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昆明医学院教案课程中心
昆明医科大学教案
课程名称:
法医物证学授课对象:
法医专业五年级本科生
一、讲授题目第十三章精液斑检验
二、讲授时数3学时
三、讲授人:
许冰莹职称:
教授
四、本课目的、要求
1.掌握精斑检验的目的、意义以及程序。
2.了解精斑与精液的特点。
3.掌握精斑预试验、确证试验、种属试验的基本原理、方法及法医学意义。
4.掌握精斑的个人识别的原理方法以及法医学意义。
五、本章节重点、难点
重点:
1.精斑检验的目的、意义以及程序;
2.精斑预试验、确证试验、种属试验的基本原理、方法及法医学意义;
3.精斑的个人识别的原理方法以及法医学意义
难点:
精斑的个人识别的原理、方法
六、教学方法(请打勾)
传统式、提问式、学导式、病案分析式、直观教学式(幻灯、手术、录像)、自学式、其它:
七、使用教具:
多媒体
八、思考题:
1.精液与精液斑的特点是什么?
2.精液斑检验需解决的问题有那些?
3.何谓p30?
4.试述精液斑与新鲜血ABO血型分型方法的区别
九、要求参考书目及章节:
1.《法医DNA分析》,郑秀芬著
2.《司法鉴定学》,李利华主编
十、讲课内容及时数安排
时间:
30min
多媒体
幻灯片
时间:
5min
多媒体
幻灯片
时间:
25min
多媒体
幻灯片
时间:
40min
多媒体
幻灯片
时间:
40min
多媒体
幻灯片
第一节概述
精液斑(seminalstain)是法医常见物证检材,在强奸、猥亵等案件中往往涉及精液斑检验。
一、精液与精液斑的特点
(一)精液的特点
组成成分:
精液主要由精子(spermatozoa)及精浆(seminalplasma)组成,是一种含蛋白质、各种酶及果糖等多种成分的碱性乳白色胶状液体(Seminalmainlyconsistofspermatozoaandseminalplasma,aalkalinitycontainprotein,avarietyofenzymesandfructosemilkycolloidalliquid.)。
除精子外,还有睾丸细胞、白细胞、脱落柱状上皮细胞、前列腺卵磷脂小体、玻璃小体、各种形状的精胺结晶、色素颗粒、脂肪球等。
精浆是由男性各附属性腺分泌物所组成,其中精囊液约占50%~80%、前列腺液占15%~30%、尿道球腺液、尿道旁腺液约占5%。
精囊液呈碱性,含有两种主要成分:
果糖和凝固酶。
前列腺液呈透明的酸性液体,含有高浓度的酸性磷酸酶(Prostatefluidistransparentacidliquid,containshighconcentrationsofacidphosphatase.),纤溶酶和中性蛋白酶。
尿道球腺和旁腺液是一种呈浅灰白色的液体。
精液含蛋白浓度约为35~55mg/ml,略低于血清蛋白平均浓度(72mg/ml)。
精液中蛋白可分为两类:
一类是与人血清共有的蛋白成分,如白蛋白、α1-酸性糖蛋白、型特异性成分、转铁蛋白、IgA、IgG、α1-糖蛋白、纤维蛋白原、胰岛素等。
另一类是精浆中特有的蛋白成分,如前列腺特异性抗原(prostatespecificantigen,p30)、β-微精蛋白(β-microseminoprotein,β-MSP)、β-精浆蛋白(β-seminnoprotein,β-sm)以及α2-精浆糖蛋白(α2-seminoglycoprotein,α2-SGP)等。
精液中含有多种酶类,某些酶的活性水平很高,如酸性磷酸酶、磷酸葡糖变位酶、γ-谷氨酰转肽酶、乳酸脱氢酶、黄递酶、乙二醛酶、酯酶、碱性磷酸酶、纤溶酶、透明质酸酶、淀粉酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶以及凝固酶等。
精液还含有精胺(56~1418μg/ml)、胆碱、前列腺素、除能因子、蛋白酶抑制因子等。
精胺被精液中的二胺氧化酶氧化,即产生精液的特殊气味。
精液为乳白色半透明的粘稠液体,长期未排精时可稍呈黄色。
有特殊的麝香或樱粟花气味,呈弱碱性pH7.2~8.6,平均7.8,比重1.021~1.040,渗透压20.55~0.58。
射精后的体外精液接触空气,由于受精囊腺分泌的凝固酶的作用,约5min内凝结成胶冻状。
继而在中性蛋白酶及纤溶酶作用下,约20~30min内液化成稀薄半流动体状。
(二)精子形态特点★
正常精子分头、尾两部分,长约60μm,外形似蝌蚪(图)。
头部长3~5μm,宽2~3μm,厚1~2μm,正面观呈卵圆形,侧面观呈梨形,主要由顶体(acrosome)和致密的精子细胞核组成。
空泡状顶体覆盖了精子细胞核的前2/3,内含多种水解酶,如顶体蛋白酶、透明质酸酶、酸性磷酸酶等,在受精时有利于精子穿透卵子外周的放射冠与透明带而进入卵内。
精子细胞核除含有染色质外,还含有各种大小的空泡。
尾部长达40~60μm,细长而弯曲。
分为颈段、中段、主段和末段四部分。
颈段短,主要是中心粒,其它三段的主要结构是由中心粒产生的9+2排列的微管,构成鞭毛中心的轴丝。
在中段,轴丝外侧有9根纵向行走的外致密纤维,外侧再包有一圈线粒体鞘,为鞭毛摆动提供能量。
主段最长,轴丝外周无线粒体鞘,代之以纤维鞘。
末段短,仅有轴丝。
受精时,仅头部进入卵细胞,即使有少量线粒体鞘内的mtDNA也进入卵子,其与卵子所含的上万数目的mtDNA相比,几乎对基因型不产生影响,故mtDNA呈母系遗传。
(三)精液斑的特点
精液斑是精液浸润或附着于基质上,干燥后形成的斑痕。
精斑多附着于犯罪嫌疑人或被害人的衣、裤上,女性的外阴部或大腿内侧,现场的被褥、毛巾、纸张、草席、床板、沙石、泥土等。
此外,阴道擦拭物也是常见的精斑检材。
精斑无固定的形态,外观常因附着物不同而有差异。
在体表,精斑常呈白色鳞片状痂片。
在深色纺织品上,浓厚精斑呈灰白色浆糊状斑迹,偶可见结痂;较稀薄的精斑浸润于布纤维间,则不易察见。
在浅色纺织品上,精斑多呈黄白色地图状,边缘色深。
用放大镜检查,可在布纤维表面或中间见黄白色小鳞片。
在软质载体,如衣、裤、纸张上的精斑手触之有硬感。
新鲜精斑有特殊腥气味。
二、精斑检验的目的与要求★
Purposeandrequirementsoffinespotinspection
精斑检验的主要目的与其他物证检验一样,是为案件的侦查提供线索,为分析、审理案件提供证据。
对疑为精斑的检材需要解决下列问题:
可疑斑痕是否为精斑?
若是精斑,确定精斑的个体来源。
检验步骤为:
肉眼观察(VisualInspection)、预试验(TrialTest)、确证试验(ConfirmatoryTest)、种属鉴定(SpeciesIdentification),遗传标记测定(Determinationofgeneticmarkers)。
第二节精斑的肉眼检验
肉眼检查的目的是发现可疑精斑,确定所在部位及分布,以便准确取材检验,提高阳性率。
(Toincreasethepositiverateofthetext,havethevisualinspectiontoensurethedistributionofthesuspicioussemenstains.)有时可根据精斑的形态、部位分析有关作案过程。
典型的精斑呈不规则地图状。
观察并记录斑迹的分布情况、数目、位置、形状、大小、颜色及光泽等。
新鲜精斑触之有干浆糊斑状的硬感,有特殊的腥味。
水洗、雨淋后的,或有色基质上的精斑肉眼比较难观察。
可将检材置于紫外光下于暗处观察。
精斑中含有黄素(flavin),在紫外线照射下显银白色荧光,斑痕边缘呈浅紫蓝色(Semenstainsshowsilverfluorescenceundertheultravioletlightwiththepalevioletbluefleckededgebecauseoftheflavin.)。
水洗过、肉眼不能发现的精斑,在紫外线下仍发浅淡的点片状荧光。
阴道分泌物、尿液、鼻涕、唾液、乳汁、脓液、肥皂斑、洗涤剂、植物汁液、纺织品中的某些色素、染料、漂白剂、含荧光素的各种载体等在紫外线下也能发与精斑类似的荧光,故紫外线检查阳性结果仅表示斑痕可能是精斑。
精斑过于淡薄,数天或者数年的精斑,可无荧光,故阴性结果不能轻易否定精斑。
紫外线检查方法简便,不损害检材,不影响检材作其他项目的检验。
一般在肉眼不易辨别时作精斑定位用。
第三节精斑的预试验
预试验的目的是筛选可疑精斑,故要求方法简单,灵敏度高。
精斑预试验方法很多,常用的方法如下。
一、酸性磷酸酶检验★
精液的主要成分前列腺分泌液中含有大量酸性磷酸酶(acidphosphatase,ACP),浓度为540~4000u/ml,较其他体液、分泌液及脏器的含量高100倍以上。
除精液外,部分蔬菜、水果也含少量酸性磷酸酶。
此外,某些避孕药ACP检测也呈弱阳性反应。
故该试验只能作为精斑的预试验。
由于酸性磷酸酶来源于前列腺,无精子的精液ACP试验也呈阳性结果。
精斑中酸性磷酸酶相当稳定,对腐败及高热有较强的抵抗力。
检验酸性磷酸酶的方法很多,如磷酸苯二钠试验、α-磷酸萘酚-固蓝B方法、琼脂扩散法及电泳法等,以磷酸苯二钠显色试验最为常用。
(一)磷酸苯二钠试验(Kind-King试法)
1.原理精液中的酸性磷酸酶可分解磷酸苯二钠,产生萘酚,后者经铁氰化钾作用并与氨基安替比林结合,生成红色醌类化合物。
2.试剂由反应缓冲液和显色液两部分组成。
缓冲液:
磷酸苯二钠0.2g,4-氨基安替比林0.6g,柠檬酸1.4g,1mol/L氢氧化钠12.5ml,蒸馏水加至100ml,加热溶解后置冷水中迅速冷却,加0.5ml氯仿。
显色液:
铁氰化钾3.6g,1mol/L氢氧化钠16.7ml,碳酸氢钠1.4g,蒸馏水加至100ml。
3.方法取可疑斑痕0.1cm×0.1cm,最好取斑痕边缘部位,置试管内,加缓冲液3~4滴,经37℃温箱内5~10min后,加等量显色液,立即出现红色为阳性反应,表明检材可能是精斑。
颜色深浅与酸性磷酸酶浓度呈正比,浓度愈高,颜色愈深红,浓度过高可出现红色沉淀。
呈橙黄色为阴性反应,表明检材不是精斑或精斑中的酸性磷酸酶被破坏。
同时剪取无斑痕处检材及己知精斑作阴性与阳性对照。
磷酸苯二钠试验灵敏度较高(Highsensitivity),稀释20000倍的精液仍呈阳性反应。
被水洗过的淡薄精斑,只要适当延长缓冲液温浸时间可呈阳性结果。
精液如混有血液并不影响检验,血痕在该试验中呈灰褐色。
由于该试验灵敏度很高,所以操作时,一般按空白部位、可疑精斑、己知精斑的顺序剪取检材,避免污染。
酸性磷酸酶试验的特异性较差(Lowspecificity),1g内脏组织如肺、肝、肾、心、胃等,用5ml缓冲液浸泡的浸液以及常见的人体分泌物或者排泄物如鼻涕、汗、唾液、成年男性尿液等也可呈弱阳性反应。
为了排除上述假阳性反应,可在显色后将液体稀释64倍或将试管再放入56℃温箱中10~20min,此时精斑仍维持红色,引起假阳性的红色消褪。
(二)α-磷酸萘酚-固蓝B试验
二、其他预试验
精液中的某些特定成分,如卵磷脂、精素等可与不同试剂结合,能形成一定形态的结晶,据此可推测精斑的存在。
但形成的结晶非精斑所特有,且结晶试验灵敏度较低,故阴性结果也不能否定精斑的存在。
(一)碘化碘钾结晶试验(Florence结晶试验)★
1.原理精斑中卵磷脂析出胆碱,遇碘形成过碘胆碱结晶。
2.试剂碘2.54g,碘化钾1.65g,蒸馏水30ml。
配制时,先将碘化钾溶于蒸馏水中,再加入碘溶解。
3.方法取少许检材置玻片上,分离纤维,加1~2滴试剂,覆以盖片,镜检。
初见褐色颗粒,逐渐形成褐色或褐红色针状、菱形、长矛状结晶为阳性反应。
该结晶不稳定,于生成后1~2h可自然消失,再加试剂又复产生。
镜检时若发现染呈褐黄色的精子,可认定检材为精斑。
此试验灵敏度不高,只有1∶400。
精液混有大小便、血液或其他化学药品时,将妨碍结晶的生成。
精斑太新鲜(卵磷脂未分解成胆碱)或稍陈旧(2个月以上)、经水洗、细菌污染(细菌使胆碱分解)均可呈阴性结果。
本试验不是精斑的特有反应,凡含有胆碱的物质如阴道液、鼻涕、唾液、脓液及肝、肾、肾上腺浸液,甚至某些昆虫或植物汁液等均可形成类似的结晶,故只能作为精斑的预试验。
(二)苦味酸结晶试验(Barberio结晶试验)
(三)锌检出法
所有的预试验中除酸性磷酸酶检验外,其他各项试验灵敏度均不高,因此精斑检验和血痕检验不同。
实际上精斑不一定要经过预试验后才进行确证试验,可剪取肉眼可见的斑痕直接进行确证试验。
有时预试验阴性的检材还是要进行确证试验,偶有磷酸苯二钠试验阴性,而查见精子的报道。
第四节精斑的确证试验★
精斑确证试验是检验精液中的特有成分,阳性结果可以确证精斑。
近几年精斑的确证试验进展较快,方法很多,主要有以下2类方法:
精子检出法及免疫学试验方法。
一、精子检出法
检出精子是认定精斑最简便、最可靠的方法,不需要特殊试剂和仪器。
精子具有典型而稳定的形态,不易受其他因素影响而改变。
在显微镜下观察到典型精子,即能确证人精斑(Itcouldconfirmtheexistenceofsemenstainwhenatypicalspermobservedunderthemicroscope.)。
精斑中的精子形态相当稳定,十余年的陈旧精斑也可能查见精子。
镜下观察精子是无色的,一般情况下精子头部有折光,尾部很细。
检材浸泡后涂片观察,常见精子头部和尾分离。
只要检见典型的精子头,也可以确证精斑。
在实际的精斑检验中,常选择合适的浸液及适当的染色方法,以提高精子的检出率。
⒈检材处理取可疑精斑检材1.5cm×1.5cm,剪碎,置试管内,加约0.5ml生理盐水,室温2h,可用玻棒搅拌和压挤检材。
然后置4℃过夜,吸出全部浸液置另一试管内,2500r/min离心5min,上清液留作抗人精液沉淀反应和中和试验。
沉淀物涂片,干燥后甲醇固定5min,染色,检验精子。
过于陈旧的精斑,盐水浸渍不易分离精子,可用5%~10%氨液浸渍,或用0.8%盐酸、醋酸、胰蛋白酶等浸渍,12~24h后弃载体纤维,离心。
沉淀经洗涤后涂
片、染色、镜检。
⒉染色方法精子染色方法有单染法和复染法两种。
单染法使用的染料有藻红、亚甲蓝、苏木素等,其中以藻红染色效果较好。
单染法操作简单,但精子和基质都染成同一颜色,不容易观察。
可采用复染法,如HE染色法、酸性品红亚甲蓝染色法及酸性品红靛蓝染色法、胭脂红或伊红靛蓝染色法等。
复染法使用2种或2种以上染料,所以精子头部、尾部和基质染成不同的颜色,便于观察和分辨。
酸性品红亚甲蓝(Baecchi)染色法:
染色液由1%酸性品红液1ml,1%亚甲蓝81ml,1%盐酸40ml组成。
染色方法简单,于涂片上滴加染色液,静置5min,用1%盐酸漂洗,干燥后二甲苯透明,镜检。
精子头部呈红色,尾部蓝色。
本法仅精子染色显著,其他杂质染色浅淡,有利于精子的检出。
显微镜下检见精子需要一定的经验,精斑陈旧、取材部位不准或遇到少精子症者,涂片上往往仅见少量精子,故染色后须仔细地观察,只要找到一个完整的典型精子,即能确证人精斑。
精斑在浸渍处理过程中,精子尾部断落,常只检见精子头部,应与阴道滴虫、酵母菌等鉴别。
典型的精子头部呈椭圆形,着色特殊,其它植物细胞、细菌、阴道滴虫等则多呈圆形,染色均匀一致。
若发现几个典型的精子头部也可确证为精斑。
检出期限:
性交后精子可以存活一段时间,一般情况下阴道内3~8h,宫颈2~5天,子宫、输卵管内1~10天的拭子内容物涂片可检见活精子。
阴道内3~9天,宫颈17天的内容物涂片可检见死精子。
精子的检出期限与被害人的体位、活动情况以及月经周期有关。
被害人处于月经期前后或被强奸后就行走,精子检出期限短。
在性犯罪调查中,取阴道拭子的时间越早越好,如果在24h后取材阴道拭子,精子检测阳性率下降50%,48h取材,阳性率仅10%。
活体阴道拭子,精子检出期限一般1.5~2天。
若被害人死亡,尸体处于仰卧位,则检出期限较长,阴道拭子中精子不仅数目多、而且形态基本完整,最长的检出期限可达3周。
而冰冻2个半月的尸体,宫颈涂片偶能检出精子。
精子检出率也与阴道拭子提取方法与部位有关,例如宫颈刮片和阴道后穹窿部擦拭物精子的检出率较高。
二、免疫学试验
制备各种抗人精液特殊成分的抗血清,用免疫学试验,如沉淀反应、酶联免疫吸附试验、胶体金标记试验等检测相应抗原,可以确证精斑。
该试验灵敏度高,还可以确证输精管结扎术者和精子缺乏症患者的精斑。
常用的有抗人精液血清和抗-p30血清进行的反应。
(一)抗人精液血清沉淀反应
(二)前列腺特异性抗原p30的检测★
前列腺特异性抗原(prostatespecificantigen)又称γ-精浆蛋白(γ-seminoprotein,γ-sm),由人类前列腺上皮细胞所分泌(Secretedbyhumanprostateepithelialcells),是成年男子精浆中特有的一类糖蛋白,PI约6.9,分子量30000,故名p30。
人精液p30正常含量为0.24~5.5mg/ml,平均为1.92mg/ml。
p30性质稳定,22℃保存5年的精斑仍能检出;在精液和精液与其他分泌液的混合斑中能存在很长时间,性交后8~13h提取的阴道拭子中仍能检出。
p30是确证精斑的理想标记。
抗-p30血清确证精斑,灵敏度和准确性均高于精子检出法,不受精液中有无精子的影响,也不受阴道液和唾液的干扰,能正确区别人类精斑与动物精斑,是目前确证人类精斑的常用试剂(Ignorethedisturbofazoospermia,ligation,vaginalfluidorsaliva,anti-p30couldpickouthumansemenstaincorrectly.)。
胶体金法(Immuno-colloidalGoldenMethod)胶体金法是一种免疫层析技术,用胶体金p30抗原检测试剂条,又称PSA(prostatespecificantigen)试剂条进行精斑确证试验,特异性好(Goodspecificity),灵敏度高(Highsensitivity),稀释6000倍的精液仍可获阳性结果。
另外,试验操作简单(Simplyoparate),整个试验过程可在5min内完成,是目前一项常规技术。
原理及方法与胶体金法确证血痕一样,不同的是精斑确证试验胶体金标记的是鼠抗人p30单克隆抗体,检测线包被有另一种鼠抗人p30单克隆抗体,质控线包被有羊抗鼠IgG抗体。
三、其它确证方法
精液含有一些活性高的特征性酶,可通过生物化学方法检测特征性酶来确证精斑。
精斑确证试验还有微量元素检测法。
第五节精斑的个人识别
Personalidentificationofsemenstains
精斑检验的主要目的是进行个人识别,确定现场精斑是谁所遗留。
目前精斑个人识别的方法己取得了很大的进展。
精斑检验传统的遗传标记主要有ABO血型、酶型、血清型等,但是DNA多态性的应用发展很快,应用价值最大。
一、精斑的ABO血型测定(ABOtypingofsemenstrain)
ABH血型物质以水溶性形式存在于人的体液、分泌液中,属糖蛋白。
分泌型人精液中ABH血型物质与唾液中含量相似,常用中和试验检测;非分泌型精液由于ABH血型物质含量少,需用灵敏的ELISA法检测。
(一)中和试验(NeutralizationTest)
中和试验是一种检测可溶性血型物质的传统方法。
试验原理是红细胞凝集抑制试验。
精斑检材中可溶性血型抗原与相应的抗体结合,使抗体的效价下降或消失,凝集红细胞的能力下降或消失。
用已知型别指示红细胞检测中和后的抗体效价,凝集能力下降或消失,红细胞不凝集为试验阳性,说明精斑检材具有相应的血型抗原。
精斑中ABH物质量必需与相应抗血清中所含的抗体量相当,才能完全中和抗体,获得准确的结果。
因此传统的中和法是一种半定量检测,需要将精斑浸液作一系列的稀释度,各稀释液含有不同量的ABH抗原,能充分中和标化抗血清中的抗体,再加指示红细胞。
精斑检材分别与抗-A、抗-B抗体及抗-H试剂作中和试验,综合三者反应结果,判定分泌型精斑的ABO血型及分泌能力的强弱。
中和试验方法比较简单,步骤如下:
1.抗血清效价标定
2.中和试验取精斑0.5cm2,剪碎置小试管内,加0.5ml生理盐水,搅拌后室温下2h,4℃冰箱中过夜。
取精斑浸出液,在白瓷板内分三列用生理盐水作倍量稀释,稀释度由1/2至1/128。
于三列稀释液中分别加入等体积的,效价为4的抗-A、抗-B抗体及抗-H试剂,摇匀,室温下中和30min。
再向三列各凹加入2%指示红细胞悬液各1滴,摇匀后静置30min,观察红细胞凝集情况。
以己知ABO血型的分泌型人唾液作阳性对照,以检材无斑痕部分作阴性对照。
在己知对照正确的情况下,精斑检材与无精斑检材的抑制凝集相差3级以上,证明精斑中含有相应的血型物质,综合抗-A、抗-B及抗-H中和的结果,判断精斑的ABO血型(表13-6-1)。
中和试验操作简单,灵敏度较高。
在检测中一般不会出现假阳性结果,但假阴性值得注意。
抗血清的效价要准确标定,通常采用效价为4的抗血清,抗血清效价过高易导致假阴性结果。
浸泡检材的生理盐水不宜过多,检材浸液与抗血清中和时间至少30min以上等都可以减少假阴性。
检材浸出液混浊时,可水浴煮沸10min,离心,以除去蛋白、细菌、酶类等干扰。
(三)DNA分型
ABO血型除用血清学方法检测外,现可用分子生物学方法检测基因型。
如用PCR-直接测序法分析ABO基因序列,可区分为4种基因:
A、B、OA和OG,10种基因型,进一步丰富了ABO基因型的种类
二、精斑的血清型测定Determinationofserumtype
精液中含有一些具有多态性的血清蛋白,现可检出Gm、Km、GC、血清类粘蛋白等,分型方法与血清或血痕的分型方法一样,且分型结果也一致,故可用血清作对照样本。
三、精斑的酶型测定Determinationofenzymetype
精液中含具有多态性的酶,可分两类:
第一类酶的表型与血液或红细胞酶的表型一致,但两者的电泳谱型可能不完全相同,检测时可用嫌疑人的血液作对照,对照样本容易获得。
第二类酶型为精液所特有,在正常人血液或阴道液内不易检出,其他组织可能含有这类同工酶,但表型不一定相同,作对比检查时需嫌疑人的精液,对照样本不易获得。
由于这类酶不易受阴道液的干扰,在混合斑的个人识别中有重要的实用价值。
精液特有的酶有黄递酶(DIA3)和γ-谷氨酰转肽酶(GGT)等。
四、DNA分析★DNAAnalysis
精子含有大量DNA,可从精斑提取DNA,检测其多态性。
既使精液中无精子,由于精液中含有少量睾丸细胞、上皮细胞等,也能进行DNA分型。
(Accordingtotheabundantcellsinsemen,DNAanalysiscouldbedoneeas