生物技术在药用植物中的应用及研究进展.docx

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生物技术在药用植物中的应用及研究进展

生物技术在药用植物中的应用及研究进展

【摘要】通过参阅大量文献资料对近年来生物技术在我国药用植物研究中的应用进展进行了综述。

从组织培养技术在药用植物中的应用、细胞培养的研究概况、基因工程、离子束的应用和分子生物学在药用植物中的应用等内容出发，目的在于为开发我国丰富中草药资源、利用我国中草药资源提供开发的依据。

【关键词】中草药；生物技术；组织培养；基因工程；离子束

我国野生药用植物种质资源非常丰富，已发现11000多种药用植物，种类和数量均居世界首位，为我国研制新的天然药物奠定了良好的资源基础。

但传统的中草药获取方法是以采集和消耗大量的野生植物资源为代价的，当采集和消耗量超过自然资源的再生能力时，必然会导致物种濒危甚至灭绝。

为了解决药用植物的供需矛盾，人们多采用人工栽培的方法扩大药源，但在人工栽培药用植物时又面临着花费时间长、繁殖系数小、耗种量大、种子带病与农药残留等问题，严重影响了产量和品质。

近年来，生物技术的兴起，为我国药用植物的研究和发展提供了良机和手段。

1　植物组织培养

1.1历史与现状

　近40年来，植物组织培养已成为生物学科研究的重要技术手段，并在农业、林业、医药业等行业中被广泛应用，产生了巨大的经济效益和社会效益。

我国药用植物组织培养的研究，可以追溯到20世纪60年代。

1964年，中国科学院上海植物生理研究所罗士韦教授等首先报道了人参组织培养获得成功的研究成果。

到目前为止，已有120多种药用植物通过离体培养获得试管植株，其中大多数为珍贵的药用植物。

其中有的还利用试管繁殖技术用于生产栽培种植药材，如苦丁茶、芦荟、怀地黄、枸杞、金钱莲等。

1.2组织培养技术在药用植物中的应用

　1.2.1　药用植物种苗的快速繁殖利用植物组织培养技术进行药用植株无性繁殖来解决药用植物天然资源不足这一棘手问题，具有成本低、效率高、生产周期短、无性遗传特性一致的优点。

特别是对某些种子繁殖慢、难繁殖的药用植物。

组织培养通过选择材料的部位（如根、茎、叶的段、片、块等），运用培养基获得芽体，最后培养成为植株。

现在已经在药用植物中广泛应用，已在上百种药用植物上成功完成组织培养。

1.2.2无性植株的再生

无性植株的再生是对植物通过组织培养和遗传工程进行品种改良的一个先决条件，也是实现获得大量人工种苗的重要途径，目前我国药用植物用组织培养技术繁殖的无性系可概括为以下几个方面：

①带节茎段扦插快繁，即由带节茎段在无菌条件下扦插，可以进行快速无性繁殖，如黄芩、罗布麻等；②器官发生，细胞或愈伤组织培养通过不定芽形成植株，如枸杞、西洋参、毛地黄、丹参、黄连等已通过这种方式建立了无性繁殖系，得到了人工种苗；③类胚体途径，细胞或愈伤组织通过胚状体途径，即经过球形胚期、心形胚期、鱼雷胚期、子叶胚期经成熟胚发育成小植株。

有些植物在成熟胚的类胚体上，还能继续不断地形成新的胚状体，如西洋参、人参、甘草、三七、黄连等；④原球茎，细胞或组织培养经原球茎途径分化形成植株。

如铁皮石斛、百合等。

1.2.3胚的离体培养获得人工种苗

胚培养可以克服有性杂交中的胚乳败育、早期胚败育和珠心胚干扰等获得杂种苗，此项技术已进入实用阶段，西洋参、红花、枳壳、长春花、银杏等植物的胚培养已获成功。

张新宁等通过对宁夏枸杞四倍体与二倍体交杂种子中幼胚和胚乳的发育形成的研究中发现，利用杂交授粉后12d的幼胚进行胚培养，是解决无子枸杞选育中杂交败育问题的有效途径。

李志良对中国红豆杉和短叶红豆杉的离体胚培养特性进行了研究，发现在适宜的条件下两种胚萌发率与成苗情况没有明显的差异，离体胚培养是实现大规模种植的一条快捷途径。

1.2.4药用植物的品种改良

生物技术能在细胞水平上进行诱导和筛选。

增大了遗传变异的资源；重组DNA技术和细胞杂交可增加、除去或修饰植物的某个基因，使有利基因按计划理想地组合：

用花药培养或未授粉的子房培养，获得单倍体或纯合二倍体，极大地提高了选择优良基因型的效益，并可加速获得遗传性状稳定而一致的群体，通过原生质体诱导融合，还得到一些生物碱或次生代谢产物含量高的药用植物，例如曼陀罗属有一个种间细胞杂种，其生物碱含量可高于亲本20％-25％。

植物基因工程已成功地将外源基因导入植物体中，并获得转基因植物新品种。

利用这一技术可将某些优良性状基因导入本不具备这些性状的植物体内，可达到改良植物品种的目的，如通过抗病、抗虫等基因的导入，获得抗病虫植株；控制植物次生代谢产物合成酶的合成基因的导入，从而获得有效成分含量高的植株等。

1.2.4.1单倍体和多倍体培养

单倍体经染色体加倍后成为纯系,而且突变性状易于表现出来,对于杂合性的药用植物品种选育、改良及遗传分析有重要意义。

樊映汉对宁夏枸杞含单核晚期花粉的花药培养,得到来自花粉的单倍体植株。

曹有龙等用枸杞花粉愈伤组织悬浮培养产生胚状体也获得了单倍体植株。

而以宁夏枸杞未受粉的子房为材料,可获得四倍体和非整倍体植株,其中诱导出的同源四倍体枸杞表现出花和果实大、种子少的特点,充分显示出其潜在价值。

李健等采用组织培养技术与化学诱变相结合及幼胚培养等手段,选育出枸杞优良三倍体株系99-3,与目前生产中最优栽培品种宁杞1号相比,总含糖量高37􀀁59%,氨基酸含量高9.5%,千粒果重高8.6%,含籽数降低58􀀁70%,是一个理想的枸杞深加工品系。

目前利用单倍体和多倍体培养技术培育得到新品种的药用植物有当参、黄芪、丹参等,其中部分品种已产生了可观的经济效益。

1.2.4.2原生质体培养与融合

原生质体培养和植株再生技术是药用植物生物工程的基础,通过原生质体培养筛选高产细胞系、细胞杂交、以原生质体作为受体系统的基因转化技术都依赖于植物原生质体的培养、融合和植株再生技术。

自从植物原生质体培养技术产生以来,许多经济植物,特别是重要农作物的原生质体培养工作已广泛开展并取得了相当大的进展,但原生质体培养在药用植物上的应用相对滞后。

从目前的研究进展来看,枸杞、峨参、决明、防风、光棘豆、人参、龙胆、绞股蓝、川

芎、前胡等已实现了以原生质体培养获得愈伤组织或再生植株。

刘宝等用黄花烟草叶片愈伤组织和宁夏枸杞下胚轴愈伤组织培养分离获得原生质体并进行融合,实现了远缘遗传物质交流,获得杂种小苗。

这为探索通过原生质体融合技术将枸杞中决定药用成分的基因转移到重要经济作物烟草中奠定了基础。

1.2.5药用植物离体种质保存

与传统的保存植物种质资源的方法种子库相比,采用植物细胞、组织或器官,能最大限度地抑制生理代谢强度,降低劣变发生频率,达到长期保存种质的目的。

铁皮石斛试管苗在4∀黑暗条件下可连续保存12个月,并能恢复正常生长。

杜仲的花粉在液氮（-196∀）中保存良好,并实现了花粉粒的萌发。

刘贤旺等在研究凹叶厚朴愈伤组织的超低温保存中发现适宜的保存材料、恰当的处理、较好的冷冻保护剂以及合适的冷冻程度是超低温保存凹叶厚朴愈伤组织的关键。

值得注意的是,李明军等利用怀山药的无菌苗进行离体诱

导,形成微型块茎,发现微型块茎是怀山药离体繁殖和种质保存的又一途径,这将有助于种质资源的保存和交流。

目前离体种质保存虽已进行了较长时间的研究,但因其本身的局限性或技术上的不成熟而在实际应用中受到极大限制。

相对而言,超低温保存却显示了其广阔前景,但长期使用冻存材料可使其再生能力衰退、组织培养后代遗传稳定性等仍未解决的问题还有待于进一步研究。

目前用生物技术进行药用植物种质保存有两种方法：

一种是以抑制细胞生长来保存种质，另一种是超低温的种质保存。

用抑制细胞生长的方式来保存，其主要手段是控制培养物的培养基成分及培养温度。

在培养基中加入脱落酸等生长减速剂或提高细胞激动素、赤霉素的浓度，减缓培养物的生长速度，使继代周期延长，继代次数减少，以保存种质。

降低培养温度，使培养物的分化代谢活动减弱，加长继代周期，也是种质保存的可行办法。

药用植物种质的超低温保存研究，在我国近10年才开始，目前已有铁皮石斛、新疆紫草、浙贝母超低温保存研究的报道。

铁皮石斛试管苗在4℃黑暗条件下可连续保存12个月，并能恢复正常生长。

而李明军等利用怀山药的无菌苗进行离体诱导，形成微型块茎，发现微型块茎是怀山药离体繁殖和种质保存的又一途径，这将有助于种质资源的保存和交流。

目前离体种质保存虽已进行了较长时间的研究，但因其本身的局限性和技术上的不成熟而在实际应用中受到了极大限制，而超低温保存却显示了其广阔前景。

但长期使用冻存材料可使其再生能力衰退、组织培养后代遗传稳定性等仍未解决的问题还有待于进一步研究。

2　药用植物基因工程研究进展

目前植物转基因的方法主要有农杆菌介导的基因转移、种质系统的基因转移和外源基因直接导人法等。

国内学者主要采用农杆菌介导的基因转移法。

人工改造过的农杆菌Ti质粒或Ri质粒是一种很好的植物基因工程载体，同时Ti质粒或Ri质粒还可以配合使用。

建立二元载体系统。

有利于质粒在植物基因工程中的应用。

张荫麟等用发根农杆菌和根癌农杆菌感染丹参无菌苗，分别诱导出毛状根和冠瘿瘤，使其在无激素培养基及光照条件下分化出丹参再生植株，以发根农杆菌转化的再生植株具典型毛状根再生植物的特征，根癌农杆菌转化的再生植株株形高大，根系发达，丹参酮含量高于原植物。

常振战等以发根农杆菌转化天山大黄。

2.1转基因药用植物研究

目前植物转基因的方法主要有农杆菌介导的基因转移、种质系统的基因转移和外源基因直接导入法等。

国内学者主要采用农杆菌介导的基因转移法。

人工改造过的农杆菌Ti质粒或Ri质粒是一种很好的植物基因工程载体,同时Ti质粒或Ri质粒还可以配合使用,建立二元载体系统,有利于质粒在植物基因工程中的应用。

王慧中等已成功地将外源卡那霉素抗性基因通过根癌农杆菌介导的基因转移技术导入了宁夏枸杞的幼茎外植体,所获得的再生植株经胭脂碱检测、NPN-Ⅱ活性测定及Southern分子杂交,证明外源基因NPN-Ⅱ及胭脂碱合成酶基因,已整合到枸杞细胞的核基因组上,并能在植株水平上表达出相应的性状。

雷和田等用根癌农杆菌感染栝楼无菌苗后,形成栝楼冠瘿组织,将其作为培养系统生产无花粉蛋白有很好的开发前景。

此外,我国学者应用农杆菌感染枳壳、丹参、桔梗、甘草等药用植物的研究也取得了一定的进展,其中已得到部分植物的合理转化体系。

目前我国将转基因技术应用于药用植物主要在改进植物品质及适应性、抗虫和抗病毒、抗除草剂、生产药用有效成分等几个方面开展工作,其中某些领域已取得明显进展。

目前,转基因药用植物器官和组织的研究文献报道较多,已有青蒿、黄芪、丹参、红豆杉、决明、大黄、栝楼等10多种药用植物转化的器官———发状根诱导成功,并建立起了它们的培养系统。

对青蒿、黄芪、丹参的发状根培养研究已经相当深入,进入了大规模培养的水平,不仅进行了有效成分的研究,而且部分还进行了药理作用试验。

对青蒿的研究还克隆出了有效成分生物合成途径中的关键酶基因。

2.2DNA分子标记技术在药用植物研究上的应用

分子标记技术作为现代分子生物学的重要组成部分,从广义上讲也属生物技术范畴。

DNA药分子标记技术在药用植物研究上的应用主要有以下三方面内容。

2.2.1药用植物生物多样性保护与可持续利用研究

我国是世界上药用植物资源最丰富的国家之一,随着生态环境的破坏,珍稀濒危植物不断增加,加之药用植物需求量的增大,资源问题将更加突出。

因而,对药用植的多样性的保护受到国内外普遍关注。

保护药用植物生物多样性,应围绕挽救、研究及合理利用三个环节。

在传统药用植物资源研究与保护方法基础上,运用分子标记技术结合计算机手段,从本质上揭示物种遗传变异及其演化规律,建立重要药用植物基因库,研究在自然或人工控制下个体更新速度及规律。

从而制定相应的管理措施,实现药用植物资源研究与袋子保护的科学化、现代化、促进资源的可持续利用。

2.2.2中药材的鉴定及道地性研究

中草药的基原鉴定是中草药研究工作的基础和关键,但目前在品种研究中主要还是应用形态、细胞组织、化学成分等特征,这些特征在受遗传因素影响的同时,还受外界因素和生物体发育阶段及器官组织差异的影响。

中药材多为干品,许多活性成分（酶、蛋白质等）失活或损失,给传统鉴定方法带来困难。

由于PCR技术能将原来痕量的DNA扩增到足以进行分析与检测的数量,而且具产物专一性强,不需特殊纯化等优点,使DNA分子标记方法特别适于目前生药学方法难以鉴定的一些多来源中药材,贵重药材及其伪品等。

如RAPD技术已成功用于人参、西洋参、山麦冬、地胆草等的鉴定。

通过道地药材与非道地药材的比较究,明确同种药材优质品种及其最佳生长条件。

众多实验已阐明,同种药材不同产地,质量可能差异很大。

其本质是其物质基础——化学成分的种类或含量的差异。

化学成分的差异可能是由遗传因子产生的,也可能是地理-生态因子（生境）形成的,还可能由其它因素如传媒等产生,各种因素对道地药材形成的作用是不一致的。

因而应用分子标记技术对常用的、著名的药材与非道地药材进行系统比较研究,明确同一药材的优质物种及其最佳生长条件,可为中药材的栽培提供科学依据。

2.2.3药用植物亲缘关系和分类学研究

目前药用植物亲缘关系研究中,主要应用形态、细胞组织、化学成分等特征。

这些特征在受遗传因素影响的同时,还受环境因素的影响,具有一定的局限性。

同时,随着药用植物资源及分类鉴定研究的不断深入,新种不断发现,应用经典的形态分类方法,常有异义,分类地位经常变动,给正本清源及一系列的研究带来困难。

DNA分子作为遗传信息的直接载体,不受外界因素和生物体发育阶段和器官组织差异的影响,每一个体的任一体细胞均含有相同的遗传信息,通过选择合适的DNA分子标记方法,可准确鉴定物种及品种间的遗传差异,从而揭示物种的亲缘关系,为物种鉴定及这研究提供依据。

2.3离子束在药用植物研究的作用

离子束生物技术育种是一项新型的育种技术，其主要原理是在真空条件下，通过离子注入机高压电离气体或金属物质，产生等离体，注入植物材料，通过注入离子的能量传递、电荷传递、质量沉积等多种效应，引起植物体内某些物质或染色体等发生变化，再通过人工选育的方法得到新品种。

20世纪80年代中期,中国科学院等离子体研究所余增亮研究员等率先将离子注入技术用于农作物品种改良,于1986年首次发现离子注入水稻生物学效应,并在几个水稻品种离子注入诱变上,获得损伤低、突变率高、突变谱广的统计结果。

1988年,余增亮研究员首次提出注入离子与生物体相互作用原初过程的三因子效应,即能量沉积效应、质量沉积效应和电荷交换效应,为离子束生物技术的机制,尤其是原初物理过程的研究奠定了基础。

1996年7月,余增亮研究员的专著《离子束生物技术引论》问世,标志低能离子生物学作

为一门新型交叉学科正式建立起来了。

目前，已有少数单位正在用离子束生物技术对药用植物育种工作展开研究，并已取得了明显的成效。

如安徽农业大学的彭镇华等以低能N+离子的不同剂量注入银杏胚部，引起酯酶同工酶和过氧化物同工酶在数量、种类和活性上的变化;酶谱的变化与注入剂量有关，但不显著;生理变异可通过无性繁殖遗传;突变致死剂量效应呈非指数变化。

胡蕙露等人以30keV的N+对剥去胚部中种皮的银杏种子进行处理，试验结果表明，N+的注入引起了银杏种子M1代染色体的畸变，其频率和类型随着剂量的增加而增加。

新疆大学离子束生物工程实验室对低能离子注入麻黄种子生物效应进行了初步研究，结果表明:

离子注入对麻黄种子的生长起良好的生物效应。

内蒙古大学内蒙古自治区离子束生物工程重点实验室正开展以药用植物为对象，用离子束生物技术进行品种改良的系列研究。

采用低能离子注入麻黄种子后，再使用矽力康复合肥进行理化复合处理，可使麻黄种子的盆栽出土率由14.7%提高到86.7%。

潘燕等以N+注入甘草幼苗后，其SOD

和CAT酶活性都高于对照，有助于提高甘草幼苗的抗旱性能，SOD同工酶结果也证明，离子注入对干旱胁迫下同工酶谱带有所影响。

李晓瑾等人的研究则表明，离子注入对不同生命活力的甘草种子产生的生

物效应不同。

余增亮等在研究低能离子束与细胞表面相互作用的过程中，发现离子束对细胞壁的刻蚀作用，提出了离子束介导转基因的构想。

目前，离子束介导转基因已发展成为一种新型的转基因手段，在介导目的基因和基因组尤其是外源DNA大分子的转移上取得了极大的成功。

利用低能离子束的介导作用，将有助于药用植物目的基因的遗传转化，提高药用成分的含量或改良药用植物的品质。

内蒙古大学离子束生物工程自治区重点实验室目前正针对药用植物黄芪开展

这几方面的研究工作。

另外，离子束生物技术在药用植物多倍体育种中也有广泛的应用前景。

药用植物多倍体一个最显著的特征是器官的巨型性，具体表现为生物产量提高、抗逆性增强和药用活性成分提高3个方面。

利用低能离子束注入与秋水仙素联用的途径诱导药用植物多倍体，从而提高药用植物多倍体的诱导率，可以在其多倍体后代群体中可以筛选出药用成分更高，产量更大，抗性更强的多倍体，还可以将后代多倍体的目的基因进行遗传转化，进而提高药用植物的品质。

3药用植物次生代谢产物的研究

3.1利用植物组织、细胞培养生产次生代谢产物

通过筛选高产细胞系、改进培养条件和技术以及设计适合植物细胞培养的发酵罐,人们已对包括紫草、长春花、毛地黄、黄连等在内的多种药用植物细胞进行大规模生产实验,有的已成商品投入市场。

为了加速植物细胞培养技术商业化生产进程,各国科学家们一方面不断改进培养技术,如控制培养的气相环境,加入刺激剂,加入大孔树脂吸附剂等;一方面发展新的培养方法,如高密度培养、连续培养和固定化培养等,以期得到一种适合于植物细胞工业生产的培养方法。

随着研究的不断发展,植物细胞大规模培养成为一种成熟的工业化生产方式已经为期不远了。

同时,代谢产物生物合成的基础研究越来越受到重视,特别是有关酶的确定和分离,不仅为控制代谢途径提供了科学依据,而且为利用基因工程手段操纵代谢途径打下了重要基础。

目前用于以次生代谢产物生产为目的的组织培养和细胞培养的药用植物已有许多种。

从细胞培养物中分离得到的有用物质有:

酶类（α-淀粉酶、淀粉酶、蛋白水解酶、过氧化氢酶、酸性磷酸化酶、β-糖苷酶、IAA氧化酶、细胞色素氧化酶等）;生物碱（茛菪生物碱、利血平、吲哚生物碱、麦角碱等）;甾体（地奥甙元、山萆皂甙元、育努皂甙元等）;萜类（角鲨烯、羊毛甾醇、环阿屯醇、人参三醇、人参二醇、油烷酸、人参甙等）;色素等。

1964年,罗士韦等首先成功地进行了人参的组织培养,随后我国和其他国家的一些学者将人参的组织培养过渡到工业化生产。

目前我国学者已经建立了长春花、人参、丹参、三七、三尖杉、忍冬、红花、黄连、西洋参等几十种药用植物的液体培养系统,并实现了人参的10L体积的大规模

培养。

3.2发状根培养生产次生代谢产物

由发根农杆菌及其Ri质粒转化产生的发状根比较容易再生出新植株,而且很多植物的发状根在离体培养条件下都表现出原植株次生代谢产物的合成能力,因此,发状根培养又被称为转基因器官培养,是一条利用生物技术生产次生代谢产物的新的有效途径,很适用于有价值的次生代谢产物的生产。

目前国内学者将发根培养技术应用于药用植物方面的研究,先后成功地对绞股蓝、甘草、丹参等24种药用植物进行发状根诱导,应用到的菌株有R1600、ATCC15834、LBA9402、TR105、R1000和Rri2659

等,得到的次生代谢产物有生物碱类（莨菪生物碱、吲哚类生物碱、喹啉类生物碱等）、苷类（人参皂苷、甜菜苷等）、黄酮类、醌类（紫草宁等）以及蛋白质（天花粉蛋白等）。

毛状根生长迅速,遗传性稳定和生化特性不易改变的特点,越来越受到人们的重视。

这一培养系统对传统药材来讲更为重要。

因为约三分之一的传统药材是植物的根部。

目前已在长春花、烟草、紫草、人参、曼陀罗、颠茄、丹参、黄花、甘草和青蒿等四十多种植物中建立了毛状根培养系统。

大规模培养使用的发酵罐有多种类型,其中以气升式效果为佳。

在提高毛状根中次生物质数量的研究中,发展了培养基连续流动、双液相发酵等新的培养技术;利用大孔树脂做为吸附剂的培养方法也有报道。

4小结

生物技术在中药现代化中有广阔的应用前景,其中细胞培养工程技术已在中药材的保存与育种、有效成分的发酵、分子标记在药材的质量甄别中得到应用。

在中药作用机制的研究上,已经采用生物化学、生理学和分子生物学技术、检测了中药作用的个别基因或蛋白质的变化。

中药应该与生物技术密切结合,使生物技术成为中药研发的必备工具,可以预见,随着生物技术在中药现代化中广泛应用和深入研究,可望为现代中药研究提供良好的手段和方法。

然而目前国际上药用植物的研究主要集中在药用次生代谢产物的大规模工业化生产、利用转基因植物生产药物、中药材的分子生物学鉴定等领域。

如国外已有几十种药用蛋白质或多肽在植物中得到成功

表达,其中包括人的细胞因子、表皮生长因子、促红细胞生成素、干扰素、生长激素、单克隆抗体和可作为疫苗的抗原蛋白等,其中有些药物已实现商业化生产。

虽然我国药用植物的研究已取得了相当大

的进步,但与国外先进水平相比还有一定的差距,还有待更深入的研究。

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