用荧光光谱法研究山梨酸钾与BSA的结合反应荧光特性.docx

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用荧光光谱法研究山梨酸钾与BSA的结合反应荧光特性

1引言

在生命体内，各类小分子（含中性分子和离子）物质的生物活性功能都是通过他们与生物大分子相互作用而展现的，因此，小分子与生物大分子相互作用是研究所有生命过程经常涉及的基本问题之一。

小分子与生物大分子（核酸、蛋白质、多肽等）之间非共价键的相互作用研究已成为当前公认的化学理论与应用技术的前沿课题，对其本质的研究有助于理解在生命科学、医学、药学领域中涉及到的分子之间的相互作用以及相互识别过程1L2|o

在生物体内，蛋白质是药物作用的主要靶向分子，药物与生物大分子作用的形式和结合位点影响到生物分子的生理和物理化学性质⑶。

蛋白质是生命的主要物质基础，是生命体内含量最丰富、功能最多的生物大分子，其功能对于很多生命现象都是重要的冋。

血清蛋白是血浆中含量最丰富的蛋口质，具有维持血浆胶体渗透压、增加血容量、调节血压以及运载功能和营养的作用，对维持正常生命活动发挥着重要作用⑸。

通过荧光发射峰、荧光强度、能量转移及荧光寿命等研究可以为蛋口质的结构及所处的微环境提供有用信息⑹。

血清蛋口能与许多内源及外源性化合物结合，是药物发挥药效的重要载体和靶点17】。

药物在进入循环系统后首先与血清蛋口结合，然后才能被运输至全身各部位发挥药效同。

在所有血清蛋白中，牛血清口蛋白（BovineSerumAlbumin,简称BSA）含有580个氨基酸残基单链多肽，具有与人血清口蛋口很类似的结构，许多水溶性差的物质包括胆红素、前列腺素、金属离子等都可以通过与牛血清口蛋白的结合而被运输。

牛血清口蛋白与某些有机小分子（如药物、染料等）相互作用后能够生成对其内源荧光具有猝灭效果的配合物。

因此，许多光谱法用其研究有机小分子对牛血清口蛋白的内源荧光猝灭现象获取蛋白质携带小分子后对其结构和构象的变化，以揭示小分子与牛血清白蛋白的作用机制冏。

有机小分子与生物大分子的相互作用远不仅限于二者之间，必然要受到其他共存金属离子的影响。

因此，研究金属离子存在下食品添加剂与血清口蛋白的相互作用具有重要的理论意义。

血清白蛋白含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基，具有荧光发射性质，因而具有内源荧光［⑼。

它能在340到350nm左右有荧光发射峰,并且能吸收270到300nm的紫外光，因此可以用蛋口质的荧光光谱和紫外吸收进行分析研究。

测定蛋白质含量的方法有很多，如浊度发、凯式定氮法、吸光光度法、荧光光度法、化学发光法、电化学法以及共振瑞利散射法等⑴】。

但是，蛋白质的分子巨大，结构复杂，使得蛋白质作用机理的研究及其应用受到限制。

为此，人们借助于能与蛋白质发生作用的小分子作

为探针来对蛋口质进行研究，如染料探针说⑶，二聚体探针||叫金属离子探针I⑸，其他探针等。

山梨酸钾||6'171（Potassiumsorbate,PSS）,结构式：

、、O'K+,化学名2,4-己二烯酸钾，分子式GH7O2K,分子量为150.22,别名E202、BB粉，俗称防腐剂。

它无色或口色至浅黃色鳞片状结晶、结晶状粉末或颗粒，无臭或稍有臭味。

在空气中不稳定，长时间放置时吸湿并氧化分解而着色，常温下密封保存不会分解。

山梨酸钾易溶于水,67.6g/100ml（20°C）；5%食盐水,47.5g/100ml（室温）;25%糖水，51g/100ml（室温）。

溶于丙二醇,5.8g/100ml；乙醇，0.3g/100ml。

1%山梨酸钾水溶液的PH7〜8。

山梨酸钾是肉制品中使用很广泛的一种化学防腐剂。

由于是一种不饱和脂肪酸，可以在体内参与新陈代谢最终被分解为二氧化碳和水，儿乎没有毒性。

山梨酸钾对霉菌、酵母菌及需氧菌有一定的抑制作用，而对革兰氏厌氧性芽抱菌儿乎没有抑制作用。

GB2760-1996食品添加剂使用及其标准中规定山梨酸钾可以在肉、鱼、蛋、禽类制品中使用。

2002年乂增补山梨酸钾在罐肠类肉制品中最大使用量为1.5g/kg,而火腿类产品继续执行最大使用量0.075g/kg的标准［阖。

铁在人体中的含量仅为0.004%,是构成血红蛋口、肌红蛋白、细胞色素和其他酶系统的重要成分。

还有少量以铁蛋白的形式贮存于肝脏、脾脏和骨髓的网状内皮系统。

铁还参与体内氮体交换和组织呼吸过程，参与脂类从血液中转运及药物在肝脏中的解毒。

它还能催化胡萝卜素转换为维生素A催化胶原蛋口的合成，催化抗体的产生，提高各种杀菌酶，吞噬细胞的活性，提高免疫力。

铝不是人体必须元素，摄入过量的铝，会对人体的骨骼、大脑造成损伤，妨碍人体的消化吸收功能，导致视觉、记忆、注意力下降。

辂是人体必须的微量元素，在酶的催化和加强糖代谢方面有重要的作用。

缺珞可使组织对胰岛素的敬感性降低，补充适量的有机锯的化合物可以达到降低血糖、改善糖耐量的訂的⑴。

本文用荧光光谱法在生理条件下研究了Fe3+,Al“，CF+存在下山梨酸钾（PSS）与牛血清白蛋白（BSA）的相互作用，获得了一些有价值的信息，为以后药物合成、临床用药提供了有益参考。

2实验部分

2.1仪器与试剂

CARYEclipse荧光分光光度汁（自带恒温装置）（美国VARIAN公司）

电子天平（瑞士普利赛斯XS系列原装天平）

PHS-2ST数显酸度计（上海天达仪器有限公司）

山梨酸钾（天津市博迪化工有限公司）：

称取一定质量的山梨酸钾用蒸镭水溶解定容，配成1.0xl0-3mol/L的储备液,使用时适当稀释。

牛血清白蛋白（BSA）（国药集团化学试剂有限公司）：

蒸镭水配制1.0xl0-4mol/L的储备溶液，使用时适当稀释。

FJ+（北京五七六0—部队化工厂）：

称取一定质量的Fe（NOs）3用蒸谓水溶解定容，配成1.0xl0-2mol/L的储备液，使用时适当稀释。

Al3+（北京化工厂）：

称取一定质量的A1（NOs）3用蒸镭水溶解定容，配成1.0xl0-2mol/L的储备液，使用时适当稀释。

Cr"（天津市天大化工实验厂）：

称取一定质量的Cr（NO3）3用蒸懈水溶解定容，配成1.0xl0-2mol/L的储备液，使用时适当稀释。

Britton-Robison缓冲溶液:

在100ml的三酸混合液（H3BO3,H3PO4,HAc,浓度均为0.04mol/L）中，加入相应体积的NaOH（0.2mol/L）,准确pH用pHS-2ST数显酸度计确定。

其余药品均为分析纯；实验用水为一次蒸憎水；所用的溶液均于4°C下保存。

2.2实验方法

2.2.1PSS-BSA-Fe3*,Al3+,Cr3+的荧光光谱

在10mL比色管中依次加入0.5mLBSA储备液，0.5mLlxl0-4mol/LFi+,Al",Cr3+储备液，不同量的PSS储备液，l.OmLpH二7.43的B-R缓冲溶液，然后定容至5ml,放置30min,在Aex=280nm,Aem=348nm处，1cm比色皿,激发和发射狭缝均为5nm,扫描PSS-BSA-Fe3+,Al*,Cr*体系的荧光光谱。

3结果与讨论

3.1Fe3+,Al",CN+存在下PSS-BSA的荧光猝灭光谱创

模拟生理环境，选用中性pH=7.43的条件，研究Fe*,Al”，Cr^存在下PSS与牛血清白蛋白的相互作用，固定BSA、Fe叭AP+、C严的浓度均为1.0xl0%ol/L,改变PSS的浓度，按实验方法测得Fe3+,Al3+,CF+存在时不同浓度的PSS与BSA荧光光谱如图1、2、3所示。

由图可见，Fe3+,Al",CF+存在下不同浓度的PSS与BSA的荧光猝灭的影响程度不同。

在Fi+,Al3+,CF+存在下PSS的猝灭光谱图中，BSA的峰形变化不大，发射峰的位置爲n没有显著移动。

表明PSS与BSA发生了相互作用。

X（nm）

图1.FU+存在下PSS对BSA的荧光猝灭光谱

Fig.1TheeffectofPSSonfluorescenceofBSAinthepresenceofFe3+

Cpss=0,2,4,6,&10,12,14,16.18（xlO-6mol/L）

[BSA]=1.0xl0-5mol/L[Fe3+]=1.0x10-5mol/L

X（nm）

图2.A13+存在下PSS对BSA的荧光猝灭光谱

Fig.2TheeffectofPSSonfluorescenceofBSAinthepresenceofAl"

Cpss=0,2.4,6,8.10,12,14,16」8（X1O^mol/L）

[BSA]=1.0X10'5mol/L[Al3+]=1.0X105mol/L

900

800

700

600

If500

400

300

200

100

图3.Cr3+存在下PSS对BSA的灵光猝灭光谱

Fig.3TheeffectofPSSonfluorescenceofBSAinthepresenceofCr3*

Cpss=0,2,46&10,12,14.16」8（X10恤01几）

[BSA]=1.0X10-5mol/L[Cr3+]=1.0X10-5moI/L

3.2Fe3+,Al",6"存在下BSA的荧光猝灭机理及猝灭常数的测定囚创

3.2.1荧光猝灭方程

蛋口质的基本组成单位为氨基酸，构成天然。

蛋口质的氨基酸共约20种。

除脯氨酸外，均为ci-氨基酸，即竣酸分子中碳原子上的一个氢原子被氨基取代而成的化合物。

各种蛋口质所含的氨基酸的数LI和种类都各不相同。

每一种天然的蛋口质都有自己特有的空间结构，而这种空间结构通常称为蛋口质的构象。

为了表示蛋口质结构的不同组织层次，科学家们采用了专门的术语：

一级结构指组成蛋白质分子的氨基酸的排列顺序。

二级结构即多肽链的局部在一维空间上的排布（构象）关系，其中最常见的类型是螺旋和卩-折叠片。

三级结构指多肽链借助各种次级键（非共价键）盘绕成具有特定肽链走向的紧密球状构象。

如果蛋白质山一条以上多肽链构成，称为四级结构，它涉及多肽亚基的空间排布和它们之间相互作用的性质。

蛋口质分子中因为含有色氨酸、酪氨酸等氨基酸残基而产生较强的荧光。

蛋口质等荧光体与其它物质相互作用而导致荧光体荧光强度降低的现象称为荧光猝灭作用，能猝灭荧光体荧光强度的物质称为荧光猝灭剂。

一些金属离子及其配合物、有机小分子化合物（如天然药物或者合成药物）等都是荧光猝灭剂，当它们在溶液中与蛋口质作用时，能不同程度地降低蛋口质的荧光强度。

荧光猝灭作用通常分为动态猝灭作用和静态猝灭作用两类，并可以分别用动态猝灭常数Ksv（即Stern-Volmer猝灭常数）和静态猝灭结合常数Klb来描述荧光体分子与猝灭剂分子之间相互作用的程度和作用机制。

是动态猝灭还是静态猝灭作用，可根据结合常数Ksv和Klb随温度的变化关系加以判断。

对于动态猝灭作用，温度升高将有利于荧光体和荧光猝灭剂分子之间的有效碰撞，并可以促进电子的转移过程，Ksv随温度的升高而增大；若是静态猝灭，温度升高，产物的稳定性降低，静态猝灭常数Klb减小。

在动态猝灭过程中，一般情况下各类猝灭剂对生物大分子荧光寿命衰减速率影响的Kq值不会大于2.Ox1O10Lmol'-S-1。

动态猝灭是一种能量转移或电子转移的过程，不影响蛋口质的结构和生理活性。

静态猝灭是由于发生了配合反应，通常是产生了不发荧光的配合物，对蛋口质的二级结构可产生影响，并可能影响其生理活性。

对于动态猝灭，由于与分子扩散有关，随着温度的升高，将增加离子有效碰撞的数II，加剧能量的转移，使荧光物质的猝灭常数随温度升高而增大，若是静态猝灭，温度升高则降低形成配合物的稳定性，使猝灭常数减小。

对于动态猝灭符合Stern-Volmer碰撞猝灭理论：

F（）/F=l+Ksv[Q]=l+Kqm[Q]

（1）

其中F。

为猝灭剂不存在时的荧光强度，F为加入猝灭剂后的荧光强度。

Kq为扩散速率常数。

“为荧光体分子的平均寿命，约为10旳2叫[Q]为猝灭剂的浓度，KSv=Kqio是Stern-Volmer猝灭常数。

按Stern-Volmer方程作图如得一直线，表明只存在一类结合部位，并且对于猝灭体都是可接近的。

需要指出Stern-Volmer方程作图是直线并不一定就是发生了碰撞猝灭，因为对于荧光物质与猝灭剂之间形成1:

1配合物的情况下，静态猝灭也符合上述Stern-Volmer猝灭方程。

即：

F（/F=l+Ka[Q]

（2）

对于静态猝灭，猝灭常数Ka为给体-受体（猝灭体-荧光体）的形成常数。

山式

（2）作图得一直线，可求得该反应的形成常数Ka。

显然对应于动态猝灭式

（1）中的猝灭常数Ksvo

另外将

（2）式变形静态猝灭还可以用Lineweaver-Burk双倒数方程：

1/（Fo-F）=1/F0+Kd/（Fo[Q]）（3）

式中解离常数Kd=1/Ka111（3）式中的1/（FO-F）对[Q]“作双倒数曲线，即可求得解离常数心。

3.2.2荧光猝灭机理及猝灭常数的确定

为阐明PSS对BSA的内源荧光的猝灭机理，分别测定不同温度下的PSS和BSA作用的荧光猝灭光谱，以式

（1）中的（Fo/F）~[Q]作Stern-Volmer曲线，图4、5、6所示。

以式（3）的1/（Fo-F）对[Q]」作Lineweaver-Burk双倒数曲线，图7、8、9所

示。

其线性回归方程、猝灭常数Ksv、解离常数Kd及相关系数r如表1、表2和表3所示。

从图4、5、6的PSS与BSA的Stern-Volmer曲线可以看出，呈现良好的线性关系。

据此可以判断PSS与BSA只存在一类结合部位，并且猝灭体都是可接近的，随着PSS的加入，可使BSA的荧光均匀的猝灭。

从图7、8、9的双倒数曲线可见也呈现良好的线性关系。

Cpss（X10'6mol/L）

图4Fc3+存在下PSS对BSA不同温度下的Stem-Volmer曲线

Fig.4Stem-VolmercurvesofBSAandPSSatdifferenttemperatureinthepresenceof

CpSS（X106mol/L）

图5Al%存在下PSS对BSA不同温度下的Stem-Volmer曲线

Fig.5Stem-VolmercurvesofBSAandPSSatdifferenttemperatureinthepresenceofAl3+

05101520

Cpss（XI0'6mol/L）

图6C"存在下PSS对BSA不同温度下的Stem-Volmer曲线

Fig.6Stem-VolmercurvesofBSAandPSSatdifferenttemperatureinthepresenceofCr5+

表1Stem-Volmer线性方程及相关系数

Tabic1StcmMlmcrequationandcorrelationcoefficient

体系

温度

t/r

回归方程