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烟草节杆菌发酵产肌酐酶工艺优化

本科毕业设计（论文）

题目烟草节杆菌发酵产肌酐酶工艺优化

学院生物与食品工程学院

年级2012级专业生物工程

班级0605122学号060512236

学生姓名朱洁

校内导师梁剑光职称副教授

论文提交日期2016-05-20

常熟理工学院本科毕业设计（论文）诚信承诺书

本人郑重声明：

所呈交的本科毕业设计（论文），是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。

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对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。

本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。

本人签名：

日期：

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保密的毕业设计（论文）在解密后遵守此规定。

本人签名：

日期：

导师签名：

日期：

烟草节杆菌发酵产肌酐酶工艺优化

摘要

对烟草节杆菌的发酵培养基进行优化以提高发酵产肌酐酶的酶活。

首先采用Plackett-Burman设计从8种原料中筛选出对酶活大小影响最显著的因素，然后进行最陡爬坡试验确定最适中心浓度，最后采用Box-behnken设计确定最优培养基配方如下：

可溶性淀粉0.8%，麦芽糖0.8%，玉米浆0.112%，胰蛋白胨1.582%，酵母粉0.4%，Nacl0.8%，肌酸0.4%，MgSO40.051%。

烟草节杆菌产肌酐酶酶活由优化前的119U/mg提高到了230U/mg，产酶酶活提高到1.93倍。

关键词：

烟草节杆菌肌酐酶培养基优化响应面法

OptimizationoffermentationprocessforproductionofcreatininaseamidohydrolasebyArthrobacternicotianae

Abstract

OptimizingthefermentationmediumforArthrobacternicotianaetoimprovetheenzymeactivityofcreatininaseamidohydrolae.First,usingPlackett-Burmandesignselectedfrom8kindsofmaterialsimpactonenzymeactivityofthemostsignificantinfluencefactors,andthenusingthesteepestascentexperimenttodeterminethemostsuitableconcentrationcenters.Finally,usingthebox-Behnkendesigntodeterminetheoptimalmediumcompositionwhichisasfollows:

solublestarch0.8%，maltose0.8%，cornsyrup0.112%，tryptone1.582%，yeastextract0.4%，Nacl0.8%，creatine0.4%，MgSO40.051%.TheenzymeactivityofthecreatininaseamidohydrolaseproducedbyArthrobacternicotianaeisincreasedfrom119U/mgto230U/mg,whichisincreased1.93times.

Keywords:

Arthrobacternicotianae;Creatininaseamidohydrolase;Optimizationofculturemedium;Responsesurfacemethods

目录

1.前言1

1.1肌酐酶的概述1

1.2肌酐酶的工艺优化1

2.材料与方法2

2.1菌种2

2.2培养基2

2.2.1斜面种子培养基（%）2

2.2.2液体种子培养基（%）2

2.2.3初始发酵培养基（%）2

2.3培养条件2

2.3.1种子培养2

2.3.2发酵培养2

2.4生长曲线的测定2

2.4.1实验原理2

2.4.2接种培养3

2.4.3比浊测定3

2.4.4绘制生长曲线3

2.5酶活的测定方法3

2.5.1试剂的配制3

2.5.2肌酐酶粗酶的提取3

2.5.3肌酐酶酶活测定[17-18]4

2.5.4测定步骤4

2.6培养基的优化设计5

2.6.1Plackett-Burman设计[19]5

2.6.2最陡爬坡试验5

2.6.3Box-behnken设计5

3.结果与分析6

3.1生长曲线的绘制6

3.2筛选影响因素6

3.3确定中心试验点8

3.4确定最佳发酵培养基8

3.4.1多元二次模型方尺的建立与检验8

3.4.2响应面分析及优化10

4.结论16

参考文献17

致谢19

1.前言

1.1肌酐酶的概述

肌酐酶，也称肌酐酰胺水解酶（Creatinineamidohydrolase），2004年，据崔有宏等人检测鉴定，从土壤中筛选出的烟草节杆菌可以代谢产生肌酐酶[1]。

该酶是一种诱导酶，在烟草节杆菌发酵产肌酐酶的过程中，若添加诱导物肌酐、肌酸等，可以显著提高肌酐酶的产酶量[2]。

除烟草节杆菌代谢产生肌酐酶外，在假单胞菌株、棒状杆菌株等微生物中也可以代谢产生肌酐酶[3]。

在人体中，肌酐酶可以将人体肌酸代谢的终末产物肌酐降解为肌酸，因而，肌酐酶是肌酐降解途径的重要工具酶。

人体血液中肌酐的浓度高低与肾小球的作用能力相关，因而，在临床医学上，肌酐浓度的测定常常作为检测肾脏功能的指标，可见，肌酐酶在临床医学上具有重要的医用价值[4]。

目前，国外对肌酐酶的研究已经取得一定的进展，包括对发酵产肌酐酶的菌株的筛选、基因测序、基因克隆和基因表达等多个方面[5-7]。

国内虽然对这类研究成果也有一定的报道[8]，但相比较之下，仍然处于落后水平，技术不达标，造成生产上主要依靠进口[9-10]，不仅成本较高，而且缺乏创新能力和科研能力，对国内医疗相关领域的发展造成了一定的局限性。

因此，利用已经筛选出来的烟草节杆菌进行发酵生产肌酐酶，在其工艺优化方面进行研究以期获得更高的产酶量，具有极其重要的作用和深远的意义。

1.2肌酐酶的工艺优化

前期采用了单因素试验和正交试验对初始发酵培养基中烟草节杆菌产肌酐酶的培养温度、转速、溶氧进行优化，确定了烟草节杆菌产肌酐酶的最佳培养条件如下：

最适培养温度为28℃，最佳转速为200r/min，最佳溶氧为采用八层纱布。

后期在上述最优培养条件下，对培养基进行优化研究，由于考察因素较多，若采用单因子试验和正交设计的方法，试验次数过多，而且有可能导致不可靠的结论[11-13]，因此，考虑采用可以同时对影响酶活的各因子水平及其交互作用进行优化和评价的响应面法（ResponseSurfaceMethodology，RSM）[14]。

即先后通过PB设计、最陡爬坡试验和Box-behnken设计进行烟草节杆菌发酵产肌酐酶的工艺优化。

2.材料与方法

2.1菌种

烟草节杆菌（Arthrobacternicotianae），本实验室提供。

2.2培养基

2.2.1斜面种子培养基（%）

氯化钠1，胰蛋白胨1，酵母浸出汁0.5，琼脂2，pH7.0。

2.2.2液体种子培养基（%）

氯化钠1，胰蛋白胨1，酵母浸出汁0.5，pH7.0。

2.2.3初始发酵培养基（%）

可溶性淀粉0.8，麦芽糖0.8，玉米浆0.2，胰蛋白胨0.8，酵母粉0.4，Nacl0.8，肌酸0.4，MgSO40.1。

2.3培养条件

2.3.1种子培养

挑取斜面上活化后的菌体一环，于装有40ml种子培养基的250ml锥形瓶中，用8层纱布包扎，在28℃，200r/min，摇床培养22h。

2.3.2发酵培养

按1%的接种量吸取一定量的液体种子，于装有30ml发酵培养基的250ml锥形瓶中，用8层纱布包扎，在28℃，200r/min摇床培养，22h。

2.4生长曲线的测定

2.4.1实验原理

细菌的生长一般指群体的生长，常常具有一定的规律性。

绘制生长曲线可以在一定程度上描述烟草节杆菌在发酵培养基中的生长趋势和生长速度。

通常是采用接种一定量的菌种于装有一定体积的种子培养基的锥形瓶中，在菌种生长的最适生长条件下培养一定时间，记录各时间段菌种的生长情况，制成表格和生长曲线图。

由于烟草节杆菌属于革兰氏阳性菌，所以其生长曲线可以分为四个时期，即延迟期、对数生长期、稳定期和衰亡期四个时期[15]。

测量烟草节杆菌的生长情况，可以利用分光光度计测定烟草节杆菌的光密度，即进行比浊测定。

这是因为，烟草节杆菌在生长过程中，其菌体浓度与光密度成正比，测量出菌体的光密度与时间的关系，也就获得了菌体生长量与时间的关系，即可确定菌种的生长曲线。

2.4.2接种培养

采用无菌操作技术向每个装有100ml种子培养基的锥形瓶中准确加入烟草节杆菌菌悬液3ml，轻轻振荡混匀，另设一空白对照组（不加烟草节杆菌）。

将接种后的9组锥形瓶置于摇床上，28℃,200r/min，振荡培养。

每间隔一定的时间，即0、2、4、6、8、16、18、20、22、24、26、28、30小时后，从摇床上取下一个锥形瓶（标记时间），放置4℃冰箱保存。

2.4.3比浊测定

每组取9支干净小试管，从各时间培养液中取3ml，将烟草节杆菌的种子培养液稀释一定倍数，使OD值在0.1~0.5之间，以降低试验误差，用0h的种子培养液调0，在600nm波长下，依次测定OD值。

测定从最稀浓度的菌悬液开始，依次测定。

经稀释后测定的OD值要乘以稀释倍数，即为培养液的实际OD值。

2.4.4绘制生长曲线

以培养时间为横坐标，光密度（OD值）为纵坐标，绘制烟草节杆菌的生长曲线。

2.5酶活的测定方法

2.5.1试剂的配制

0.5mol/LNaOH溶液；1.0%（w/v）苦味酸溶液；0.1mol/L肌酸溶液；PH7.5的磷酸缓冲液（A液：

磷酸氢二钾，B液：

磷酸二氢钾）。

2.5.2肌酐酶粗酶的提取

破胞方法概述：

由于烟草节杆菌发酵产肌酐酶的反应场所是其细胞质，所以要想提取细胞质内的粗酶酶液，首先应该破碎细胞壁，介于烟草节杆菌细胞壁主要成分是肽聚糖，肽聚糖是由乙酰氨基葡萄糖、乙酰胞壁酸和四到五各氨基酸短肽聚合而成的多层网状大分子结构[16]，因此可以采用两种方式结合的方法来进行破胞，即溶菌酶与超声破胞法。

菌体洗涤和收集：

将经过22h摇床发酵的发酵液装入离心管，把平衡好的离心管放入高速冷冻离心机，设置转速5000r/min，温度4~6℃，时间10min。

然后弃上清，用置于冰箱冷却的生理盐水洗涤沉淀菌块，搅散，反复离心洗涤2次，然后再用ph7.5的冷磷酸缓冲液洗涤1次，离心，尽量除去上清，称量菌块湿重。

破碎菌体和肌酐酶粗酶制备：

每1g湿菌中加入1ml溶菌酶酶液（新鲜配制50ml浓度为3mg/ml的溶菌酶酶液），用ph7.5的磷酸缓冲液平衡到10ml，用玻璃棒不时搅拌，反应时间为20min，取出玻璃棒，静置5min，然后放入超声细胞粉碎机中进行细胞破碎，作用时间为12分钟，采用10s运作，10s间隔的方式破碎。

然后取出，放入高速冷冻离心机，设置转速10000r/min，温度4~6℃，时间10min。

收集上清液，由于上清液浓度过高，会给后续测定带来一定误差，故需要进行稀释，一般取稀释倍数为10倍，即得肌酐酶粗酶酶液。

2.5.3肌酐酶酶活测定[17-18]

反应原理：

肌酸在肌酐酶的催化下脱水生成肌酐，其与苦味酸在碱性条件下生成橙色复合物，复合物的生成量与肌酐酶的酶活成正比，即生成的复合物越多，表示肌酐酶的酶活越高。

苦味酸肌酐复合物的生成量与其在520nm波长下的吸光度成正比，所以通过对复合物吸光度的测定，就可以确定肌酐酶酶活活性高低。

酶活力单位定义：

在37℃、pH7.5条件下，肌酐酶每催化生成1μmmol/min的复合物为1单位。

酶活力（u/mg）=

Vt显色反应液总体积（3mL）

B酶反应液体积（1mL）/显色样品液（0.1mL）

4.65橙红色物质的微摩尔消光系数

D比色环光径（1cm）

T酶反应时间（10min）

Ve酶液体积（0.1mL）

n稀释倍数

2.5.4测定步骤

实验组：

用移液枪吸取0.9ml肌酸于试管中，然后放入37℃的水浴锅中予温5min，接着向保温后的装有肌酸的试管中加入0.1ml稀释后的待测酶溶液（稀释倍数10），混合均匀后在37℃的水浴锅中继续保温，时间控制在10min。

取一只新的试管，用移液枪吸取1.9mlNaOH溶液加入其中，然后立刻吸取0.1ml上述保温10min后的反应液加入其中，最后吸取1ml苦味酸溶液加入，将该试管放入25℃的水浴锅中保温20min，然后取出，用提前预热好的分光光度计在520nm下，用水调0，测定吸光度，记录数据。

空白组：

用移液枪吸取0.9ml肌酸于试管中，然后放入装满冰块的容器内冰浴20min，再加入0.1ml稀释后的待测酶溶液（稀释倍数10），混合均匀后，取一只新的试管，用移液枪吸取1.9mlNaOH溶液加入其中，然后立刻吸取0.1ml上述保温10min后的反应液加入其中，最后吸取1ml苦味酸溶液加入，将该试管放入25℃的水浴锅中保温20min，然后取出，用提前预热好的分光光度计在520nm下，用水调0，测定吸光度，记录数据。

根据酶活力公式，计算酶活力大小。

2.6培养基的优化设计

2.6.1Plackett-Burman设计[19]

Plackett-Burman设计法（简称PB设计法），是一种两水平的实验设计方法，即高水平和低水平。

低水平为原始出发水平，高水平一般为低水平的1.5倍左右。

在培养基的优化阶段，首先选择PB设计法，本研究将初始发酵培养基的8种组成成分包括可溶性淀粉（A），麦芽糖（B），玉米浆（C），胰蛋白胨（D），酵母粉（E），Nacl（F），肌酸（G），MgSO4（H）作为实验的因素，即因子数为8。

按照PB试验的一般规律，取高低两个水平，将初始发酵培养基的各成分的浓度作为低水平，取低水平浓度的1.5倍为高水平各成分的浓度。

响应值Y定义为肌酐酶酶活大小。

2.6.2最陡爬坡试验

进行最陡爬坡试验，其目的是为了使主要因素的取值逼近中心点。

根据PB试验的结果进行，为了尽快逼近最优值，增加的步长通常取最大。

只有在满足主要因素的取值逼近中心点后所建立的响应面拟合方程才具有可靠性[20]。

根据PB试验的结果，可以准确确定对发酵液产肌酐酶酶活大小影响的主要因素，再根据主要因素的正负效应来确定最陡爬坡试验的步长和变化方向[21]。

2.6.3Box-behnken设计

在培养基优化的最后阶段采用Box-behnken设计[22]，该方法主要用于优化的因素范围是2~5个，是基于Plackett-Burman试验设计和最陡爬坡试验而进行的实验。

常用的响应面方法除了Box-behnken设计外，还有中心复合法。

这步实验进行时实验的因素不宜过多，最经典的一般是三因素。

通过Box-behnken设计实验结果进行分析，可以得到回归方程，进而得到最优培养基配方，而且还能得到各因素之间的相互作用对响应值的影响。

本实验采用DesignExpert8软件对试验结果进行响应面分析。

3.结果与分析

3.1生长曲线的绘制

按照测定步骤，在0~30h内取样测定600nm波长下发酵液的OD值，试验结果见表1。

表1烟草节杆菌的生长曲线的测定结果

时间/h

0

2

4

6

8

16

18

OD

0

0.105

0.453

1.434

2.396

7.866

8.885

时间/h

20

22

24

26

28

30

OD

9.885

10.185

10.335

10.980

10.566

10.422

由表1的烟草节杆菌的生长曲线测定结果可知，4h后菌株开始进入对数期，25h左右菌液浓度达到峰值，26h左右菌液浓度开始下降。

由于在22h，烟草节杆菌处于对数生长期的后期，菌体浓度较高，适合进行酶活测定，故选择烟草节杆菌的培养时间为22h最为适宜。

3.2筛选影响因素

根据Plackett-Burman试验设计，当烟草节杆菌的发酵培养液发酵到22h时，停止发酵，然后测定烟草节杆菌发酵液产肌酐酶的酶活，记录列于下表，见表2。

表2Plackett-Burman试验设计与结果

序号

A

B

C

D

E

F

G

H

Y

1

-1

-1

-1

-1

-1

-1

-1

-1

119.7

2

-1

1

-1

-1

-1

1

1

1

86.1

3

1

-1

-1

-1

1

1

1

-1

82.6

4

-1

1

1

-1

1

-1

-1

-1

73.5

5

1

1

-1

1

-1

-1

-1

1

81.3

6

1

-1

1

-1

-1

-1

1

1

58.8

7

1

1

-1

1

1

-1

1

-1

119

8

1

1

1

-1

1

1

-1

1

49

9

-1

-1

1

1

1

-1

1

1

91

10

1

-1

1

1

-1

1

-1

-1

86.8

11

-1

1

1

1

-1

1

1

-1

102.9

12

-1

-1

-1

1

1

1

-1

1

86.1

利用Minitab17对表2数据进行回归分析，所得结果列于表3。

表3Plackett-Burman试验设计的回归分析结果

组别

因素

浓度（%）

t检验

p检验

重要性排序

-1

1

A

可溶性淀粉

0.8

1

-1.85

0.161

4

B

麦芽糖

0.8

1

-0.3

0.784

8

C

玉米浆

0.2

0.4

-2.56

0.083

2

D

胰蛋白胨

0.8

1

2.21

0.114

3

E

酵母膏

0.4

0.6

-0.78

0.492

7

F

氯化钠

0.8

1

-1.13

0.341

5

G

肌酸

0.4

0.6

1

0.392

6

H

硫酸镁

0.1

0.2

-3

0.058

1

对表3进行分析，可以筛选硫酸镁、玉米浆和胰蛋白胨作为显著性影响因子的水平都在85％以上，故确定硫酸镁、玉米浆和胰蛋白胨为影响发酵液产肌酐酶酶活大小的主要因素。

其中，硫酸镁与玉米浆的浓度对发酵液产肌酐酶酶活大小的影响是负效应，胰蛋白胨的浓度对发酵液产肌酐酶酶活大小的影响是正效应。

3.3确定中心试验点

根据Plackett-Burman试验设计结果设计最陡爬坡试验的步长和方向：

硫酸镁为负效应，取步长为0.01%，方向为负；玉米浆为负效应，取步长为0.03%，方向为负；胰蛋白胨为正效应，取步长为0.2%，方向为正。

剩余5个因素包括可溶性淀粉、麦芽糖、酵母膏、氯化钠、肌酸均取其初始发酵培养基中各成分的浓度，测定发酵液产肌酐酶酶活的变化，确定最适培养基配方，记录实验结果于下表，见表4。

表4最陡爬坡试验设计与结果

次数

硫酸镁（%）

玉米浆（%）

胰蛋白胨（%）

酶活（U/mg）

1

0.1

0.2

1

56

2

0.09

0.17

1.2

91

3

0.08

0.14

1.4

125

4

0.07

0.11

1.6

224

5

0.06

0.08

1.8

117

6

0.05

0.05

2

95

随着硫酸镁、玉米浆和胰蛋白胨浓度的变化，发酵液产肌酐酶的酶活大小先增加后减少，当硫酸镁、玉米浆和胰蛋白胨浓度分别为：

0.07%、0.11%、1.6%时，发酵液产肌酐酶的酶活达到最大值，以此浓度作为中心试验点，进行下一步优化。

3.4确定最佳发酵培养基

3.4.1多元二次模型方尺的建立与检验

以硫酸镁、玉米浆和胰蛋白胨三个重要因素为自变量，各因素及其编码值见表5。

表5Box-behnken设计各因素编码水平

符号

因素

浓度（%）

-1

0

1

1

硫酸镁

0.06

0.07

0.08

2

玉米浆

0.08

0.11

0.14

3

胰蛋白胨

1.4

1.6

1.8

按照表5进行Box-behnken试验设计并记录结果，见表6。

硫酸镁、玉米浆和胰蛋白胨的浓度影响烟草节杆菌产肌酐酶酶活大小，酶活大小变化的范围为169~235U/mg，其中模型中心点重复5次，其他处理测定1次。

原点处酶活大小为222.75U/mg。

表6Box-behnken设计与结果

序号

硫酸镁（%）

玉米浆（%）

胰蛋白胨（%）

酶活（U/mg）

1

0

0

1

169

2

1

-1

1

170

3

-1

1

1

185

4

0

0

0

177

5

0

0

0

218

6

1

0

0

221

7

1

0

0

208

8

0

0

0

211

9

1

1

-1

209

10

-1

-1

-1

199

11

0

0

-1

228

12

0

1

0

230

13

0

0

0

227

14

0

-1

0

231

15

0

0

0

235

使用DesignExpert8软件对表6的结果进行回归拟合得到二阶回归方程为：

Y=230.20-2.65A+1.50B-5.00C-7.25AB-0.25AC+3.10BC-8.05A2-20.70B2-26.20C2。

表7Box-behnken试验的方差分析结果

来源

平方和

DF

均方

F值

Prob>F

Model

7274.43

9

808.27

93.33

<0.0001

signficant

A-硫酸镁

2.75

1

2.75

0.32

0.5972

B-玉米浆

4.50

1

4.50