白藜芦醇对亚硝酸盐的清除与亚硝胺阻断作用研究.docx

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白藜芦醇对亚硝酸盐的清除与亚硝胺阻断作用研究

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白藜芦醇对亚硝酸盐的清除及亚硝胺阻断作用研究

药物制剂：

玉锋

指导老师：

孝林

摘要：

目的：

以亚硝酸盐的清除率和亚硝胺合成的阻断率为指标，研究不同浓度的白藜芦醇在酸性下对亚硝酸盐的清除和对亚硝胺合成的阻断作用。

方法：

分别配制0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.8mg/mL、0.16mg/mL、0.32mg/mL和0.64mg/mL浓度的白藜芦醇溶液和5ug/mL亚硝酸钠溶液,在pH=3模拟胃酸条件下,采用分光光度法，分别测定不同浓度的白藜芦醇对亚硝酸钠的清除率及亚硝胺生成的阻断率[1]。

结果：

在酸性条件下，不同浓度的白藜芦醇对亚硝酸钠均有较强清除作用，在浓度小于0.32mg/mL时随着浓度增大而增大，最大达到63.48%。

同时对亚硝胺的生成有较强的阻断率，最大达到40.94%。

结论：

白藜芦醇对亚硝酸盐有很强的清除能力，对亚硝胺的生成有较强的阻断能力。

关键词：

亚硝酸盐，白藜芦醇，分光光度法，亚硝胺，清除，阻断

前言

癌症是当前威胁人类生活的最大杀手,根据世界卫生组织统计,全世界每年约有500万左右的人被癌症夺去生命。

在致癌物中,亚硝胺是最令人关注的一类化学致癌物质。

亚硝酸盐作为一种发色剂和防腐剂[2]，在肉制品加工中得到了普遍的应用[3]。

许多蔬菜中天然含有的硝酸盐，在人体通过细菌的作用也可被还原为亚硝酸盐。

亚硝酸盐是合成亚硝胺的前体之一[4]，人体的这些亚硝酸盐在一定条件下可以与食物中的仲胺、叔胺等形成亚硝胺。

N-亚硝基化合物是一种致癌性很强的化合物[5]，已研究的近300种N-亚硝基化合物中，约90%以上具有动物致癌性，并证明N-亚硝基化合物可在体外由前体物胺类与硝酸盐或亚硝酸盐形成[6]。

在体代过程中，特别是在胃液中容易形成亚硝胺[7]。

因此，降低胃的亚硝酸盐含量及阻断亚硝胺前提的合成[7]从而达到防癌抗癌的目的是人类同癌症斗争的有效途径之一，而白藜芦醇在这方面的研究鲜见报道。

白藜芦醇（resveratrol，简称Res）是非黄酮类的多酚化合物，日本人Tokaoka1940年首次从毛叶藜芦的根部分离得到。

1963年Nonomura等提出白藜芦醇是某些草药治疗炎症、脂类代紊乱和心脏疾病等的有效成分，是存在于植物中的天然抗氧化剂，如葡萄、虎杖等[8]被列为抗心血管、抗癌最有前景的药物之一。

白藜芦醇具有优良的药理活性和保健功能，其市场需求很大且与日剧增。

目前，已有大部分国家和地区都开发了白藜芦醇的相关保健品和其他产品。

中国已将含白藜芦醇的植物提取物制成降脂美容的天然保健食品，美国也已把白藜芦醇作为膳食补充剂，日本已将从植物提取的白藜芦醇作为食品添加剂[9]。

白藜芦醇的药理功能引起了人们的广泛兴趣，因为它涉及到与人体健康密切相关的许多生理疾病，例如，动脉粥样化、老年痴呆症、病毒性肝炎、胃溃疡、炎症与过敏反应等。

随着人们对白藜芦醇的深入研究，已经显示白藜芦醇具有抗癌、抗氧化、抗菌、抗炎以及预防食物过敏等作用，可广泛地应用于医药、保健品、食品、化妆品等领域。

所以，对白藜芦醇的研究及开发，特别是白藜芦醇对亚硝酸盐的清除及阻断作用具有良好的市场前景及重要的意义。

1试剂和仪器

1.1试剂

白藜芦醇（纯度99%，购于西慈生物技术）、蒸馏水、二乙胺盐酸盐、二水合柠檬酸三钠、十二水合磷酸氢二钠、二甲胺盐酸盐、磷酸二氢钠（均为AR，购于国药集团化学试剂）、亚硝酸钠（AR，淮化试剂厂）、无水对氨基苯磺酸（AR，山浦化工）、95%乙醇、氢氧化钠、盐酸（均为AR，工业大学化学试剂厂）

1.2仪器

紫外可见分光光度计UV-5500PC型（元析仪器）、电子分析天平（精密科学仪器）、恒温水浴锅（省金坛市荣华仪器制造）、超净工作台（净）

2原理

2.1亚硝酸钠的清除率的测定[10]

亚硝酸钠在弱酸性的条件下,能与氨基苯磺酸重氮化后,再与N-1-萘乙二胺盐酸盐偶合生成红色的化合物，本实验通过测定相同条件下亚硝酸钠含量的变化来反映白藜芦醇对亚硝酸根离子的清除能力，并计算清除率：

清除率=（A0-Ax）/A0×100%

A0—没有加入白藜芦醇的亚硝酸钠溶液空白实验的吸光度值；

Ax—加入不同浓度白藜芦醇溶液时的反应液的平均吸光度值。

温度为37℃在pH=3的条件下，当用相同量的亚硝酸钠溶液同具有一定浓度梯度的白藜芦醇溶液反应后，再测量吸光度。

吸光度越小，溶液中残存的亚硝酸钠含量就越小，表明白藜芦醇对亚硝酸盐的清除率越高；反之，表明白藜芦醇对亚硝酸盐的清除率越低。

2.2阻断亚硝胺合成的原理[11]

二甲胺与亚硝酸钠在37℃条件下,可适宜地生成二甲基亚硝胺,反应式如下:

（CH3）2NH+NaNO2HCl（CH3）2NH·NO+NaCl+H2O

其实质为:

（CH3）2NH+HONO（CH3）2NH·NO+H2O

当往白藜芦醇溶液中依次加入二甲胺与亚硝酸钠时,白藜芦醇优先同亚硝酸钠作用,使得二甲胺不能与亚硝酸钠反应,达到阻止二甲基亚硝胺生成的目的。

据此可以比较相同条件下生成二甲基亚硝胺量的多少来反映白藜芦醇阻断能力的强弱,生成二甲基亚硝胺量少,白藜芦醇的阻断能力就强,反之则弱。

在紫外光照射下,二甲基亚硝胺可分解成二甲基仲胺和亚硝酸根,反应式如下:

H2O+（CH3）2N-N=O紫外光（CH3）2NH2++NO2-

亚硝酸根与对氨基苯磺酸重氮化后,再与1-萘胺偶合生成红色化合物。

用紫外分光光度计测出该红色化合物的吸光度值可反映出溶液中亚硝酸根离子的含量，亚硝酸根离子的含量可反映出原来溶液中二甲基亚硝胺含量的多少。

3方法

3.1溶液的配制

3.1.10.4%对氨基苯磺酸溶液的配制：

用分析天平精确称取对氨基苯磺酸0.4g充分溶解后，定容至100mL。

3.1.20.2%盐酸萘乙二胺溶液的配制：

精确称取盐酸萘乙二胺0.2g充分溶解后，定容至100mL。

3.1.30.1%1-萘胺溶液的配制：

精确称取1-萘胺0.1g充分溶解后，定容至100mL。

3.1.4浓度为1mmol/L的二甲胺盐酸盐溶液的配制：

精确称取二甲胺盐酸盐0.08541g充分溶解后，定容至100mL。

3.1.5浓度为1mmol/L的亚硝酸钠溶液的配制：

精确称取亚硝酸钠0.069g充分溶解后，定容至1000mL。

3.1.6不同浓度的白藜芦醇溶液的配制：

精确称取64mg白藜芦醇，置于烧杯中，加适量95%乙醇溶解，用蒸馏水定容于100mL容量瓶中，配制成0.64mg/mL的白藜芦醇溶液并标记为7号容量瓶，再分别稀释配制成0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.04mg/mL、0.08mg/mL、0.16mg/mL和0.32mg/mL白藜芦醇溶液，分别标记为1,2,3,4,5,6号容量瓶，避光保存，备用。

3.2NaNO2标准液的制备及吸光度的测定[12]

NaNO2标准液制备:

用天平精确称取亚硝酸钠20mg，充分溶解后，定容至1L即得20mg/L的NaNO2溶液。

然后准确取20mg/L的NaNO2溶液250mL于一1L的容量瓶中并用蒸馏水稀释、定容至刻度，摇匀后得到浓度为5ug/mL的NaNO2标准液。

NaNO2标准曲线的绘制:

分别准确吸取浓度为5ug/mL的NaNO2标准液0mL,0.2mL,0.4mL,0.6mL,0.8mL,1.0mL,1.5mL,2.0mL置于10mL具塞试管中，并分别编号为0，1，2，3，4，5，6，7号试管。

然后分别向各试管中加入0.4%对氮基苯磺酸1mL，摇匀，静置3—5min，再加入0.2%的盐酸萘乙二胺溶液0.5mL,用水稀释至刻度，摇匀得到浓度分别为0ug/mL，0.1ug/mL，0.2ug/mL,0.3ug/mL,0.4ug/mL,0.5ug/mL,0.75ug/mL,1.0ug/mL的NaNO2溶液，将所得到的溶液静置15min后，亚硝酸根离子在538nm下存在最大吸收峰，因此，本实验在538nm下测定其吸光度的值，绘制NaNO2标准曲线。

3.3不同浓度的白藜芦醇溶液在pH=3时对亚硝酸钠的清除率的测定[13]

取8个10mL具塞试管，分别标记为0，1，2，3，4，5，6，7号试管，依次向各试管中加入5ug/mL的NaNO2的溶液1mL。

然后分别取0，1，2，3，4，5，6，7号100mL容量瓶中的白藜芦醇溶液分别依次向0，1，2，3，4，5，6，7号具塞试管中顺序加入1mL,并依次向各试管中分别加入1mLpH=3.0的柠檬酸钠-盐酸缓冲液[14],之后将8个试管置于37℃恒温水浴槽中反应1小时。

反应结束后，取出试管后立即分别向8个试管中加入质量分数为0.4%的对氨基苯磺酸溶液各1mL,摇匀静置3至5分钟后，再向各试管加入质量分数为0.2%盐酸萘乙二胺溶液各1mL,摇匀放置15min后,用分光光度计在538nm处分别测出0，1，2，3，4，5，7号试管反应液吸光度值（A）,其中以加入除白藜芦醇溶液和亚硝酸钠溶液外其他所有等量的其他试剂的溶液作为参比溶液，每个浓度配制3个样品测量吸光度求平均值。

根据下列公式求得白藜芦醇对亚硝酸根离子的清除率：

清除率=（A0-Ax）/A0×100%

A0—没有加入白藜芦醇溶液的试管中NaNO2的吸光度值，即0号试管的吸光度值；

Ax—加入不同浓度白藜芦醇溶液反应后试管中NaNO2的吸光度值。

3.4不同浓度的白藜芦醇溶液在pH=3时对亚硝胺合成的阻断率测定[11]

取8个10mL具塞试管，分别标记为0，1，2，3，4，5，6，7号试管。

分别取0，1，2，3，4，5，6，7号100mL容量瓶中的白藜芦醇溶液分别依次向0，1，2，3，4，5，6，7号具塞试管中顺序加入0.5mL,然后再依次向各试管中分别加入1mLpH=3.0的柠檬酸钠-盐酸缓冲液,然后依次向各试管加入1mmol/mL的NaNO2的溶液1mL,再向各试管加入1mmol/mL的二甲胺溶液1mL。

用蒸馏水将各试管定容刻度为8mL，将各试管置于37℃恒温水浴槽中反应1小时。

反应结束后，置于紫外分析仪上照15min,取出后加1%的对氨基苯磺酸溶液1mL,再加0.1%的1-萘胺1mL,然后摇匀放置15min后,用分光光度计在525nm处测吸光度值（A）,其中以加入除白藜芦醇溶液和亚硝酸钠溶液外其他所有试剂的溶液为参比溶液，每个浓度配制3个样品测量吸光度求平均值。

根据下列公式求得白藜芦醇对亚硝胺合成的阻断率：

阻断率=（A0-Ax）/A0×100%

A0—没有加白藜芦醇溶液试管中NaNO2的吸光度值，即0号试管的吸光度值；

Ax—加入不同浓度的白藜芦醇溶液后试管中NaNO2的吸光度值。

4结果及分析

4.1NaNO2溶液的标准曲线的绘制：

NaNO2标准液在538nm下测定其吸光度的值如表1所示,标准曲线如图1所示。

从标准曲线可NaNO2知在浓度0.1-1ug/mL存在很好的线性关系，随着亚硝酸根离子浓度的增大吸光度增大。

表1NaNO2标准液的吸光度

Table1TheabsorbanceofstandardsolutionofNaNO2

序号

1

2

3

4

5

6

7

浓度（ug/mL）

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.75

1

吸光度A

0.004

0.007

0.011

0.014

0.017

0.025

0.034

图1NaNO2标准曲线

Figure1ThestandardcurveofNaNO2

4.2不同浓度的白藜芦醇在pH=3时对亚硝酸钠的清除率及对亚硝胺的阻断率

从表2和图2可知，白藜芦醇浓度在0.01-0.32mg/mL时，对亚硝酸根离子的清除率随着浓度的增大而增大，对亚硝酸根离子的清除率最大达到63.48%。

随后对亚硝酸根离子的清除率并不再继续随着浓度的增大显著增加。

表2pH=3时不同浓度白藜芦醇对亚硝酸钠的清除率

Table2TherateofresveratrolatdifferentconcentrationsclearingsodiumnitrateunderPH=3

序号

0

1

2

3

4

5

6

7

白藜芦醇浓度（mg/mL）

0

0.01

0.02

0.04

0.08

0.16

0.32

0.64

清除率（%）

0.00

18.44

28.72

34.75

39.01

43.43

63.48

63.49

图2pH=3时不同浓度白藜芦醇对亚硝酸钠的清除率

Figure2TheclearingrateofNaNO2onresveratrolwithdifferentconcentrationsatPH=3

从表3和图3可知，白藜芦醇浓度在0.01-0.32mg/mL时，对亚硝胺的阻断率随着浓度的增大而增大，对亚硝胺的阻断率最大达到40.94%。

随后对亚硝胺的阻断率并不再继续随着浓度的增大显著增加。

表3pH=3时不同浓度白藜芦醇对亚硝胺的阻断率

Table3TheblockingofnitrosamineonresveratrolwithdifferentconcentrationsatPH=3

序号

0

1

2

3

4

5

6

7

白藜芦醇浓度

（mg/mL）

0

0.01

0.02

0.04

0.08

0.16

0.32

0.64

阻断率（%）

0.00

8.39

12.75

17.11

24.16

31.21

40.94

40.96

图3pH=3不同浓度白藜芦醇对亚硝胺的阻断率

Figure3TherateofresveratrolatdifferentconcentrationsblockingnitrosaminesunderPH=3

5讨论及结论

当溶液环境为酸性条件时相当于胃液环境条件下，随着白藜芦醇浓度的增大，白藜芦醇对亚硝酸盐的清除能力不断增强，当白藜芦醇浓度大约在0.32mg/mL时有着63.48%的最大清除率；但是当白藜芦醇浓度增大到一定程度后，白藜芦醇对亚硝酸钠的清除能力不再随着白藜芦醇浓度的增大而显著增加，而是达到一个稳定的清除率水平。

不同浓度的白藜芦醇溶液对亚硝胺的生成有一定的阻断作用，白藜芦醇浓度约在0.32mg/mL时有着40.94%的最大阻断率；但是当白藜芦醇浓度增大到一定程度后，白藜芦醇对亚硝胺的阻断能力也不再随着白藜芦醇浓度的增大而显著增加，而是达到一个稳定的阻断率水平。

结果表明，白藜芦醇对人体中的亚硝酸盐有着良好的清除及阻断作用。

人们应充分认识到白藜芦醇在日常生活中的重要作用，进而为有关白藜芦醇的药品、保健食品的开发和推广提供保障。

致

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参考文献

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[14]勃拉特AH.有机合成（第二集）（中译本）[M].科学,1964,321.

The study of  resveratrol's ability on  clearing sodium nitrate andblocking nitrosamine

YufengLiu,XiaolinZhang

SchoolofFoodandDrug,AnhuiScienceandTechnologyUniversity,Fengyang233100,Anhui,China

Abstract:

Objective:

It is the indicator to study the different concentrations of resveratrol in the acidic environment and alkaline environment , clearing nitrite and blocking nitrosamine,which includes the clearing rate of nitrite and theblocking rate of nitrosamine.Methods:

Preparingconcentrationsofresveratolsolutiondifferently,whichisat0.1mg/mL,0.2mg/mL,0.4mg/mL,0.8mg/mL,0.16mg/mL,0.32mg/mLand0.64mg/mLandtheconcentrationofsodiumnitratesolution,whichisat5ug/mL,simulatinggastricconditionsunderPH=3,differentconcentrationsofresveratrol’sclearingrateofnitriteandblockingrate[1]ofnirosaminearemeasuredbyspectrophotometryrespectively.Results:

Underacidicconditions,differentconcentrationsofresveratrolallhavestrongscavengingeffectonsodiumnitrateatconcentrationslessthan0.32mg/mL,whichisincreasedastheconcentrationincreases,andupto63.48%.Meanwhile,therateofblockingtheformationofnitrosamineishigh,andupto4.94%.Conclusion:

Resveratrolhaveastrongabilitytoclearsodiumnitrateandblocktheformationofnitrosamine.

Keywords:

nitrite,resveratrol,spectrophotometry,nitrosamines,clear,blocking