细胞培养关键技术.docx

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细胞培养关键技术

细胞培养技术

一、细胞培养基本概念

　细胞培养是指从体内组织取出细胞摹拟体内浮现环境，在无菌、恰当温度及酸碱度和一定营养条件下，使期生长繁殖，并维持其构造和功能一种培养技术。

细胞培养培养物为单个细胞或细胞群。

　　在医学遗传学研究中应用最广泛是外周血淋巴细胞、皮肤或纤维细胞和各种能在体外长期生长细胞系。

外周血淋巴细胞培养具备时间短、技术简便、可重复取材等长处，它在临床染色体分析中使用最广泛。

体外培养细胞株可在培养过程中发生自发或在外界作用下转化，成为永久细胞系，也可直接建成永久细胞系，永久细胞系能在体外无取制传代和生长。

永久细胞系普通具备非整倍体细胞和各个细胞核型不完全相似特性。

但细胞克隆细胞系其这一特性可以不明显。

二、细胞培养环境

　　细胞在体外培养中所需条件与体内细胞基本相似。

　　1、无污染环境

　　培养环境无毒和无菌是保证细胞生存首要条件。

当细胞放置于体外培养时，与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。

因而在进行培养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生存基本条件。

　　2、恒定温度

　　维持培养细胞旺盛生长，必要有恒定适当温度。

人体细胞培养原则温度为36.5℃±0.5℃，偏离这一温度范畴，细胞正常代谢会受到影响，甚至死亡。

培养细胞对低温耐受力较对高温强，温度上升不超过39℃时，细胞代谢与温度成正比；人体细胞在39-40℃1小时，即能受到一定损伤，但仍有也许恢复；在40-41℃1小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有也许恢复；41-42℃1小时，细胞受到严重损伤，大某些细胞死亡，个别细胞仍有恢复也许；当温度在43℃以上1小时，细胞所有死亡。

　　3、气体环境

　　气体是人体细胞培养生存必须条件之一，所需气体重要有氧气和二氧化碳。

氧气参加三羧酸循环，产生供应细胞生长增殖能量和合成细胞生长所需用各种成分。

开放培养时普通把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。

　　二氧化碳既是细胞代谢产物，也是细胞生长繁殖所需成分，它在细胞培养中重要作用在于维持培养基PH值。

大多数细胞适当PH为7.2-7.4，偏离这一范畴对细胞培养将产生有害影响。

但细胞耐酸性比耐碱性大某些，在偏酸环境中更利于细胞生长。

有资料显示，原代羊水细胞培养PH6.8时最适。

　　细胞培养液PH浓度调节最惯用为加NaHCO3办法，由于NaHCO3可供CO2，但二氧易于逸出，故最合用于封闭培养，而羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）因其对细胞无毒性，也起缓冲作用，有防止PH迅速变动特性而用于开放细胞培养技术中，其最大长处是在开放式培养或细胞观测时能维持较恒定PH值。

　　4、细胞培养基

　　培养是既是培养细胞中供应细胞营养和促使细胞生殖增殖基本物质，也是培养细胞生长和繁殖生存环境。

培养基种类诸多，按其物质状态分为半固体培养基和液体培养基两类；按其来源分为合成培养基和天然培养基。

（1）合成培养基：

合成培养基是依照细胞所需物质种类和数量严格配制而成。

内含碳水化合物、氨基酸、脂类、无机盐、维生素、微量无素和细胞生长因子等。

单独使用细胞虽有生存但不能较好生长增殖。

（2）天然培养基：

使用最普遍天然培养基是血清，基本以小牛血清最普遍。

血清由于具有各种细胞生长因子、促贴附因子及其多活性物质。

与合志培养基合用，能使细胞硕利增殖生长。

常用使用最为5-20%。

三、细胞培养设施和基本条件

　　1、实验室设计

　　细胞培养是一种无菌操作技术，规定工作环境和条件必要保证无微生物污染和不受其他有害因素影响。

细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响，规定工作环境清洁、空气清新，干燥和无烟尘。

细胞培养工作涉及：

工作液配制、无菌操作（采样）、温育、无菌解决，细胞和用品贮存等。

细胞培养室设计实行原则普通是无菌操作区设在室内较少走动内侧，常规操作和封闭培养于一室，而洗刷消毒在另一室。

　　2、惯用设施及设备

（1）超净工作台：

也称净化工作台，分为侧流式、直流式和外流式三大类。

（2）无菌操作间：

普通由更衣间、缓部间和操作间三某些构成。

操作间放置净化工作台及二氧化碳培养箱、离心机、倒置显微镜等。

缓冲间可放置电冰箱、冷藏器及消毒好无菌物品等。

　　（3）操作间：

普通培养箱、离心机、水浴锅、定期钟、普通天平及寻常分析解决物品。

　　（4）洗刷消毒间：

烤箱、消毒锅、蒸馏水解决器及酸缸等。

　　（5）分析间：

显微镜、计算机及打印机等。

　　3、培养器皿

　　细胞培养以玻璃器皿为主，常准备最需是使用最三倍。

器皿应选取透明度好、无毒、中性硬度玻璃制品。

惯用玻璃器皿有下面几种。

（1）液体储存瓶：

用于储存各种配制好培养液、血清等液体，常以500ml、250ml、100ml生理盐水瓶或血浆瓶代替。

（2）培养瓶：

依照培养细胞种类规定不同培养瓶形态各异，用于细胞传代培养细胞规定瓶壁厚簿均匀，便于细胞贴壁生长和观测，瓶口要大小一致，口径普通不不大于1cm，容许吸管伸入瓶内任何部位，规格有200ml、100ml、50ml、25ml、10ml等几种。

用于外周血培养惯用10ml普通圆瓶。

两种培养瓶均规定选用优质玻璃制成。

　　（3）培养皿：

用于开放式培养及其他用途。

分直径30mm、60mm、120mm等几种。

　　（4）吸管：

惯用有长吸管和短吸管两类，长吸管也称刻度吸管。

其改良后管上部有球型刻度称改良吸管，刻度吸管用于移动液体。

惯用1ml和10ml两种。

短吸管也叫滴管，分弯头和直头两种。

　　（5）离心管：

离心管是细胞培养中使用最广泛器皿，依照用途不同形态各样，惯用于细胞培养离心管有大腹式尖底离心管和普通尖底离心管两类。

前者分别为50ml、30ml、15ml；后者则多为10ml和5ml。

　　（6）其他：

如三角烧瓶、烧杯、量筒、漏斗、注射器等。

四、培养细胞形态

　　体外培养细胞依照它们在培养器皿与否能贴附于支持物上生长特性，可分为贴附型生长和悬浮型生长两大类。

贴附型细胞在培养时能贴附在支技物表面生长。

如羊水细胞为贴附型细胞，常体现为成纤维型细胞和上皮细胞生长。

悬浮型细胞在培养中悬浮生长。

　　1、成纤维型细胞

　　在培养中细胞凡形态与成纤维细胞类似时，皆可称之为成纤维细胞。

本型细胞由形态与体内成纤维细胞形态相似而得名，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞中央有卵园形核，胞质向外伸出2-3厘米个长短不同突起，除真正成纤维细胞外，凡由中胚层间质来源组织细胞常呈本类形态生长。

　　2、上皮型细胞

　　此类型细胞在培养器皿支持物上生长具备扁平不规则多角形特性，细胞中央有园形核，细胞紧密相连单层膜样生长。

来源于内、外胚层细胞如皮肤、表皮衍生物、消化管上皮等组织细胞培养时，皆呈上皮型形态生长。

　　3、游走型细胞

　　本型细胞在支持物上散在生长，普通不连成片。

细胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃游走或变形运动，速度快且不规则。

此型细胞不很稳定，有时亦难和其他型细胞区别。

在一定条件下，由于细胞密度增大联成片后，可呈类似多角型或成纤维细腻包形态。

常用于羊水细胞培养初期。

五、培养细胞形态分析

　　培养细胞随贴附支持物形状不同而形态各异，最常用是贴附于平面支持物细胞。

在普通光镜下生存中细胞是均质而透明，构造不明显。

细胞在生长期常有1-2个核仁在细胞机能状态不良时，细胞轮廓会增强，反差增大。

若胞质中时而浮现颗粒、脱滴和腔泡等，表白细胞代谢不良。

六、培养用品清洗与消毒

　　当前国内细胞培养器皿重要仍使用能重复使用玻璃器皿，清洗重要目为清除杂质和微生物，使在器皿内不残留任何影响细胞生长成分。

因而在组织细胞培养中清洗和消毒是一项极为重要环节。

（一）清洗

在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感。

微生物产品附带杂物，上次细胞残留物及非营养成分化学物质，均能影响培养细胞生长。

因而对新使用和重新使用培养器皿都要严格彻底清洗，且要依照器皿构成材料不同，选取不同清洗办法。

　　1、玻璃器皿清洗

　　组织细胞培养中，使用量最大是玻璃器皿，故工作最最大是玻璃器皿清洗。

普通玻璃器皿清洗涉及浸泡、刷洗、侵酸和冲洗四个环节。

清洗后玻璃器皿仅规定干净透明无油迹，并且不能残留任何物质。

（1）浸泡：

初次使用和培养使用后玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶液掉。

新初次使用玻璃器皿，在生产及运送过程中，玻璃表面带有大量干固灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有某些对细胞有害物质等。

新瓶使用前应先用自来水简朴刷洗，然后用稀盐酸液（5）浸泡过夜，以中和其中碱性物质。

再次使用玻璃器皿则常附有大量刚使用过蛋白质，干固后不易洗掉，故用后要及时浸入水中，且规定完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上。

（2）刷洗：

浸泡后玻璃器皿普通要用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢杂质。

刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度。

　　（3）浸酸：

清洁液是由重铬酸钾、浓硫酸和蒸馏水按一定比例配制而成，其解决过程称为浸酸。

清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉微量杂质。

清洁液去污能力很强。

是清洗过程中核心一环。

浸泡时器皿要布满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面。

浸泡时间普通为过夜，不应少于6小时。

清洁液可依照需要，配制成不同强度，惯用下列三种：

重铬酸钾（g）浓硫酸（ml）蒸馏水（ml）（A）强清洁液63100000B）次强清洗液1202001000（C）弱清洁液100100100

　　清洁液配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露某些。

配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。

并不断用玻璃棒搅拌，使产生热量挥发，配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。

并不断用玻璃棒搅拌，使产生热量挥发，配制溶液应选取塑料制品。

配成后清洁液普通为棕红色。

　　（4）冲洗：

玻璃器皿在使用后，刷洗及浸泡后都必要用水充分冲洗。

使之尽量不留污染或洁液残迹。

冲洗最佳用洗涤装置。

即省力、效果又好。

如用手工操作，则需流水冲洗十次以上，每天水须灌满及倒干净，最佳用蒸馏水清洗3-5次，晾干备用。

　　2、胶塞清洗

　　细胞培养中所用橡胶制品重要是瓶塞。

新购买瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规解决，常规清洗办法是：

每次用后及时置入水中浸泡，然后用2%NaOH或洗衣粉煮沸10-20分钟，以除掉培养中蛋白质。

自来水冲洗后，再用1%稀盐酸浸泡30分钟或蒸馏水冲洗后再煮沸10-20分钟，晾干备用。

　　3、塑料制品清洗

　　塑料自制品现多是采用无毒并已经特殊解决包装，打开包装即可用，多为一次性物品。

必要时用2%NaOH浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再用5%盐酸溶液浸泡30分钟，最后用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用。

（二）消毒

　　细胞培养最大危险是发生培养物细菌，真菌和病毒等微生物污染，污染重要是由于操作者疏忽而引起，常用因素有操作间或周边空间不洁，培养器皿和培养液消毒不合格或不彻底，由于关于培养每个环节失误均能导致培养失败，故细胞培养每个环节都应严格遵守操作常规，防止发生污染。

消毒办法分为三类：

（A）物理灭菌法（紫外线、湿热、过渣等）。

（B）化学灭菌法（各种化学消毒剂）。

（C）抗生素。

（1）紫外线消毒：

用于空气，操作台表面和不能使用其他法进行消毒和培养器皿。

紫外线直接照射以便、效果好，经一定期间照射后，可以消灭空气中大某些细菌，培养室紫外线灯应距地面不超过2.5米，且消毒进物品不适当互相遮档，照射不到地方起不到消毒作用。

　　紫外线可产生臭氧，污染空气，试剂及培养液均有不良影响，对人皮肤也有伤害，不适当近照射也进行实验操作。

（2）温热消毒：

即高压蒸气消毒，是一种使用最广泛、效果最佳消毒办法。

温热消毒时，消毒物品不能装得过满，以防止消毒器内气体阻塞而千百万危险，保证其内气体流通。

在加热升压之前，先要打开排气阀门排放消毒器内冷空气，冷气空气排出后，关闭排气阀门，同步检查安全阀活动自如，继后开始升压，当达到所需压力时，开始记算消毒时间。

消毒过程中，操作者不能离开工作岗位，要定期检查压力及安全，防止消毒及表皮意外事件发生。

惯用物品消毒压力及时间：

　　培养液、橡胶制品、10磅10分钟；

　　布类、玻璃制品、金属器械、18磅20分钟。

　　上两种是最常用物理消毒办法。

　　（3）化学消毒法：

最常用是70%酒精及1‰新洁而灭，前者重要用于操作者皮肤，操作台表面及无菌室内壁面解决。

后者则重要用器械浸泡及皮肤和操作室壁面擦试消毒。

化学消毒法操作简朴、以便有效。

　　（4）抗生素消毒：

确切应记成抗生素灭菌，重要用于培养用液灭菌或防止培养物污染。

七、绒毛染色体制备

　　绒毛来源于胚胎中胚层，最早初级干绒毛浮现于孕三周初，孕8周左右是绒毛发育最旺盛时期。

当前国内外绒毛取材多选于8-9周。

研究资料表白，绒毛取样不影响胚胎发育及胎盘功能。

但取样失败可导致胚胎丢失而终结妊娠。

绒毛取样前者一方面要检查阴道分泌物以鉴别阴道干净度，防止取样导致宫内感染。

另一方面需做B超检查，一是拟定胚胎大小，二是拟定胚芽有无心血管搏动，三是拟定胚芽在子宫内位置，用以鉴别取材时间，与否取材及取样器进宫角度及深度。

　　1、实验材料

　　妇科阴道冲洗物品、绒毛取样器、5ml注射器、培养皿、小镊子、5ml离心管、甲酸、柠檬酸钠、冰乙酸、PMRI1640、秋水仙素、载玻片等。

　　2、培养液配制

　　PRMI164010-15ml

　　秋水仙素10ug/ml1ml

　　3、操作过程

（1）1‰新洁而灭冲洗阴道，用卵圆钳固定子宫颈，依照妇查及B超提示选取角度及浓度探性插入绒毛取样器，当有弹性阻挡感且深度符合B超所示时，抽出取样器内芯，接上5ml注射器，抽出4-5ml，此时，注射器内可见有血性液体流进；

（2）取一干净培养皿，内加PRNI16405ml，内含秋水仙素0.06ug/ml。

慢慢抽出取样器，将所吸出物注入培养皿内，并用1640冲洗注射器及取样器，混匀。

置培养箱30-40分钟；（3）挑选发育良好绒毛放入另一小培养皿中，用预温37℃0.075M。

KCL与10%柠檬酸钠1∶1混合液漂洗两次。

（4）用眼科小剪剪碎绒毛，再将2滴秋碱加入上途漂洗低渗液低渗30分钟；（5）加3∶2甲醇冰乙酸固定液0.2ml，预固定，1000rpm8分钟，弃上清液；（6）加新鲜配制3∶2固定液3ml；固定30分钟，rpm8分钟，弃上清液；（7）第二次固定可加3∶1甲醇冰乙酸固定液3ml固定30分钟，rpm8分钟，弃上清液；（8）离心后，加所余体积60%冰乙酸，打匀，2分钟后加等量甲醇，打匀，rpm8分钟，弃上清液。

（9）3m13∶1甲冰固定液过夜，冰水制片；（10）80℃考片2小时，自然冷却。

（11）G分带解决，观片。

八、羊水细胞培养

　　羊水中具有胎儿脱落上皮细胞，可在体外培养用以分析胎儿染色体核型。

当前国内外大都采用腹腔羊膜穿刺术，妊娠12-30周羊水细胞均可培养成功。

羊膜腔穿刺取羊水行染色体分析，最佳孕周为16周左右。

因而时羊水增长快，羊水中细胞较多，细胞培养易于生长，并且不易损伤胎儿。

国内多数选取穿刺时间在妊娠第16-30周。

国外现已较多地采用妊娠初期羊膜穿刺，但需在B超下定位及穿刺。

羊水量按妊娠时间大体计算（1ml/w）。

资料表白，穿刺病例妊娠结局、分娩方式、胎儿出生体重等与未穿刺无明显差别。

　　1、实验材料

　　2,5%碘酒、75%酒精、无菌棉签和棉球、镊子、20-22号无菌腰穿针、吸管、培养瓶、培养液（PRMI1640、199、F10、F12）、小牛血清、秋水仙素、KCL、甲醇、冰醋酸、培养皿、盖玻片等。

　　2、培养液配制

　　F-1285%

　　小牛血清15%

　　双抗100u/ml

　　小瓶贮藏4-8℃

　　3、操作过程

　　A（盖玻片培养法）

（1）采样：

选取妊娠13-14周妇女，在无菌条件下抽取羊水5ml，及时注入无菌离心管中；

（2）收集：

离心分离细胞，1000rpm10分钟，去上清，留0.5ml，轻打混匀；（3）接种：

30mm培养皿中放盖玻片1张，每片滴混匀细胞液1-2滴，置培养箱内培养30-60分钟；（4）培养：

取出后从盖玻片外加培养液2ml，静置培养48小时后观测细胞生殖状况并定期换液，5-10天后，可见大量成纤维细胞或上皮样细胞生长；（5）终结培养：

当有大量圆形发亮细胞浮现时，加秋水仙素0.02-0.04ug/ml，作用10-12小时；（6）低渗：

倒掉培养液，加预温37℃0.075MKCL溶液5ml，37℃温育30分钟，镜下可见胀大羊水细胞，加0.5-1ml3∶1甲醇：

冰醋酸固定液预固定；（7）固定：

倒掉低渗液，加5ml固定液固定30分钟以上，重复3次；（8）干燥：

将附有细胞盖玻片斜放于培养皿中，置80℃烤箱解决2-3小时；（9）胶片：

将附有细胞盖玻片用树脂胶封固于玻片上，正面朝外，小心细胞破坏；

　　B（常规培养法）

（1）—

（2）相似于盖玻片培养法；（3）接种：

将混匀羊水细胞种置于50ml或100ml细胞培养瓶内，平均10ml羊水细胞收集细胞种置一瓶加5-10ml混合培养液。

（4）培养：

酒精灯火先封口，静置培养48小时后观测细胞贴臂及生长状况，5-10天后可见瓶底面有大量羊水细胞生长；（5）终结培养：

同A法；（6）细胞收集：

将培养液倒入一干净离心管中，加0.025%胰蛋白酶0.5-1ml/瓶，轻轻摇动，使培养瓶底面完全接触消化酶，然后用弯头吸管吹打，待细胞所有脱落后加前培养液终结胰蛋白酶消化。

用吸管移细胞悬液于离心管中。

1000-rpm10分钟，弃上清，留细胞沉虑。

若一次消化不彻底，可重复消化；（7）低渗及预固定：

加预温37℃KCL溶液10ml，37℃温育30分钟，加0.5-1ml新鲜配制3∶1甲醇冰乙酸固定液预固定，用气泡吹打细胞使其混匀。

（8）固定：

用新鲜配制3∶2甲冰固定三次，每次30分钟。

固定液加入时沿管壁缓慢加入；（9）制片及干燥：

用绒毛制片；

（10）分带解决。

九、人外周血淋巴细胞培养

　　在正常状况下，人外周血中是没有分裂相，只有在异常状况下才干发现。

植物血球凝集素（PHA）是人类淋巴细胞有丝分裂刺激剂，在PHA作用下，原处在Go期淋巴细胞转化为淋巴母细胞，进而进行有丝分裂。

运用PHA这一特性，淋巴细胞通过具有HPA培养液培养，在体外便可获得丰富具有丝分裂生长活跃细胞群体，终结分裂中期淋巴细胞，例可得到所需人体染色体图形。

具备用血量少、操作简朴等长处。

　　1、实验材料

　　2.5%碘酒、75%酒精、无菌棉签或棉球、镊子、吸管、培养瓶、培养液（PRMI1640、M199）、小牛血清、秋水仙素、KCL、甲醇、冰醋酸、载玻片等。

　　2、培养液配制

　　无菌条件下配制培养液，每瓶所含下列试剂：

　　RPMI1640或19990%

　　小牛血清10%

　　PHA（自制）0.1ml3%

　　肝素10u/ml2%

　　双抗100u/ml（选取）

　　分装于10ml培养瓶内，每瓶5ml培养液，封口置冷藏柜备用。

　　3、操作过程

（1）采样接种：

用2.5%碘酒、75%酒精消毒瓶盖，用酒精灯火焰过烤，无菌条件下抽取患者外周血0.5-1ml，每瓶加20滴左右，轻摇均匀，尽量避免培养物与瓶盖接触；

（2）培养：

置36℃培养箱中培养72小时，每隔12小时左右轻遥1次，以增进细胞生长增殖；（3）抑止分裂：

收获前2小时左右加秋水仙素，最后浓度为0.02ug/ml培养液，摇匀后置培养箱中继续培养，以抑止细胞在分裂中期。

（4）终结培养：

从培养箱中取出培养瓶，摇匀后移至10ml尖底离心管中，尽量收集培养细胞。

rpm8分钟。

（5）低渗解决：

弃上清液，加入预温37℃0.075MKCL8ml，迅速打匀，置37℃培养箱或水浴锅中10-20分钟；（6）预固定：

取出低渗中尖底离心管，轻轻加入新配制1-2ml3∶2甲醇：

冰乙酸混合液，取相应编号滴管用汽泡轻轻软打2-3下。

800-1000rpm8-10分钟；（7）固定：

弃上清液。

加入新鲜配制3∶2甲醇冰乙酸混合液10ml，轻打混匀，封口置室温30分钟以上。

1500-rpm10分钟，重复2-3次；（8）制片：

使用蒸馏水制备冰水片进行滴片。

留离心后沉淀细胞，加新鲜配制固定液，制成细胞悬液，取1-2滴滴片，用于轻轻吹开。

刻号后清理刻号污物，置80℃烤片2小时；（9）收片：

待烤箱自然冷却后，取出烤片，置干净环境中或培养箱中以备进行显带解决。

十、植物油凝素制备

　　植物血凝素也称为植物凝集素（PHA），可自制也可购自商品。

自制办法惯用生理盐水提取法。

　　（A）干品制备法

（1）选广东鸡子豆10g，用蒸馏水冲洗，置培养皿内用75%酒精一次性浸洗，倒掉酒精留间隙置37℃。

恒温箱内24-48小时；

（2）在无菌条件下研碎鸡子豆，加生理盐水30ml，摇匀后放入4℃冰箱24小时，第二天再加生理盐水70ml，再置4℃冰箱内24小时。

每8-12小时摇荡一次。

（也可一次性加100ml生理盐水）；（3）无菌条件下移入10-50ml离心管内，3000-4000rpm30分钟。

在无菌箱内把上清液分装于10ml小瓶，置冰箱冷冻层备用；（4）效价：

外周血染色体制备每100ml培养基加PHA约2ml。

注：

若整个过程未在无菌条件下进行，分装时用G5玻砂漏斗除菌即可。

　　（B）鲜品制备法：

（1）选取完整无破皮鲜菜豆20g，用75%酒精浸泡10分钟；

（2）在净化工作中用无菌盐水或蒸馏水漂洗二次，然后置无菌乳钵中捣成糊状，用100ml无菌盐水浸泡封口；（3）移入4℃冰箱中置24小时，中间摇动多次，次日3000rpm30分钟，在无菌状况下分装上清液于10ml小瓶内，置冰箱冷冻层备用。

（4）效价：

正式使用前先用一定量作效价测定，按效价使用。

十一、组织培养细胞染色体制备

　　组织细胞用于遗传学分析最常用是体外培养细胞株，多为恶性肿瘤细胞株，且呈贴壁生长，仅小数细胞株为悬浮生长。

培养细胞有来源易得、细胞分裂率高和染色体标本制出清晰度高等长处。

组织细胞染色体制备核心是掌握好体外细胞生长动态，只有处在对数生长期细胞才干浮现较高分裂相，因此积水仙素解决时机及量是染色体标本形态及分裂指数核心。

　　1、实验材料

　　培养液（PRMI1640、M199、DMEM等），小牛血清、0.025%胰蛋酶、秋水仙素，刻度离心管，直吸管及弯头吸管，培养瓶或皿、KCL、甲醇、冰乙酸、载玻片。

　　2、培养液配制

　　培养液85-95%

　　小牛血清5-15%

　　双抗（选取）100u/ml

　　3、操作过程

（1）培养细胞：

选取处在指数生长期、用大瓶培养80-90%汇合单层培养细胞；

（2）终结培养：

当有大量圆形发亮细胞浮现时，加秋水仙素0.01-0.03ug/ml培养混合液，置温箱继续培养6-10小时以抑制分裂期细胞停止于分裂中期；（3）汇集细胞：

　　（A）摇动法：

　　可运用分裂中期细胞变圆与底物附着不牢特点，此时可持培养瓶，左右重复横向水平摇动，可使90%中期分裂细胞从瓶壁脱落；

　　（B）消化法：

　　将培养液倒入离心管内，给培养瓶内加0.025%胰蛋白酶液0.5-1ml/瓶，水平左右摇动，便培养瓶底壁面完全接触消化酶，稍后用弯头吸管吹打，待细胞完全脱落后，加入3-5ml前培养终结消化。

用吸管移入装有培养液离心管内rpm10分钟。

弃上清液，留沉淀细胞；

（4）低渗解决：

给沉淀细胞加顶温37℃0.075MKCL8ml左右，用吸管打均匀，在温箱中静置20-30分钟；

（5）预固定：

向低渗解决恰当离心管中加新鲜配制3∶2甲醇，冰乙醇固定液1-2ml，用吸管轻松吹打调匀，此办法能起到使细胞表面轻微固定，可防止固定后细胞粘连成块。

（6）固定：