报告]
1.绘画生物发酵罐的详细结构。
2.说明生物发酵罐的操作方式。
3.说明生物发酵罐操作的注意事项。
实验4枯草芽孢杆菌生长条件优化
在工业化发酵生产中，发酵培育基的设计是十分重要的，因为培育基的成份对产物浓度、菌体生长都有重要的阻碍。
实验设计方式进展至今可供人们依如实验需要来选择的余地也专门大。
目前最经常使用的方式有, 单因素法（Oneatatime）、
正交实验设计（Orthogonaldesign）、均匀设计（Uniformdesign）、全因子实验设计（Fullfactorialdesign）、部份因子设计（fractionalfactorialdesign）、Plackett-Burman设计（Plackett-Burmandesign）
中心组合设计（Centralcompositedesign） 、Box–Behnken设计（Box–Behnkendesign）、响应曲面分析法、改良单纯形优化法（Modifiedsimplexmethod）
、遗传算法（Geneticalgorithm，GA）等。
正交设计法（4学时）
[目的要求]
把握发酵工艺条件或参数的多因素实验设计和操作方式。
[实验原理]
发酵进程涉及到数个工艺参数，每一个参数有多个水平，每一个因素之间还存在交互作用。
采纳正交实验设计方式进行多因素、多水平的实验，能够大大减少实验，并确信各因素之间的交互作用。
实验次数能够减少为：
水平数的平方次。
在多因素实验中，随实在验因素的增多，处置数据呈几何级数增加。
例如，2个因素各取3个水平的实验（简称32实验），有32=9个处置，3因素各取3个水平的实验（简称33验），有33=27个处置，4因素各取3个水平的实验（简称34验），有34=81个处置……处置数太多，实验规模变大，会给实验带来许多困难。
采纳正交实验设计，能够大大减少实验次数。
正交实验设计是利用一套规格化的表格——正交表来安排实验，适用于多因素、多水平、实验误差大、周期长等的实验，是效率较高的一种实验设计方式。
[教学内容]
分组进行多个因素多个水平的多因素实验，测定实验结果。
依如实验设备条件，本实验为4因素3水平实验，正交实验次数为9次，采纳L9（34）正交设计表。
表1实验因素水平设计表
序号
试验因素/剂量
水平1
水平2
水平3
1
接种量/%
1
5
10
2
装瓶体积/mL/瓶
25
50
150
3
pH
6
7
8
表2L9（34）正交实验因素设计与结果记载表
实验
序号
接种量
/%
pH
装瓶体积
/mL
培养液OD值
原始记载
平均值
1
1=1%
1=6
1=25
1
2
1=1%
2=7
2=50
2
3
1=1%
3=8
3=150
3
4
2=5%
1=6
2=50
3
5
2=5%
2=7
3=150
1
6
2=5%
3=8
1=25
2
7
3=10%
1=6
3=150
2
8
3=10%
2=7
1=25
3
9
3=10%
3=8
2=50
1
[实验器材]
1.活材料：
复筛菌株斜面或培育液。
2.器材：
高压锅、恒温摇床、振荡培育箱、酸度计、分光光度计、吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸。
[实验方式]
1.培育基配方：
1）基础培育基：
，蛋白胨5g，酵母粉/膏2g，水，pH自然。
2.配制培育基：
每组组号做序号相对应的实验，计算培育液体积：
每一个处置重复3次，每瓶装液体培育基100mL，计算培育液体积。
称样后加入容器中，加少量水，搅拌并适当加热加水溶解。
用量筒分装在培育瓶中，每瓶装实验处置相应体积的培育液。
用8层纱布、或棉塞、。
标签。
3.灭菌：
，20min。
冷却后出锅，掏出，放入超净工作台中风冷，用紫外线照射20min。
4.接种：
用无菌的5mL或10mL无菌移液管，每瓶依照接种剂量等量接入菌种。
封口。
标签。
5.培育：
接种后的培育瓶放在振荡培育箱或恒温摇床上培育，相同温度条件下进行培育。
6.测定：
16小时测定培育瓶中培育液的OD值。
每次重复测定3次以上。
计算平均值。
[报告]
2.进行方差分析得出最正确条件。
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