甘草酸的大孔树脂提取工艺.docx
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甘草酸的大孔树脂提取工艺
河北工大学
毕业论文
作者：
贾晋阳学号：
学院：
化工学院
系（专业）：
制药工程
题目：
甘草酸的大孔树脂提取工艺
指导者：
（姓名）（专业技术职务）
评阅者：
（姓名）（专业技术职务）
2012年6月9日
毕业设计中文摘要
甘草酸的纯化工艺研究
摘要：
从6种树脂中通过静态吸附筛选出了ADS-17树脂作为提取纯化甘草酸的最佳树脂。
研究了pH值、上样液流速、上样液浓度、洗脱液浓度、洗脱液用量这五个因素对甘草酸吸附、解吸作用的影响，并通过正交试验考察了最佳工艺条件。
实验结果证明最佳吸附条件为：
pH值为6.0、上样液流速为2BV/h、上样浓度为10mg/ml；最佳解吸条件为：
洗脱剂10%乙醇、洗脱液用量234ml。
在实验得出的最佳条件下，甘草酸的纯度为65.07%，回收率为61.39%。
另外，我们还在氢氧化钠回流的条件下进行了甘草酸构型的转换，结果表明转构后的甘草酸纯度为87.66%，产率44.1%。
关键词：
大孔树脂吸附纯化甘草酸
毕业设计外文摘要
TitleTheresearchofthePurificationTechnologyofGlycyrrhizicAcid
Abstract
Bystaticadsorption,ADS-17resinisfilteredastheoptimalresintoextractpurifiedglycyrrhizicacidfromthesixkindsofresins.ThestudyofpH,supernatantflowrate,supernatantconcentration,eluentconcentrationandeluentamountshowsthesefivefactorseffectsontheadsorptionanddesorptionofglycyrrhizicacid,andoptimumconditionswereinvestigatedbyorthogonalexperiment.Experimentalresultsshowedthattheoptimumadsorptionconditionsasfollows:
pH6.0,supernatantflowratefor2BV/h,theconcentrationofthesupernatantfor10mg/ml;bestdesorptionconditionswereasfollows:
10%ethanol,eluentamountfor234ml.Underoptimalconditionsdrovedbyexperiment,thepurityofglycyrrhizicacidwas65.07%,recoveryratewas65.3%.Inaddition,wecompletedthestructuralconversionofglycyrrhizicacidunderaconditionofsodiumhydroxide'sreflux;resultsshowedthatthepurityofglycyrrhizicacidreached87.66%;recoveryratereached44.1%aftertheconversion.
Keywords：
MacroporousresinsAdsorptionPurification
GlycyrrhizicAcid
目次
1引言1
1.1甘草酸简介1
1.2甘草酸及其生产概述2
1.3大孔树脂分离纯化技术3
1.4本论文研究内容3
2实验原理及材料4
2.1实验原理4
2.2实验试剂和设备5
3甘草酸的纯化研究7
3.1大孔树脂的预处理及再生7
3.2甘草酸检测方法的确定8
3.3树脂种类的选择9
3.4甘草酸的动态吸附11
3.5甘草酸的梯度洗脱14
3.618β-甘草酸到18α-甘草酸的构型转换17
4实验数据与讨论20
4.1静态实验结果分析20
4.2动态试验结果分析20
4.3构型转换结果分析21
结论22
参考文献23
致谢25
附录26
1引言
甘草酸（GA），是从甘草的根茎中提取出的一种高甜度、低热值的具有天然活性的成分，其在甘草中的存在形式主要为钾盐和钙盐，游离的甘草酸含量并不多。
它的植物来源——甘草也是一种我国的传统中药，具有悠久的使用历史，中医上认为：
甘草味甘，是补脾益气，止咳、止痛的良药，并且已被美国FDA收录为安全无毒物质[1]。
科学研究表明，甘草中的主要成分有甘草酸和黄酮类，具有抗炎、镇咳、抗肿瘤、等作用，有较强的人体免疫功能促进作用[2]，在医疗领域具有极高应用价值。
因此本文阐述了将大孔树脂用于甘草酸纯化的原理、方法及应用，并在此基础上提出本论文的研究内容。
1.1甘草酸简介
中文名：
甘草酸，又称甘草甜素、甘草皂甙
CAS：
1405-86-3
英文名：
Glycyrrhizicacid
分子式：
C42H62O16
分子量：
822.92
化学名：
（3β,20β）-20-羧基-11-氧代-30-去甲基-（18α-H）-整齐墩果-12-烯-3β-羟基-2-O-β-D-葡萄吡喃糖醛酸基-α-D-葡萄吡喃糖醛酸[3]
结构式为：
甘草酸是一种三萜皂苷类天然药物，分解温度220℃，在醋酸中为无色柱状结晶，易溶于热水，可溶于热稀醇，但难溶于无水乙醇或乙醚[4]。
其主要用途有：
（1）作为高甜度、低热值的食品添加剂，可添加于食品、饮料中作甜味剂，或在黄色或棕色食品、饮料中作天然色素[5]。
（2）用于化妆品及卷烟业，可间接的增强皮质甾类化合物的作用，主要用霜、露、乳液、奶类等化妆品，能降低化妆品的毒性，也可用于防止化妆品的过敏反应，适于高级发用或肤用化妆品[6]。
1.2甘草酸及其生产概述
由于甘草成分复杂，仅黄酮类就有150多个成分，其分离、纯化较为复杂、难度较高。
目前甘草酸及其盐的生产工艺方法较多[7]，其中主要有溶剂法和树脂法二种。
1.2.1水提法
水提法是使用时间最早,也是最为常用的一种溶剂提取法,其特点在于操作简单,成本低廉,但得率较低,据1990年中国药典方法测定，甘草酸得率仅为3%。
这是在因为甘草酸中水容性杂质较多，水提法提取出的杂质也相应增加,在去除杂质的过程中损失了大量甘草酸。
1.2.2氨性醇提取法
在对甘草酸的提取研究中,发现用含氨0.3%的60%乙醇回流，对甘草酸的提取具有较好的效果。
甘草酸得率达10.49%,比水提法提高了两倍,并且避免了糖类、淀粉等水溶性杂质的混入,利于进一步的精制过程。
但在加热回流过程中，有氨气逸出会造成环境污染问题，氨的损失也不能忽略。
1.2.3聚酰胺法
将甘草酸粗品制成的单铵盐，再吸附在粉末状的聚酰胺上，然后洗脱掉杂质,再用极性溶剂洗脱甘草酸单铵盐，最后用强酸型交换树脂脱胺,制得甘草酸。
该方法获得的甘草酸纯度很高，但操作繁琐，不易进行工业化生产。
1.2.4离子交换树脂法
该法利用甘草酸中含有3个羧基与离子交换树脂形成离子键，吸附在树脂上,而其他一些不含羧基的杂质不能被吸附,进而达到分离的目的。
日本曾以弱碱性树脂吸附甘草酸,再用氨水洗脱下来，进而得到纯度较高的产品。
但是离子交换树脂法处理量小，不适宜大批量生产。
1.2.5大孔吸附树脂法
大孔吸附树脂法是一种较为经济实用的方法。
通常选用的树脂有D101、NKA、X-5、XAD、DA201以及AB-8等。
利用大孔树脂的空间结构、氢键进行吸附,以水或稀低级醇洗脱,收集洗脱液,回收溶剂后可得到较高纯度的甘草酸。
该法的优点在于操作简单、易于大批量生产，大孔树脂可重复使用，缺点是即使回收溶剂，消耗的乙醇依旧较多，需要控制成本[8-10]。
1.3大孔树脂分离纯化技术
大孔树脂（macroporousresin）作为一种新材料，近年来已广泛应用于天然产物的分离,已成为分离有机化合物特别是水溶性化合物的一种有效手段。
大孔树脂对甘草酸粗品的吸附量较大,且能再生并反复使用。
该方法操作简便，成本低，是目前纯化甘草酸经济有效的方法。
据报道，20世纪80年代日本首先采用大孔树脂来分离纯化甘草酸，并且使收率显著提高，成本也降低了。
随后我国也对该项工艺路线进行了相关研究，但由于商业机密等原因披露较少。
所以，虽然我国甘草的出口量很大，但多为原料粉或浸膏等初加工产品，不仅工艺落后，而且对环境也有严重污染。
因此，我们设计了这个实验，研究几种大孔树脂对甘草酸的分离纯化效果，改进纯化甘草酸的工艺条件[11-13]。
1.4本论文研究内容
大孔树脂应用于甘草酸的分离已将近20年[14]，但纵观现有文献不难发现，许多大孔树脂发现时间较早，虽然研究较为透彻，但分离纯化效果已经落后于新型的选择性大孔吸附树脂，因此有必要对其进行重新研究。
本论文的主要实验内容：
1、利用静态吸附实验，筛选出吸附量和纯化程度比较高的大孔树脂。
2、通过动态吸附实验，确定大孔树脂的泄漏点，进而计算吸附量，并获得影响吸附量的具体实验因素。
3、通过梯度洗脱实验，确定洗脱剂的最佳洗脱浓度。
4、由解吸实验，获得洗脱液中甘草酸的含量分布，绘制解吸曲线。
5、最后将纯化后的甘草酸置于碱液中蒸煮，将具有毒副作用的18β构型，转变为具有疗效的18α构型。
2实验原理及材料
2.1实验原理
本实验以低含量甘草酸为原料，利用大孔树脂的空间结构对甘草酸及杂质的吸附能力的差异，从甘草酸粗提液中选择性吸附甘草酸，再通过吸附和解吸附的过程，用一定浓度的乙醇溶液将其从树脂柱中洗脱下来，从而达到分离纯化甘草酸的目的。
由甘草酸的结构上看可以发现，甘草酸分为两个主要部分，一部分是由五环三萜组成的疏水基；另一部分为两个葡萄糖环组成的亲水基，这就导致了甘草酸不仅具有疏水性还具有亲水性。
而大孔树脂是吸附性和筛选性相结合的分子分离材料,其吸附性是由于范德华力或氢键的作用，而筛选原理由树脂本身的孔型结构所决定[15]。
所以，需要筛选出孔径大小与甘草酸近似，孔隙率较高，在水中易于与甘草酸通过范德华力或氢键结合，在一定浓度的乙醇溶剂中易于与甘草酸分离的大孔树脂。
2.2实验试剂和设备
2.2.1实验试剂
名称
级别
生产厂家
甲醇
色谱纯
天津市康科德技术有限公司
磷酸
色谱纯
天津市康科德技术有限公司
乙腈
色谱纯
天津市科密欧化学试剂有限公司
乙酸铵
分析纯
天津市化学试剂一厂
冰醋酸
分析纯
天津市科密欧化学试剂有限公司
氢氧化钠
分析纯
天津市科密欧化学试剂有限公司
碳酸氢钠
分析纯
天津市天大化工实验厂
氯化钠
分析纯
天津市风船化学试剂科技有限公司
甲酸
分析纯
天津市化学试剂一厂
正丁醇
分析纯
天津市科密欧化学试剂有限公司
乙酸乙酯
分析纯
天津市科密欧化学试剂有限公司
氨水
分析纯
天津市科密欧化学试剂有限公司
无水乙醇
分析纯
天津市风船化学试剂科技有限公司
无水甲醇
分析纯
天津市江天化工技术有限公司
浓硫酸
分析纯
天津市光复精细化工研究所
甘草酸80%
西安融升生物科技有限公司
甘草酸25%
西安融升生物科技有限公司
甘草酸单铵盐
成都曼思特生物科技有限公司
盐酸
蒸馏水
2.2.2实验用树脂
牌号
树脂结构
极性
粒径范围（mm）
平均孔径（nm）
孔隙率
（%）
比表面（m2/g）
X-5
交联苯乙烯-二乙烯苯共聚物
非极性
0.3-1.25
29-30
50-60
500-600
AB-8
交联苯乙烯-二乙烯苯共聚物
弱极性
0.3-1.25
13-14
42-46
480-520
NKA
交联苯乙烯-二乙烯苯共聚物
非极性
0.3-1.0
20-22
-
570-590
ADS-17
交联苯乙烯-二乙烯苯共聚物
中极性
0.3-1.25
25-30
45-50
90-150
D101
交联苯乙烯-二乙烯苯共聚物
非极性
0.3-1.25
25-28
42-46
600-700
D4020
-
非极性
0.3-1.25
10-10.5
-
540-580
2.2.3实验设备
名称
型号
生产厂家
循环水真空泵
SHZ-D（Ⅲ）
巩义市英峪予华仪器厂
层析柱
φ2.2×30cm
旋转蒸发器
RE52CS
上海亚荣生化仪器厂
恒温水浴锅
B-220
上海亚荣生化仪器厂
色谱泵
LC-10ATvp
日本岛津
色谱控制器
AT-530
AutoScience
紫外检测器
SPD-10Avp
日本岛津
色谱泵
600
Waters
色谱控制器
600
Waters
二极管阵列检测器
2996
Waters
薄层层析硅胶板
GF-254
青岛海洋化工厂分厂
超声波清洗器
PS-10A
东莞市洁康超声波设备有限公司
紫外分析仪
ZF7
巩义市予华仪器有限责任公司
玻璃点样毛细管
华西医科大学仪器厂
3甘草酸的纯化研究
3.1大孔树脂的预处理及再生
3.1.1大孔树脂的预处理[16-19]
工业级新树脂在工厂被合成出来后不能直接使用，使用前需要用一些方法进行预处理，以除去树脂中所含少量的低聚物，有机物及有害离子，才能保证其理化特性符合要求。
以下为一般树脂的预处理流程：
①以丙酮为溶剂浸泡树脂24h（1BV为1个树脂床体积）。
②用2BV的乙醇以2BV/h的流速通过树脂柱,并浸泡树脂4～5h。
③用乙醇2BV/h的流速洗涤树脂，至流出液加水不呈白色混浊为止，再用蒸馏水以同样流速洗净乙醇。
④用2BV的5%HCl溶液以4～6BV/h的流速通过树脂层，并浸泡树脂2～4h，而后用水以同样流速洗至出水pH中性。
⑤用2BV的2%NaOH溶液以4～6BV/h的流速通过树脂层，并浸泡树脂2～4h，而后用水以同样流速洗至出水pH呈中性。
将处理完的树脂置于水环境中密封保存，备用。
3.1.2大孔树脂的再生
树脂反复使用多次后，会在其表面或者内部残存很多非吸附性杂质或吸附性杂质，导致树脂颜色加深，吸附能力下降，柱效降低。
因此，需要对大孔树脂进行再生处理。
处理前首先要明确树脂中残留物的种类，最常见的是树脂受到有机物污染，可以用1%NaOH、10%NaCl盐碱混合溶液浸泡处理。
若是由于大孔树脂放置时间过久，受到微生物污染后，可重新进行预处理或者用小于1%双氧水溶液浸泡、水洗即可。
若大孔树脂失水变干时，可以用乙醇浸泡，然后再水洗。
若树脂受到铁污染时，可以用4~10%的盐酸溶液浸泡处理[20]。
3.2甘草酸检测方法的确定
3.2.1TLC法
取甘草酸粗品2.0g用10ml70%乙醇溶解，置于温包上加热5分钟，然后趁热过滤，得到红棕色溶液作为原料对照品。
配制展开剂正丁醇：
水：
冰醋酸=4:
2:
1和4:
1:
1[21]，取对照品和标准品点板，用两种展开剂展开，在紫外灯光下观察。
展开剂为正丁醇：
水：
冰醋酸=4:
2:
1的硅胶板有拖尾现象，展开时间约为2小时；展开剂为正丁醇：
水：
冰醋酸=4:
1:
1的硅胶板分离较好，Rf约为0.6，展开时间约为1.5小时。
3.2.2HPLC法
色谱条件为流动相：
甲醇：
0.2%mol/L醋酸铵：
冰醋酸=67:
33:
1检测波长为254nm[22]，流量1.0ml/min,柱温维持在28-30℃。
先由标准品进样，获得甘草酸的保留时间。
再用处理过的原料对照品进样，与标准品谱图对比获得原料中甘草酸的含量。
结果发现在甘草酸的高效液相色谱上，邻近甘草酸的位置存在许多杂质峰，TLC法得到的点不能说明只存在甘草酸，还可能存在与甘草酸类似的杂质，该方法不能用于甘草酸的定性分析。
所以只选用HPLC法进行检测。
3.2.3流动相的选择
根据文献记载，甘草酸高效液相色谱使用的流动相主要分为两类，一类为乙腈体系，即乙腈：
0.1%磷酸=35：
65；另一类为甲醇体系，即甲醇：
0.2%mol/l乙酸铵：
乙酸=67：
33：
1[23]。
我们将两种体系都用于高效液相色谱的检测，发现乙腈体系峰形较好，杂质峰较少，保留时间较长，出峰时间较晚，但是由于乙腈毒性较大，价格较贵，与甲醇换相时易产生气泡阻塞泵体。
甲醇体系的保留时间较短，峰形较乙腈体系差，但杂质峰较多，更能说明样品中甘草酸的实际含量，且较短的保留时间有利于缩短检测时间增加检测效率。
在流动相为甲醇：
0.2%mol/l乙酸铵：
乙酸=67：
33：
1中，甘草酸峰值与杂质峰未完全分开，积分结果不准确。
所以，我们调整了流动相比例，甲醇：
0.2%mol/l乙酸铵：
乙酸=60：
40：
1，保留时间变长，甘草酸峰值与杂质峰的分离不理想。
将流动相比例调整为甲醇：
0.2%mol/l乙酸铵：
乙酸=65：
35：
1，保留时间相应变短，用原料进样，甘草酸峰附近未发现杂质峰。
因此，确定高效液相色谱的流动相为甲醇：
0.2%mol/l乙酸铵：
乙酸=65：
35：
1。
3.3树脂种类的选择
准确称取六种大孔树脂（AB-8、ADS-17、D4020、X-5、D101、NKA）各5g，分别置于100ml锥形瓶中，加入25%甘草酸原料30ml，浓度10mg/ml，静置24小时，期间摇动几次，取少量上层清液检测甘草酸含量，结果发现六组实验均未检测到甘草酸。
继续向锥形瓶中加入25%甘草酸原料20ml，浓度10mg/ml，静置24小时，期间摇动几次，取少量上层清液检测甘草酸含量，发现AB-8、D4020、X-5、NKA中均检测到甘草酸，在ADS-17和D101中则均未检测到甘草酸。
再次向锥形瓶中加入25%甘草酸原料20ml，浓度10mg/ml，静置24小时，期间摇动几次，取少量上层清液检测甘草酸含量，在ADS-17和D101中依然未检测到甘草酸。
最后向ADS-17和D101组的锥形瓶中加入25%甘草酸原料20ml，浓度10mg/ml，静置24小时，期间摇动几次，取少量上层清液检测甘草酸含量，ADS-17中检测到甘草酸含量为0.81%，D101为0.01%，可认为这两种树脂已经达到泄漏点，ADS-17的静态吸附量为88.37mg原料，D101的静态吸附量为89.98mg原料。
图1ADS-17泄漏点HPLC图
图2D101泄漏点HPLC图
因此，选择ADS-17和D101树脂进行动态实验。
3.4甘草酸的动态吸附
3.4.1ADS-17动态吸附实验
设定pH（5.0、6.0、7.0）、原料流速（1BV/h、2BV/h、3BV/h）、上样浓度（5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml）为实验因素，绘制三因素三水平正交实验表。
表1：
ADS-17动态吸附正交试验因素水平表
序号
A
pH
B
原料流速（BV/h）
C
上样浓度（mg/ml）
1
5.0
1
5
2
6.0
2
10
3
7.0
3
15
取ADS-17树脂540ml，平均装入9根层析柱中，即填料体积为60ml（1BV）。
配制各种pH和浓度的原料液3BV，以设定条件进行实验，用一组13ml西林瓶盛接原料流出液，检测各瓶中甘草酸含量，确定各组实验的泄漏点，并计算吸附量。
表2：
ADS-17动态吸附的正交试验表
实验号
A
B
C
吸附量（mg）
1
5.0
1
5
1015
2
6.0
2
5
1565
3
7.0
3
5
365
4
6.0
1
10
1770
5
5.0
2
10
720
6
7.0
3
10
1180
7
7.0
1
15
1095
8
5.0
2
15
1290
9
6.0
3
15
1485
表3：
ADS-17动态正交试验结果总结表
项目
pH项
原料流速项
上样浓度项
K1（mg）
3485
3880
2936
K2（mg）
4820
3575
4045
K3（mg）
2171
3021
3870
1（mg）
1162
1293
979
2（mg）
1607
1191
1348
3（mg）
724
1007
1295
R（mg）
883
286
369
对于该动态吸附实验，其中吸附量计算公式：
（1）
C——上样浓度，单位mg/ml
n——泄漏点所在瓶号（13为每个西林瓶的体积）
计算举例：
在第4组实验中，由HPLC检测得出第9瓶出现泄露，则在第4组的实验条件下，甘草酸的吸附量为
（60+13×9）×10=1770mg
其它实验组的吸附量以同样的方法计算。
当pH=5时，三组吸附量的加和为K1=1015+1180+1290=3485mg，而
1=K1/3=1162mg。
同理可以计算出正交表中的其他各因素水平下的吸附量的总和K及平均值
。
pH因素下的极差计算公式：
（2）
即R=1607-724=883。
同理以同样的方法可计算原料流速和上样浓度的极差。
因此在三个影响因素中，pH是最主要的影响因素，其次为原料流速，上样浓度的影响最小，最佳条件组合为A2B2C2，即ADS-17树脂选定的最佳实验条件为pH=6.0，原料流速2BV/h，上样浓度C=10mg/ml。
3.4.2D101动态吸附实验
设定pH（5.5、6.0、6.5）、原料流速（1.5BV/h、2.0BV/h、2.5BV/h）、上样浓度（8mg/ml、10mg/ml、12mg/ml）为实验因素，绘制三因素三水平正交实验表。
表4：
D101动态吸附正交试验因素水平表
序号
A
pH
B
原料流速（BV/h）
C
上样浓度（mg/ml）
1
5.5
1.5
8
2
6.0
2.0
10
3
6.5
2.5
12
取D101树脂540ml，平均装入9根层析柱中，即树脂床体积为60ml（1BV）。
配制各种pH值和浓度的原料液5BV，以设定条件进行实验，收集原料流出液，检测甘草酸含量，确定各组实验的泄漏点[24]。
表5：
D101动态吸附的正交试验表
实验号
A
B
C
吸附量（mg）
1
5.5
1.5
8
1728
2
6.0
2
8
1936
3
6.5
2.5
8
2048
4
6.0
1.5
10
2290
5
6.5
2
10
2410
6
5.5
2.5
10
1900
7
6.5
1.5
12
2280
8
5.5
2
12
1968
9
6.0
2.5
12
1968
表6：
D101动态正交试验结果总结表
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