ELISA检测.docx

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ELISA检测

ELISA检测

 在病原体急性感染的诊断中，平日需检测IgM抗体，如急性甲型肝炎诊断的血清抗HAVIgM检测、急性乙型肝炎病毒感染的血清抗HBclgM检测和TORCH项目标系列IgM检测等。

IgM抗体也有应用间接法测定的，现在朝在市场上可见到的有些TORCH系列的IgM检测试剂盒。

在应用间接法测IgM抗体时，因为临床血清样本中含有高浓度的IgG抗体，个中部分特异IgG抗体将与IgM抗体竞争与固相抗原结合，从而干扰IgM抗体的检测。

   是以，在应用间接法测定IgM抗体时，平日须将血清样本用抗人IgG抗体或SPA预处理，以去除IgG的干扰。

如许不只测定较为繁琐，同时阻碍测定的特异性和灵敏度。

今朝，常用的IgM抗体检测方法为捕捉法，即以抗人IgM抗体（抗人u链）作为固相抗体，当参加血清标本时，个中的IgM类抗体（特异的和非特异的）即可被固相抗体捕捉，再参加特异抗原，其与固相上捕捉的IgM抗体结合后，参加酶标抗特异抗原的抗体，最后参加底物显色。

具体操作步调如下：

   1．起首将抗人IgMbt链抗体于碳酸盐缓冲液中40c下住宿包被聚苯乙烯等固相，形成固相抗体，洗涤去除未与固相结合或结合不紧的抗体后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封闭，洗涤去除未结合的部分及杂质。

   2．参加含待测IgM抗体的临床样本如血清等，温育一准时刻后洗板；现在，待测样本中的IgM抗体就会与固相上的抗P链抗体反响而吸附于固相上。

   3．参加特异的抗原如HAV抗原、HBcAg等，温育一准时刻后洗板；现在，特异抗原就会与固相上的特异IgM抗体产生反响。

   4．参加酶标记的抗特异抗原的抗体，温育一准时刻后洗板；现在，在固相上即形成响应的抗原抗体复合物。

   5．参加酶底物，温育显色测定

   本方法要侧重留意的是RF（1gM类）及其他非特异IgM的干扰。

RF（1gM类）因为其能与固相抗人u链抗体结合，并可与随后参加的酶标抗体（动物IgG）反响，从而导致假阳性反响。

而非特异IgM因为其在第一步温育中，可与特异IgM竞争与固相抗体结合，因此会阻碍测定的灵敏度。

是以，应用本法测IgM，必须对临床样本进行恰当稀释。

样本稀释后，上述产生干扰感化的非特异IgM含量削减，而特异IgM因为处于响应病原体的急性感染期，滴度专门高，必定稀释后，可不能有明显阻碍，况且，在某些病原体如HBV的慢性感染时期，IgM类特异抗体也能连续存在，只只是滴度要低专门多。

   是以，如纰谬血清样本稀释，就直截了当检测，即使是没有非特异IgM的干扰，阳性测定成果也没有急性感染的诊断价值。

现在，有些试剂临盆厂家，为了逢迎临床实验室减轻劳动强度、简便操作的要求，临盆了不需对样本进行稀释的抗HAVIgM和抗HBclgMELISA试剂盒，现有许多实验室也在应用。

鉴于上面提到的缘故，我们建议临床实验室在做抗HAVIgM和抗HBclgM等类检测时，应应用对样本进行稀释的试剂盒，以包管检测的临床价值。

酶联免疫吸附测定ELISA成果剖断的常用缩写

ELISA测定按其表示测定成果的方法分为定性和定量测定两大年夜类。

定性测定只是对标本中是否含有待测抗原或抗体作出“有”或“无”的结论，分别用“阳性”和“阴性”来表示。

   可见定性测定平日是用于感染性病原体的抗原或抗体的测定，以确信特定病原体感染的存在与否。

而定量测定则是对标本中待测抗原的若干进行量值测定，以具体数值表示。

定量测定全然上是用于非病原体抗原物质的测定，如激素、细胞因子、肿瘤标记物、小分子药物等。

今朝国内应用的ELISA试剂盒绝大年夜部分是用于感染性病原体的抗原或抗体的定性测定，也有少部分用于。

   FP，hCG、细胞因子等的定量测定。

ELISA定性测定的“阴性”和“阳性”的剖断依照是试剂盒所确信的阳性剖断值（cut-off）。

定量测定的“量值”依照是试剂盒中所带标准品同时测定得出的剂量反响曲线（又称标准曲线）。

   实验室进行室内质控时应用。

   下面再说明一下在ELISA定性测定成果剖断中常用的一些缩写：

（1）S／CO：

个中S为sample（样本）或specimen（标本）的简写，表示的是标本测定的吸光度值，CO为cut-off值的简写。

除竞争克制法外，其他ELISA定性测定模式中，当S／CO值大年夜于或等于1时，标本的测定为阳性，小于1时为阴性。

（2）S／N或P／N：

个中S同

（1），N为negative（阴性对比）的简写，P为patient（患者）的简写。

较早的试剂盒专门多都应用S／N或P／N≥2．1为阳性剖断标准，现仍有一些试剂盒应用这种方法。

这种方法与S／CO方法无全然性差别，只只是是前者将阴性对比（N）的2．1倍视为cut-off值罢了.

酶免疫实验的长处及局限性

   酶免疫实验之因此能成为临床免疫考查中的主导技巧，是与它的方法上的特异性和灵敏性、操作上的简便性以及试剂的稳固性分不开的，还有专门重要的一点是，其对情形没有污染威逼。

  尽管如斯，作为一项免疫考查技巧，酶免疫实验照样有其局限性的，不只所检测的生物学体液样本如血清中有可能存在各类干扰实验的身分，同时在实验过程中，阻碍成果的身分也专门多，专门是进行手工的ELISA测准时。

   此外，在定性ELISA测定中，阳性剖断值（CUT-OFF）的建立，是在必定的统计学差不多上的，相关于某个具体的受检者来说，其有可能并不具备精确性。

例如，应用ELISA方法检测抗HCV及抗HIV或HBsAg，有时刻，检测所得的阳性结也许并不是真正的阳性，而须要应用其他方法如重组免疫印迹（recombinantimmunoblotas—say，RIBA）、蛋白印迹（Westernbl。

t，WB）或中和实验来确认，才能申报阳性。

那个地点抗HCV和抗HIV的检测均应用病毒部分的基因工程抗原，其他一些病毒如流感病毒、腮腺炎病毒和水痘病毒等感染人体后，亦或一些自身抗体，也有可能会导致假阳性反响。

   HBsAg的测定主假如弱阳性的问题，这与ELISA测定的“灰区”有关系，处于cut-off值四周亦即“灰区”的成果的靠得住性平日较差，阳性因此须要确认，阴性却也未必是真，这一点在血站筛检献血员血液时是专门重要的，必须引起留意，并采取恰当的方法，防止此类严峻阻碍人们健康的感染性疾病经输血传播，本书后面的有关章还会对此问题做具体阐述。

此外，免疫测定的差不多是抗原抗体的特异反响，是以，如检测抗原，除了要求抗体（单抗或多抗）是特异的外，还要求待测抗原上必须存在有能与所用抗体结合的抗原决定簇，假如因为基因突变导致某些位点的不表达，或者结合位点因为某些缘故被封闭或阻断，都邑阻碍抗体与抗原的结合，造成假阴性成果。

   如检测抗体，则要求所用包被抗原应尽可能包含所有的特异抗原决定簇，同时又尽可能不含有非特异的成分，这一点往往因为技巧程度的限制而难以完全做到，是以，从某种意义上来说，假阳性假阴性是不克不及完全幸免的，尽管经由过程尽力，能够将其降至专门低的程度。

这也是建立临床免疫考查方法所尽力的偏向.

酶联免疫吸附测定操作要点

1标本的采取和储存

   可用作ELISA测定的标本十分广泛，体液（如血清）、渗出物（唾液）和渗出物（如尿液、粪便）等均可作标本以测定个中某种抗体或抗原成份。

有些标本可直截了当进行测定（如血清、尿液），有些则需经预处理（如粪便和某些渗出物）。

大年夜部分ELISA检测均以血清为标本。

血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均一致于血清。

制备血浆标本需借助于抗凝剂，而血清标本只要待血清天然凝固、血块紧缩后即可取得。

除专门情形外，在医学考查中均以血清作为检测标本。

在ELISA中血浆和血清可一致应用。

血清标本可按惯例方法采集，应留意幸免溶血，红细胞消融时会开释出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增长非特异性显色。

   血清标本宜在新奇时检测。

如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反响。

如在冰箱中储存过久，个中的可产生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深。

一样说来，在5天内测定的血清标本可放置于4℃，跨过一周测定的需低温冰存。

冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，幸免气泡，可高低倒置混和，不要在混匀器上强烈振荡。

混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。

反复冻融合使抗体效价跌落，因此测抗体的血清标本如需储存作多次检测，宜少量分装冰存。

储存血清自采集时就应留意无菌操作，也可参加恰当防腐剂。

   2试剂的预备

   按试剂盒说明书的要求预备实验中需用的试剂。

ELISA顶用的蒸馏水或去离子水，包含用于洗涤的，应为新奇的和高质量的。

自配的缓冲液应用pH计测量较正。

从冰箱中掏出的实验用试剂应待温度与室温均衡后应用。

试剂盒中本次实验不需用的部分应及时放回冰箱储存。

   3加样

   在ELISA中一样有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。

加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，幸免加在孔壁上部，并留意弗成溅出，弗成产朝气泡。

加标本一样用微量加样器，按规定的量参加板孔中。

每次加标本应改换吸嘴，以免产生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加样。

有此测定（如间接法ELISA）需用稀释的血清，可在试管中按规定的稀释度稀释后再加样。

也可在板孔中参加稀释液，再在个中参加血清标本，然后在微型震动器上震动1分钟以包管混和。

加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器，使加液过程灵敏完成。

   4保温

   在ELISA中一样有两次抗原抗体反响，即加标本和加酶结合物后。

抗原抗体反响的完成须要有必定的温度和时刻，这一保温过程称为温育（incubation），有人称之为孵育，在ELISA中似不恰当。

   ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相别处上产生。

以抗体包被的夹心法为例，参加板孔中的标本，个中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最切近孔壁的一层溶液中的抗原直截了当与抗体接触。

这是一个慢慢均衡的过程，是以需经扩散才能达到反响的终点。

在厥后参加的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如斯。

这确实是什么缘故ELISA反响老是须要一准时刻的温育。

   温育常采取的温度有43℃、37℃、室平和4℃（冰箱温度）等。

37℃是实验室中常用的保温温度，也是大年夜多半抗原抗体结合的合适温度。

在建立ELISA方法作反响动力学研究时，实验注解，两次抗原抗体反响一样在37℃经1-2小时，产品的生成可达巅峰。

为加快反响，可进步反响的温度，有些实验在43℃进行，但不宜采取更高的温度。

抗原抗体反响4℃更为完全，在放射免疫测定中多使反响在冰箱中住宿，以形成最多的沉淀。

但因所需时刻太长，在ELISA中一样不予采取。

   保温的方法除有的ELISA仪器附有特制的电热块外，一样均采取水浴，可将ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底应贴着水面，使温度灵敏均衡。

为幸免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，现在可让反响板漂浮在水面上。

若用保温箱，ELISA板应放在湿盒内，湿盒要选用传热性优胜的材料如金属等，在盒底垫湿的纱布，最后将ELISA板放在湿纱布上。

湿盒应先放在保温箱中预温至规定的温度，专门是在气温较低的时刻更应如斯。

不管是水浴照样湿盒温育，反响板均不宜叠放，以包管各板的温度都能灵敏均衡。

室温温育的反响，操作时的室温应严格限制在规定的范畴内，标准室温温度是指20-25℃，但具体操作时可依照说明书的要求操纵温育。

室温温育时，ELISA板只要平置于操作台上即可。

应留意温育的温度和时刻应按规定力争精确。

为包管这一点，一小我操作时，一次不宜多于两块板同时测定。

   5洗涤

   洗涤在ELISA过程中虽不是一个反响步调，但却也决定实在验的成败。

ELSIA确实是靠洗涤来达到分别游离的和结合的酶标记物的目标。

经由过程洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反响过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。

聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是广泛性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。

能够说在ELISA操作中，洗涤是最重要的关键技巧，应引起操作者的高度看重，操作者应严格按要求洗涤，不得忽略。

   洗涤的方法除某些ELISA仪器配有专门的主动洗涤仪外，手工操作有浸泡式和流水冲刷式两种，过程如下：

（1）浸泡式a.吸干或甩干孔内反响液；b.用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去）；c.浸泡，立即洗涤液注满板孔，放置1-2分钟，间歇坚决，浸泡时刻弗成随便缩短；d.吸干孔内液体。

吸干应完全，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液体后在洁净毛巾或吸水纸上拍干；e.反复操作c和d，洗涤3-4次（或按说明规定）。

在间接法中如本底较高，可增长洗涤次数或延长浸泡时刻。

微量滴定板多采取浸泡式洗涤法。

洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。

聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合，从而减弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基团和水分子的结合感化，使蛋白质答复到水溶液状况，从而离开固相载体。

洗涤液中的非离子型洗涤剂一样是吐温20，其浓度可在0.05%-0.2%之间，高于0.2%时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低实验的灵敏度。

（2）流水冲刷式流水冲刷法最初用于小珠载体的洗涤，洗涤液仅为蒸馏水甚至可用自来水。

洗涤时附接一专门装配，使小珠在流水冲击下赓续地滚动淋洗，连续冲刷2分钟后，吸干液体，再用蒸馏水浸泡2分钟，吸干即可。

浸泡式如同盆浴，流水冲刷式则比如淋浴，其洗涤后果更为完全，且也简便、快速。

已有实验注解，流水冲刷式同样也有用于微量滴定板的洗涤。

洗涤时设法加大年夜水流量或加大年夜水压，让水流冲击板孔别处，洗涤后果更佳.

ELISA检测-----竞争法测抗体

 抗体的测定一样不应用竞争法。

当抗原中杂质难以去除或抗原的结合特异性不稳准时，可采取这种模式测定抗体。

如乙型肝炎病毒核心抗体（HBcAb）和乙型肝炎病毒e抗体（HBe•Ab）的测定，因为e抗原较核心抗原仅多29个氨基酸，e抗原专门轻易改变为核心抗原，是以，HBcAb和HBeAb的测定均采取竞争法。

但其测定具体模式有差别。

抗原的固相化既能够直截了当进行，亦能够经由过程响应特异抗体而间接固相化。

下面就HBcAb和HBeAbELISA测定具体操作步调分述如下。

   1．HBcAb的竞争法测定

（1）先将HBcAg在碳酸盐缓冲液中4~C住宿包被，形成固相抗原，洗涤去除未与固相结合或结合不紧的抗体后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封闭，洗涤去除未结合的部分及杂质。

（2）同时参加待测样本和酶标的特异抗体，温育一准时刻后洗板；此步中，待测样本的抗体将与酶标抗体竞争与固相上特异抗原结合。

   （3）参加酶底物，温育显色测定，显色的强弱与待测样本中的响应抗体的含量成反比

2.HBeAb的竞争法测定

（1）先将HBeAb在碳酸盐缓冲液中4℃住宿包被，形成固相抗体，洗涤去除未与固相结合或结合不紧的抗原后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封闭，洗涤去除未结合的部分及杂质；

（2）同时参加待测样本和中和抗原HBeAg，温育一准时刻后洗板；此步中，待测样本的抗体将与固相抗体竞争结合与中和抗原HBeAg，待测样本中HBeAb浓度越高，则与固相HBe—Ab结合的HBeAg越少，反之亦然；

   （3）参加酶标的特异抗体，温育一准时刻后洗板；此步中，酶标抗体将与结合于固相抗体上的特异抗原结合；

   （4）参加酶底物，温育显色测定，显色的强弱与待测样本中的响应抗体的含量成反比

HBeAb之因此要采取此种模式测定，主假如HBeAg的不稳固所致，如在固相直截了当包被HBeAg，则会因为HBeAg向HBcAg的易改变性，而导致测定误差。

   抗体的竞争法测定不合于只有单个抗原决定簇的小分子抗原的竞争法测定，其测定的靠得住性，在专门大年夜程度上受竞争抗体的特异性和亲和力大年夜小的阻碍，竞争抗体与待测抗体在结合的特异性及亲和力越接近一致，则测定的靠得住性越强，但竞争用抗体均为响应抗原免疫动物所得，与机体感染病毒后所产生的抗体确信会有所差别，因而，在今朝HBeAb和HBcAb的临床检测中，常有难以说明的测定成果显现，这与其在方法学上的固出缺点是分不开的。

ELISA检测 ----- 竞争法测抗原

大年夜分子抗缘故其具有两个以上的抗原决定簇，而可用双抗体夹心法测定，小分子半抗原如地高辛、茶碱等药物以及T3，T4及睾酮等激素因其只有一个抗原决定簇，从而无法应用双抗夹心方法测定，只能采取竞争克制法测定。

 具体步调如下：

   1．先用抗小分子的特异抗体如双抗体夹心法一样包被固相并封闭;

   2．同时参加待测样本和酶标的小分子，温育一准时刻后洗板；此步中，待测样本的小分子将与酶标小分子竞争与固相上特异抗体结合;

   3．参加酶底物，温育显色测定，显色的强弱与待测样本中的小分子含量成反比.

这种测定模式中，须要获得小分子与酶的结合物，而小分子酶结合物一则在制备上不如抗体酶结合物简便，二则其纯化亦颇为困难，结合有小分子的酶与游离酶之间难于分别。

是以，有人测验测验在合成二或多聚体小分子的差不多上，建立双抗夹心竞争ELISA方法测定小分子，测定的灵敏度和特异性均有所进步.

ELISA检测 ----- 间接法测抗体

全然方法的操作如下:

   1．将病原体的抗原在碳酸盐缓冲液中4~C住宿包被，形成固相抗原，洗涤去除未与固相结合或结合不紧的抗原后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封闭，洗涤去除未结合的部分及杂质;   

   2．参加含待测抗体的临床样本如血清等，温育一准时刻后洗板；现在，待测抗体就会与固阳上特异抗原反响而吸附于固相上;

   3．参加酶标记的抗人IgG抗体，温育一准时刻后洗板；现在，在固相上即形成固相抗原—待测抗体—酶标二抗复合物;

   4．参加酶底物，温育显色测定.

 间接法测抗体在今朝应用最多的是丙型肝炎病毒抗体（抗HCV）、人免疫缺点病毒抗体（抗HIV）以及梅毒螺旋体抗体等的测定。

从上述的测定模式可见，间接法测抗体，严格地讲，所测定的仅为抗体的IgG类，不涉及IgM和IgA类，这是由酶标二抗体所决定的。

 阻碍间接法测定抗体的一个较大年夜的身分是包被抗原的纯度。

现在间接法测抗体中所应用的抗原一样均为基因工程重组抗原，如HCV的NS3，NS4，NS5，HIV的gp41和gpl20和梅毒螺旋体TpNl5，TpNl7，TpN47等。

基因工程抗原在纯化时应尽量去除用来表达的宿主如大年夜肠杆菌的抗原，以免因为机体存在对这种宿主抗原的抗体而引起假阳性反响。

此外，因为机体的IgG类抗体浓度较高，个中绝大年夜部分为机体接触外界情形刺激所产生的非特异IgG，是以，为幸免这些高浓度非特异IgG对固相的吸附所致的假阳性反响，平日需对待测样本做必定程度的稀释.

临床ELISA测定常用模式 ----- 双抗体夹心法测抗原

关于含多个抗原决定簇的大年夜分子蛋白，应用双抗体夹心ELISA模式测定相当简便，现有的商品试剂盒全然上都采取此种测定模式。

具体测定方法如下:

   1．起首以双抗体之一于碳酸盐缓冲液中4℃下住宿包被聚苯乙烯等固相，形成固相抗体，洗涤去除未与固相结合或结合不紧的抗体后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封闭，洗涤去除未结合的部分及杂质;

   2．参加含待测物的临床样本如血清等，温育一准时刻后洗板；现在，待测抗原就会与固相上特异抗体反响而吸附于固相上;

   3．参加酶标记的双抗体之二，温育一准时刻后洗板；现在，在固相上即形成双抗体与特异抗原的夹心产品;

   4．参加酶底物，温育显色测定.

   在该测定模式中，有两步温育和板孔洗涤步调，假如将上述测定步调2和3并为一步，立即待测样本和酶标抗体同时参加，从而仅有一步温育和洗板过程，即为平日所说的“一步法”。

最初的双抗夹心ELISA试剂盒，均采取两步法。

后来，人们为了节俭时刻，简化操作步调，试剂临盆厂家慢慢推出了“一步法”试剂盒。

今朝在我们的临床实验室中，测定大年夜分子抗原如HBsAg、。

FP和hCG等，全然上都采取一步法。

一步法比拟于两步法，因此操作简单‘但有其固有的缺点，处理不行，对ELISA测定成果有严峻阻碍。

   在平日的两步温育洗涤方法中，抗原抗体反响将遵守下述规律，即在第一步中参加的待测标本中抗原（Ag）浓度慢慢增长时，将使固相抗体（Ab）与抗原的结合慢慢达到饱和[

（1）式]，如许当随后参加必定浓度的酶标抗体（Ab’）后，a复合物的形成将直截了当与在第一步中形成的b复合物相干[

（2）式]，是以，待测抗原浓度的慢慢增长导致了显色的慢慢加深，当抗原浓度增长到必定水日常平凡，反响显色达到平台，而呈S形变更曲线.

   而一步法双抗夹心ELISA的反响曲线则为钟形曲线。

也确实是说测定显色跟着待则标本中抗原浓度的增长而升高至必定程度后，测定吸光度即随抗原浓度的增长而开端降低直至不显色，即所谓的“钩状效应”（hookeHect），也确实是我们在免疫沉淀实验中所称的“带现象”（zonephen。

menon）。

一步法的反响均衡式如（3）式

   此外，b和c复合物的增长亦使得“双抗体夹心复合物”难以形成。

但假如 固相单抗和标记单抗采取针对抗原的不合且空间距离较远的决定簇的抗体，即包被应用一种 单抗，酶标记应用另一种单抗，同时充分混匀反响液，并恰当延长反响温育时刻，则可使b，。

和 d复合物削减至最低程度，而大年夜大年夜减轻“钩状效应”。

   我们曾应用本室能获得的含最高浓度（约2mg／m1）HBsAg的血清样本对今朝国内较大年夜的试剂临盆厂家的“一步法”HBsAg测定ELISA试剂盒的“钩状效应”进行了评判，尽管大年夜部分有在HBsAg最高浓度下的测定显色较次高浓度（1：

lo稀释）显色要浅的现象，但均未显现该份样本测定为阴性的情形。

尽管如斯，在临床实际工作中，仍有可能碰到“钩状效应”较严峻的HBsAg测定ELISA试剂盒，我们也经常听到基层实验室同业在这方面的反应。

是以，大年夜家还应当看重这方面的问题·，当发明测定成果明显与临床不符或与相干测定指标互有抵触，如HBeAg阳性样本HBsAg测定为阴性时，就应推敲HBsAg测定可能存在的“钩状效应”问题。

   综上所述，一步法ELISA试剂盒作为逢迎临床实验室简便快速要求的产品，有着庞大年夜的市场，其虽有潜在缺点，易导致含高浓度待测物的标本检测为阴性（假阴性），但精心的实验设计，对包被和酶标记抗体细心选择，完全能够将“钩状效应”显现的可能性降至最低。

此外，建议临盆HBsAg，aFP和hCGELISA"一步法”测定试剂盒的厂家，应对所产的试剂在出厂前对其“钩状效应"（hookeffect）进行充分的研究，并提示用户在应用时应留意之处。

   双抗体夹心法测抗原另一个所须要留意的是类风湿因子（RF）的干扰。

我们明白，RF是一种抗变性IgG的自身抗体，重要为19S的IgM类抗体，也可见7S的IgG及IgA类抗体。

这种自身抗体的特点是其是能与多种动物的变性IgG的Fc部分结合。

是以，假如血清标本中含有RF，在双抗夹心ELISA检测时，其即可作为固相抗体和酶标抗体（均为IgG）之间的桥接抗原，而产生假阳性反响。

是以，假如应用抗体的Fab2：

或Fab片段作为酶标记用