健康食品之延缓衰老功能评价方法草案.docx

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健康食品之延缓衰老功能评价方法草案

健康食品延緩衰老功能評估方法修正草案

壹、前言

老化是許多分子、細胞及系統方面的一種效應改變。

分子與細胞的老化是基因（內在）與環境（外在，如熱、冷、疾病、營養素缺乏等因素）所造成。

而系統的老化是器官某部分的變化，最常見的是皮膚上的變化，例如變硬、變粗及生皺等。

所以老化細分為功能上（function）、行為上（behavior）及外表上（performance）上的變化。

老化現象是一種普遍性（universal）、進行性（progressive）、累積性（cumulative）及傷害性（deleterious）之內外因素所引發之生理衰退。

由於生物個體間、不同人生階段或時期之老化步伐及表現不一，所以無法以單一或簡單的模式來加以描述。

也因為如此，隨年齡的增加，族群間之歧異（diversity/heterogeneity）也加大，增加很多複雜性。

隨著年齡造成的生理功能衰退，有兩種情形，一為純粹與年齡增長有關之功能衰退（age-relatedphysiologicdeterioration），另一為出現伴隨年齡增長之疾病（age-associateddisease），但兩者往往共同存在。

一、老化的機制：

老化學說大致上可分為兩類：

基因預設（geneticprogram）與隨機破壞（stochastic）。

前類學說認為預設的基因結構或基因表現的改變導致老化；另一類則將老化歸因於體內大分子物質像核酸、蛋白質隨時間所累積的隨機破壞超過體內的修復能力，這些隨機破壞可以來自自由基（freeradicals）、氧化作用（oxidation）或醣化作用（glycation）等。

持平而論，老化可能是多種因子所共同參與的過程，而遺傳與各種環境因子亦都扮演舉足輕重的角色。

（一）自由基的傷害：

關於老化的原因，迄今已提出的學說和意見不勝枚舉。

其中之一學說為『自由基學說』（freeradicaltheory）。

自由基是指構成物質的原子團在分子狀態下有不配對電子的情形，這種電子結構極不穩定，易與其他分子發生反應。

在所有自由基種類中，以「含氧自由基」對人體的健康最密切。

它的產生方式有兩種：

一種是由身體內在正常新陳代謝或自衛機制所產生，即當細菌、黴菌、病毒或異物等入侵時，體內防衛系統在吞噬異物後，會產生「含氧自由基」。

另一種是受外在影響因子的影響，例如輻射線或紫外線、抽菸、空氣污染或攝取的不飽和脂肪酸被氧化等，甚至心理壓力也會形成「含氧自由基」。

一旦體內自由基的數量超出人體天然防禦的範圍，造成氧化壓力（oxidativestress），則各種疾病與老化便接踵而至。

因此，當自由基形成後就會造成「連鎖反應」，促使蛋白質、碳水化合物、脂肪、核酸等構成細胞物質的氧化，造成過氧化脂質的堆積，進而破壞體內的細胞膜、蛋白質及核酸等，使生理功能逐漸消失，產生疾病。

若能增加生物體內抗氧化防禦系統之作用，以分解活性氧物質，則能有效減少細胞傷害，延緩生物體的衰老與死亡。

（二）遺傳基因的影響：

以前認為動物體內產生的內源性抗氧化酵素一定與老化速率呈現負相關，但現在的老化理論與以前有些不同。

近年來，愈來愈多科學證據顯示：

腦部及其他組織的內源性抗氧化酵素含量，並不一定會隨著年齡的老化而有明顯的下降（Barja,2004;BenziandMoretti,1995;Hoetal.,1997;Melovetal.,1999;OrrandSohal,2003;Shefneretal.,1999），反而是遺傳基因為主要的影響因素，因此不同種別、品系、個體之間的老化速率會因為遺傳基因組成的不同而有明顯的差異。

目前已知限制熱量（caloricrestriction,CR）的實驗方法，確實可降低哺乳動物的老化速率（Weindruch,2003），但是動物體內抗氧化酵素，例如：

SOD、Catalase、Glutathioneperoxidase的活性與表現量，並未因CR而有持續性地影響；取而代之的是，腦、心、肝的「粒線體（mitochondria）氧化自由基」（reactiveoxygenspecies,ROS）有明顯降低的現象（Gredillaetal.,2001a;Gredillaetal.,2001b;Lopez-Torresetal.,2002）。

（三）粒線體DNA的傷害：

除了遺傳因素的調控外，環境與飲食等外在因素也會影響老化速率。

許多研究證實是因為ROS累積所造成的傷害性，包括DNA、蛋白質、脂質等分子的破壞，進而導致細胞進行凋亡。

ROS主要產生的位置在細胞內粒線體的ComplexIII（BoverisandCadenas,2000），但在腦部及心臟器官ComplexI亦是ROS的重要來源（BarjaandHerrero,1998;Genovaetal.,2001;HerreroandBarja,1997;Kudinetal.,2004），並進而造成粒線體基質內的DNA（mitochondrialDNA,mtDNA）嚴重損傷。

目前認為粒線體產生的ROS含量是控制老化速率的主因，至少在脊椎動物（HekimiandGuarente,2003）、真菌類（Osiewacz,2002）、培養細胞（BrunkandTerman,2002）中是被確定的。

目前可藉由偵測腦、心臟組織mtDNA的8-hydroxy-2’-deoxyguanosine（8-oxodG）含量，來評估ROS對mtDNA的傷害性，但若測定的是細胞核DNA（nuclearDNA）的8-oxodG，則不如mtDNA顯著（BarjaandHerrero,2000），故而測試mtDNA氧化損傷則成為重要的評估老化指標之一（Barja,2004;BarjaandHerrero,2000）。

二、老化的評估指標：

氧化壓力（oxidativestress）所造成的老化現象，特別容易受到影響的器官是腦部組織（Herreraetal.,2009），有以下幾點解釋：

（1）腦部僅占總體重的2%不到，但卻消耗總氧量約20%；

（2）腦部含有高量的不飽和脂肪酸較易氧化；（3）鐵質會蓄積在腦部的特定區域而促進自由基的產生；（4）鐵結合蛋白質（例如ferritin）可能在腦部組織中相對的缺乏。

氧化壓力造成的腦神經退化性疾病常見的有：

阿茲海默症（Alzheimer’sdisease）（Hondaetal.,2004）與巴金森氏症（Parkinson’sdisease）（Beal,2003;Jenner,2003）等皆與ROS傷害有直接的相關性：

包括Alzheimer’sdisease腦部的amyloid-β蓄積（McLellanetal.,2003）與鐵質蓄積（Hondaetal.,2004），以及Parkinson’sdisease大腦黑質區多巴胺生成細胞的粒線體功能失常（Beal,2003）而凋亡，遂降低多巴胺產生量。

由於在正常腦部細胞的老化與腦部退化性疾病中，學習與記憶能力下降是人類與囓齒類動物普遍的老化現象，而且在老化的腦部可測得較高的一氧化氮合成酶（nitricoxidesynthase,iNOs）表現量，表示會生成具有神經毒害的NO自由基（Lawetal.,2001;Malinski,2007;McCannetal.,2005）。

由於氧化損傷所造成的老化現象，除了上述的腦部器官外，容易受到影響的器官還有包括：

心臟、血管、肝、腎、骨等組織，進而出現心血管疾病、肝腎代謝異常疾病、骨質疏鬆疾病、免疫細胞功能下降等。

不同器官的老化現象須進行不同的生物活性測試方法，至今無法由單一的生物指標來評估整體的老化現象，必須測試不同組織器官的生物活性指標，來評估受試物是否對該組織或器官具有延緩老化的功能。

除本評估方法所建議之功能評估方法外，亦可依國際性認可之期刊（例如CotzandItter,2008）作為實驗設計與方法之參考。

三、以血清Dehydroepiandrosteronesulfate濃度預估其壽命

一個人能活多久（不含意外死亡）？

可能永遠是個謎！

但在目前科學的瞭解，近年來，有幾項大型的人體追蹤研究（Enomotoetal.2008;Feldmanetal,2001;Barret-Connor,1995;Mazatetal.2001）與動物實驗（Rothetal.,2002;WeindruchandWalford,1988）發現男性或雄性的血清Dehydroepiandrosteronesulfate濃度與其壽命呈現極顯著的相關性（p<0.01），而認為大致可利用它來預估其相對壽命之長短。

人體之腎上腺（Adrenalglands）可分泌大量之Dehydroepiandrosterone（DHEA）與Dehydroepiandrosteronesulfate（DHEAS），它們能在周邊組織轉化成Androgens與Estrogen等。

許多調查研究發現，男性血清中的DHEAS濃度很明顯高於女性（p<0.001），而男女性該濃度均會隨著年齡之增加而穩定持續（平均約值：

男20歲300μg/dL、40歲220μg/dL、65歲120μg/dL；女20歲200μg/dL、40歲150μg/dL、65歲60μg/dL）下降，而不同種族其濃度相近。

生理的研究（Yen,2001）認為DHEAS是具有多項功能（multifunctional），維持身體健康的一種很重要激素，它能促進免疫系統作用（immunoenhancing）、抗糖尿病（antidiabetic）、抗肥胖（antiobesity）、抗癌變（anticancer）、供給神經營養（neurotrophic）、增加記憶（memory-enhancing），以及抗老化（antiaging）等功能，而近年來陸續被發現靈長類（含人類）之血清DHEAS與其壽命有極高的相關性。

其中，Enomotoetal.（2008）於1978年以輻射免疫分析方法（radioimmunoassay）檢測940人（396男性、544女性）的血清DHEAS濃度，然後追蹤到2005年，共27年，經過年齡因子之校正後，發現在男性其DHEAS濃度>200μg/dL者之壽命比濃度<200μg/dL者有很明顯的長壽（p<0.01），而支持過去的許多認為可利用血清DHEAS來預估其壽命之研究論述。

而多項實驗均發現可能女性的血清DHEAS濃度較低，當再加上個體間之生物誤差值，因此無法明顯呈現其血清DHEAS濃度與其壽命的相關性（Yen,2001;Rothetal.,2002;Enomotoetal.,2008）。

過去的壽命影響因子實驗大多使用果蠅或線蟲，直接觀察在一族群的死亡率與其壽命來評估；然而，牠們的身體結構與生理作用到底與人類有相當大的差距，若能以此等人體的壽命指標，也許可提供更多的訊息與佐證。

目前，到底有那些因子能影響血清DHEAS濃度尚不是很清楚，但相對較確定的是如能增加個體的血清DHEAS濃度，應有可能可增長其壽命。

有使用rhesusmonkeys與rodents的研究發現『限制熱量的攝取』能明顯提升雄性的血清DHEAS濃度，而有較長的壽命（Rothetal.,2002;）；Yangetal.（2005）的研究給予20名中年女子每天50mgDHEA（分2次給予）能增加空腹血清DHEAS濃度3倍，也能改善OGTT之血糖值；且於耐力型運動後給予DHEA，可降低空腹血清膽固醇、三酸甘油酯及Tumornecrosisfactor-α（TNF-α）。

此些現象顯示很有可能飲食或某些食物成分可影響到血清DHEAS濃度，且能增進健康。

由於此延長壽命的機制被認為是能降低許多衰老或疾病的危險因子，因此進行延緩老化之動物或人體評估實驗而檢測其血清DHEAS濃度時，若其結果顯示該受試食品能明顯增加其血清DHEAS濃度時，得推測其能延緩老化或延長壽命。

但由於能延緩老化之保健食品的特色各異，因此本指標實驗不列為申請保健食品宣稱之必需檢測項目。

貳、實驗動物與實驗方法

1、老化動物模式之選擇：

當進行健康食品之延緩衰老功能評估方法時，首先需選擇至少一種或以上的老化動物模式，例如：

正常動物的長期飼養至老化年紀才進行器官的老化測試、使用年輕或中年之動物開始進行預防性試驗飼養至老化年齡，或基因遺傳型老化動物模式（例如：

SAM老化促進小鼠），誘導型老化動物模式（例如：

Alzheimer’sdiseaseanimalmodel、Parkinson’sdiseaseanimalmodel、或D-Galactosemodel等），或者國際期刊認可之其他老化動物模式（申請時應檢附參考資料）。

受試食品以有3個不同劑量組（須含換算為人體之建議劑量組）為原則，但該類食品已有相關文獻或已有產品通過「健康食品」認證，則可採用2個劑量組；每組大鼠雌雄各8隻以上，小鼠雌雄各10隻以上。

試驗可針對產品之特色與欲宣稱之功能而選擇適當之評估方法進行測試適當器官的老化現象，但每一種老化器官至少測試2種本評估方法所推薦或國際期刊認可之老化生物活性指標（應附該參考資料），作為評估健康食品對延緩衰老功能之實驗動物材料與方法。

（一）老齡動物模式

選用18月齡大鼠或12月齡小鼠，隨機分為對照組和2-3個受試物劑量組，開始進行樣品測試實驗，動物須進行實驗飼養12週以上，然後測定與比較受試組與對照組的老化生物活性指標。

（二）長期試驗之少齡動物模式

建議選用6月齡大鼠或3月齡小鼠，隨機分為對照組和2-3個受試物劑量組，開始進行樣品測試實驗，大、小鼠各須飼養12、9個月以上，然後測定與比較受試組與對照組的老化生物活性指標。

（三）遺傳型老化動物模式

選擇SAM老化促進小鼠的老齡（6月齡）或少齡（2~3月齡）動物，或選擇其他國際期刊認可之遺傳型老化動物模式。

隨機分為對照組和2-3個受試物劑量組，開始進行樣品測試實驗，動物各需飼養12週以上，然後測定與比較受試組與對照組的老化生物活性指標。

二、誘導型老化動物模式

可依實驗需求自行選擇一般學術認可之誘導型老化動物模式，舉例如下：

（一）D-半乳糖誘發老化模式（D-galactoseinducedsenescence）：

1.原理：

D-galactose是生理上可利用的養分，但當攝取過量D-半乳糖時會造成非酵素型的醣化作用（glycation）之代謝異常，並產生大量「活性氧」（ROS），打破了身體的活性氧產生與消除之平衡狀態，引起過氧化效應，導致許多細胞的傷害（Luetal.,2006）。

有些科學家相信這種非酵素型的醣化作用是一種促進氧化性傷害及老化相關性疾病的途徑（Chenetal.,2006;Leietal.,2008）。

將囓齒類動物注射D-galactose達6-10週後，會導致動物漸進地減低學習能力與記憶力，並且在腦部組織產生較高量的自由基（Songetal.,1999;Kumaretal.,2009），對前額大腦及海馬迴區所產生的神經毒性被認為是鈣離子的穩定平衡受到破壞與粒線體失去活性所致（Lietal.,2007）。

2.建立以D-半乳糖誘發老化動物模式之方法：

選3月齡健康成年的小鼠，先將D-半乳糖溶解於distilledwater中，以頸背部皮下注射模式，注射1.2g/Kgbw之D-半乳糖，每日1次，連續6週，然後隨機分為對照組和2-3個受試物劑量組；如欲增加正常對照組時，可於皮下注射生理鹽水。

42天後犧牲動物測器官的老化生物活性指標（Kumaretal.,2009）。

（二）巴金森氏症動物模式（Parkinson’sdiseaseanimalmodel）：

1.原理：

已知巴金森氏症為大腦基底核內黑質緻密部退化所造成的疾病，目前有許多方式可以藥物，例如MPTP、6-OHDA或Rotenone，都能造成動物的腦內黑質緻密部死亡，進而誘導動物形成巴金森氏症。

1-methyl-4-phenyl-2,3-trihydropyridine（MPTP）是會造成腦內多巴胺神經細胞壞死的神經毒物（Langstonetal.,1983），其分子結構與多巴胺有些相似，MPTP一旦進入體內後，可穿越血腦障壁而進入到腦內，並經由MAO-B的代謝形成具有毒性的物質1-methyl-4-phenyl-2,3-dihydropyridine（MPP＋），MPP＋會抑制粒線體內complexⅠ的活性，進而造成氧化壓力，使細胞過氧化而死亡。

由於MPP＋會經由多巴胺傳送器（Dopaminetransport）而進入多巴胺神經細胞，因此會專一性的對多巴胺神經細胞造成傷害。

經由MPTP所誘導的動物，會出現相似於帕金森氏症的症狀，且經由左旋多巴胺（L-Dopamine）處理後，這些症狀皆有明顯的改善，因此MPTP可用來建立誘發帕金森的動物模式。

此外，Rotenone為complexI的抑制劑，其為脂溶性物質，因此可以輕易的穿過細胞膜，長期作用下會導致粒線體功能喪失而造成多巴胺細胞受損（Betarbetetal.,2002）。

使用MPTP來建立帕金森動物模式，其優點有：

（1）MPTP是唯一已知的神經毒物，會對人類或猴子造成與帕金森一樣的症狀表現；

（2）雖然MPTP的使用上需要預防接觸污染，但是在動物操作技術上並沒有其困難性，不需要任何特殊的實驗設備，例如腦部立體定位儀。

此外藥物的投予也不用像6-OHDA或Rotenone般需要外科手術的協助；（3）MPTP對黑質紋狀體多巴胺生成路徑所造成的損傷是可逆的，但目前其他已知毒物都是屬於不可逆反應，例如目前認為6-OHDA的神經毒性機制主要與氧化壓力有關，6-OHDA會影響兒茶酚胺神經細胞，主要的攻擊位置為黑質部及紋狀體，會造成不可逆之破壞（Betarbetetal.,2002;Boveetal.,2005;DauerandPrzedborski,2003;Jackson-LewisandPrzedborski,2007）。

2.建立以MPTP誘導巴金森的動物模式之方法：

選用8～10週齡C57BL/6公鼠，腹腔注射MPTP30mg/kg，連續5天；且在MPTP給予時，同時給予不同劑量之受試物，連續給予30天，在給予受試物30天後進行測試。

於30天處理後犧牲動物，測試大腦紋狀體多巴胺含量，並且測試腦器官的老化生物活性指標。

（三）阿茲海默症動物模式（Alzheimer’sdiseaseanimalmodel）：

1.原理：

在老年癡呆症中阿茲海默症（A1zheimer’sDisease，AD）病人佔約一半以上（Blass2001;Shoghi-Jadidetal.2002）。

阿茲海默症的成因頗為複雜，包括基因突變、環境因素與個人習性都可能影響該病的發生及進展；而類澱粉樣蛋白質（amyloidβ-peptide，Aβ）假說則是目前最為學界所接受的理論（Abrahametal.,1989;Alzheimeretal.,1995;GlennerandWong1984）。

該假說指出Aβ乃是阿茲海默症形成的主要元兇，Aβ會在大腦皮質（cortex）及海馬迴（hippocampus）中過度分泌而大量沉積，導致神經元傷害而產生老年斑（senileplaque）和神經纏結（neurofibrillarytangles），此為阿茲海默症之病理特徵（Floodetal.,1991）。

類澱粉前驅蛋白質經過β-secretase的分解產生Aβ（Rubinsztein,1997），阿茲海默症與Aβ的毒性有相當大的關聯性，可溶的Aβ並不具毒性，必須經聚合形成Aβfibrils後才可經由破壞胞內鈣離子平衡與引發氧化壓力等機轉毒殺神經細胞。

且Aβ能誘使神經細胞中星狀細胞（Astrocyte）及神經膠細胞（Microglia）釋放發炎物質，包括介白素-l（IL-1）、介白素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF-α）等致發炎物質，以及一氧化氮、超氧分子等自由基去攻擊神經細胞，造成神經細胞的損傷（Arvinetal.,1996;Limetal.,2001；Silvermanetal.,2001）。

因此Flood等人（1991）以amyloidβ-peptide1-40（Aβ40）於大鼠側腦室中進行連續輸注來誘導大鼠腦中形成似老年斑塊的沉積，並造成神經損壞與學習操作能力障礙，以作為擬似阿茲海默症之動物模式（MyhreandTysnes,2002）。

2.建立阿茲海默症動物模式：

可選用阿茲海默症基因轉殖動物，例如Amyloidprecursorprotein（APP）Transgenicmice（Tg2576），或參考國際期刊之建議（SpiresandHyman,2005；CotzandItter,2008）。

此外，亦可利用誘導阿茲海默症之方法，以直接連續輸注幫浦將Aβ40連續28天輸注於大鼠腦部側腦室中，使Aβ直接於腦部大量沉積而引發阿茲海默症。

試驗期間每日餵食受試物以探討對於腦部中Aβ之毒性抑制效果，同時亦探討受試物對於Aβ所引起記憶能力受損之改善效果（李俊霖，2007）。

實驗可採用8週齡Wistar品系雄性大鼠，體重約250g，每組8隻以上，預養至體重達到300g時進行實驗分組，並進行腦部輸注幫浦植入手術（Mini-OsmoticPump,Model2004,AlzetCorporation,PaloAlto,CA,USA）：

輸注速率0.28μL/hr，內容量234μL，軟管（長約4-5cm，內容量約80μL）、輸注針頭（brainInfusionKitII，3-5mm，Alzet©）所構成，配合動物腦部立體定位儀對大鼠腦部進行定位，進而將藥品輸入至大鼠腦部以誘發擬似阿茲海默症之大鼠（Floodetal.,1991;Hashimotoetal.,2005）。

Aβ溶於35%acetonitrile/0.1%trifluoroaceticacid（pH2.0）溶液中，配製完成的Aβ溶液或未加入Aβ之空白溶液（作為vehicle組）注入Alzetosmoticmini-pump，接上braininfusionkitII並使Aβ溶液充滿整個輸注管與輸注頭。

將大鼠以sodiumpentobarbital（50mg/kg）腹腔注射進行麻醉後，置於動物立體定位儀上，進行左側腦室定位，以頭蓋骨上之bregma為中心，於縱軸0.8mm，橫軸1.4mm位置進行側腦室之定位並進行鑽孔（PaxinosandWatson,2005）。

待側腦室定位後，將braininfusionkit置入，輸注頭之深度為距離頭蓋骨4.0mm，完成後並以生物黏合膠固定接著墊片與接頭於頭蓋骨上，並將Alzetosmoticmini-pump置於頸後皮下區，最後以縫合針縫合，並歸回飼養籠中照顧。

每個Alzetosmoticpump均充填234μL之A