基因工程操作基本程序.docx
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基因工程操作基本程序
基因工程的基本操作程序
[目标导读] 1.结合教材P8图1—6，整体把握并说出基因工程的原理和基本操作程序。
2.尝试设计某一转基因生物（例如让大肠杆菌生产鼠的β珠蛋白）的研制过程。
[重难点击] 基因工程基本操作程序的四个步骤。
知识储备
1．质粒作为载体所具备的条件
（1）能自我复制：
能够在受体细胞中进行自我复制，或整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制。
（2）有切割位点：
有一个至多个限制酶切割位点，供外源基因插入。
（3）具有标记基因：
具有特殊的标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
（4）无毒害作用：
对受体细胞无毒害作用，否则受体细胞将受到损伤甚至死亡。
2．DNA的复制过程示意图
DNA复制是一个边解旋边复制的过程，以解开的每一段母链为模板，在DNA聚合酶等酶的作用下，利用细胞内游离的四种脱氧核苷酸为原料，按照碱基互补配对原则，各自合成与母链互补的一段子链，复制结束后，一个DNA分子就形成了两个完全相同的DNA分子。
3．基因的表达是指某一基因通过转录、翻译合成相关蛋白质的过程。
[课堂导入]
抗软化番茄是通过将抗多聚半乳糖醛酸酶基因导入番茄细胞培育而成的，具有抗软化、耐储存的优点，这种技术需要特定的操作程序，今天我们就来学习基因工程的基本操作程序。
探究点一 目的基因的获取
1．目的基因：
主要是指编码蛋白质的基因。
2．获取目的基因的常用方法
（1）从基因文库中获取
①基因文库：
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因。
②基因文库种类
文库类型
部分基因文库
（如cDNA文库）
基因组文库
文库大小
小
大
基因中启动子（具有启动作用的DNA片段）
无
有
基因中内含子（位于编码蛋白质序列内的非编码DNA片段）
无
有
基因多少
某种生物的部分基因
某种生物的全部基因
物种间的基因交流
可以
部分基因可以
（2）利用PCR技术扩增目的基因
①原理：
DNA双链复制。
②过程：
a．变性：
加热至90～95℃，使DNA中的氢键断裂，双链解开。
b．复性：
冷却至55～60℃，引物与单链相应互补序列结合。
c．延伸：
加热至70～75℃，在DNA聚合酶的作用下，沿模板延伸子链，最终合成2条DNA分子。
③若PCR过程中，扩增循环的次数是n，则目的基因的量将被扩增2n倍。
④PCR技术中因为需要在高温下进行，因此需要特殊的热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。
（3）人工合成法：
如果基因比较小，核苷酸序列又已知，也可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。
归纳提炼
两种人工合成目的基因的方法的比较
（1）反转录法：
主要用于相对分子质量较大而又不知其序列的基因，它是以目的基因的mRNA为模板，借助反转录酶合成碱基互补的单链DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA。
其过程如下图：
（2）化学合成法：
即依照某一蛋白质的氨基酸序列，通过密码子推算出其基因序列，然后直接合成目的基因。
其过程如下图：
（3）由于真核细胞的基因含有不表达的DNA片段，不能直接用于基因的扩增和表达，因此，在获取真核细胞中的目的基因时，一般是用人工合成目的基因的方法。
例题1
1．样品DNA经PCR技术扩增，可以获取大量DNA分子克隆。
在试管中进行DNA的人工复制（如图）。
在很短的时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使实验室所需的遗传物质不再受限于活动的生物体。
据图回答下列问题：
（1）PCR技术的原理是____________________，图中A过程表示__________。
（2）某样品DNA中共含3000个碱基对，碱基数量满足：
（A＋T）∶（G＋C）＝1/2，现欲得到100个与样品相同的DNA，至少需要向试管中加入________个腺嘌呤脱氧核苷酸。
（3）A过程也称为DNA的变性，此过程在温度高达90～95℃时才能完成，说明DNA分子具有________性。
利用PCR技术获取目的的基因的前提是______________________________。
（4）由图中信息分析可知，催化C过程的酶是________，它与正常细胞里的酶的区别是______________。
答案
（1）DNA分子半保留复制 DNA解旋
（2）99000
（3）稳定 要有一段已知目的基因的核苷酸序列
（4）DNA聚合酶 能耐高温
探究点二 基因表达载体的构建和目的基因的导入
1．基因表达载体的构建
基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。
（1）基因表达载体的组成
基因表达载体模式图
①启动子：
是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。
②终止子：
也是一段有特殊结构的DNA短片段_，位于基因的尾端，使转录在此停止。
③标记基因：
是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而对受体细胞进行筛选。
常用的标记基因是抗生素抗性基因。
④目的基因：
目的基因插在启动子和终止子之间。
（2）构建基因表达载体的过程
2．将目的基因导入受体细胞
（1）目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。
目的基因在受体细胞内的存在形式一般有以下两种：
（2）将目的基因导入受体细胞的方法
生物种类
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
常用方法
农杆菌转化法
显微注射技术
Ca2＋处理法
受体细胞
体细胞
受精卵
原核细胞
转化过程
将目的基因插入Ti质粒的T DNA上→农杆菌→导入植物细胞→融合到受体细胞的DNA→表达
将含有目的基因的表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
强调 农杆菌转化法中有二次拼接和二次导入。
第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒上T DNA的中间部位，第二次拼接（非人工操作）指被插入目的基因的T DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌，第二次导入（非人工操作）是指含目的基因的T DNA进入受体细胞。
归纳提炼
工具酶
构件
植物将目的基因导入受体细胞―→
例题2
2．农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染植物，因而在植物基因工程中得到了广泛的运用。
下图为农杆菌转化法的示意图，试回答下列问题：
（1）一般情况下农杆菌不能感染的植物是____________，利用农杆菌自然条件下感染植物的特点，能实现______________________。
具体原理是在农杆菌的Ti质粒上存在T DNA片段，它具有可转移至受体细胞并整合到受体细胞____________上的特点，因此只要将携带外源基因的DNA片段插入到____________（部位）即可。
（2）根据T DNA这一转移特点，推测该DNA片段上可能含有控制____________________（酶）合成的基因。
（3）图示c过程中，能促进农杆菌向植物细胞转移的物质是____________类化合物。
（4）植物基因工程中除了农杆菌转化法之外，还可采取________________________________。
（至少写出两种）
答案
（1）单子叶植物 将目的基因导入植物细胞 染色体的DNA T DNA片段（内部）
（2）DNA连接酶、限制酶
（3）酚 （4）基因枪法、花粉管通道法
探究点三 目的基因的检测与鉴定
目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。
1．目的基因的检测
（1）检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因：
采用DNA分子杂交技术。
主要做法是用标记了放射性同位素的目的DNA片段作为探针，检测受体细胞的DNA中有无目的基因。
显示出杂交带，说明目的基因已经插入染色体DNA中。
（2）检测目的基因是否转录出了mRNA：
采用分子杂交技术。
具体做法与DNA和DNA分子之间杂交相同，只是它从受体植物中提取的是mRNA而不是DNA，杂交带的显现也与DNA和DNA分子之间杂交相同。
（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质：
采用抗原－抗体杂交法。
具体做法是：
从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行杂交，若有杂交带出现，表明目的基因已经表达了。
2．鉴定
观察图示，判断抗虫棉的接种实验属于个体生物学水平鉴定，通过做抗虫（或抗病）的接种实验以确定是否具有抗性及抗性的程度。
归纳提炼
基因工程中的几个易错点
（1）在基因工程的四个操作步骤中，只有第三步将目的基因导入受体细胞不需碱基互补配对，其余三个步骤都涉及碱基互补配对。
（2）原核生物繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，有利于目的基因的复制与表达，因此常采用大肠杆菌等原核生物作为受体细胞。
（3）植物细胞的全能性较高，可经植物组织培养过程成为完整植物体，因此受体细胞可以是受精卵也可以是体细胞；动物基因工程中的受体细胞一般是受精卵。
例题3
3．目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道。
下列属于目的基因检测和鉴定的是（ ）
①检测受体细胞是否有目的基因 ②检测受体细胞是否有致病基因 ③检测目的基因是否转录出mRNA ④检测目的基因是否翻译成蛋白质
A．①②③B．②③④
C．①③④D．①②④
答案 C
1．如图为用于基因工程的一个质粒示意图。
用EcoRⅠ限制酶切割目的基因和该质粒，再用DNA连接酶连接形成重组质粒，然后导入大肠杆菌，最后将大肠杆菌放在四种培养基中培养：
a—无抗生素的培养基，b—含四环素的培养基，c—含氨苄青霉素的培养基，d—含四环素和氨苄青霉素的培养基。
含重组质粒的大肠杆菌能生长的是（ ）
A．aB．a和cC．a和bD．b和c
答案 B
2．下列关于基因工程的叙述，正确的是（ ）
A．基因工程经常以抗菌素抗性基因作为目的基因
B．细菌质粒是基因工程常用的载体
C．通常用一种限制性核酸内切酶处理含目的基因的DNA，用另一种处理载体DNA
D．为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体
答案 B
3．下图表示一项重要生物技术的关键步骤，字母X可能代表（ ）
A．不能合成胰岛素的细菌细胞
B．能合成抗体的人类细胞
C．能合成胰岛素的细菌细胞
D．不能合成抗生素的人类细胞
答案 C
4．萤火虫能发光是因为萤火虫体内通过荧光素酶催化的系列反应所产生的现象。
如果荧光素酶存在于植物体内，也能使植物体发光，一直以来荧光素酶的唯一来源是从萤火虫腹部提取的。
但加利福尼亚大学的一组科学家成功地通过基因工程实现了将荧光素酶基因导入到大肠杆菌体内，并在大肠杆菌体内生产荧光素酶。
请你根据已知的知识回答下列有关问题：
（1）提取目的基因通常有两种途径，提取该目的基因的方法最可能的途径是____________________。
（2）在该过程中需要多种酶的参与，其中包括__________________________________
________________________________________________________________________等。
（3）下列可作为受体细胞的生物有（ ）
A．土壤农杆菌B．结核杆菌
C．噬菌体D．病毒
（4）在此转基因工程中，是由质粒承担载体的。
在将体外重组的DNA插入大肠杆菌体内之前通常要用________处理大肠杆菌，目的是____________________________________
________________________________________________________________________。
（5）由于荧光素酶的特殊作用，人们一直设想将其基因作为实验工具，将它和某一基因连接在一起导入植物体内，如与固氮基因连接在一起导入植物体内，判断固氮基因是否导入的方法是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
（6）与杂交育种、诱变育种相比，通过基因工程来培育新品种的主要优点是________________________________________________________________________
和____________________________。
答案
（1）人工合成法
（2）限制性核酸内切酶、DNA连接酶 （3）A （4）Ca2＋ 增大细胞壁的通透性，使重组质粒能够导入到受体细胞内 （5）检测植物是否发光 （6）目的明确 培育周期短 可以克服远缘杂交不亲和性障碍（只要合理，两点即可）
基础过关
知识点一 目的基因的获取
1．下列关于基因文库的说法，错误的是（ ）
A．可分为基因组文库和部分基因文库
B．cDNA文库属于部分基因文库
C．基因组文库的基因在不同物种之间均可进行基因交流
D．同种生物的cDNA文库基因数量较基因组文库基因数量少
答案 C
2．下列获取目的基因的方法中需要模板链的是（ ）
①从基因文库中获取目的基因 ②利用PCR技术扩增目的基因 ③反转录法 ④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成目的基因
A．①②③④B．①②③C．②③④D．②③
答案 D
知识点二 基因表达载体的构建
3．水母发光蛋白由236个氨基酸构成，其中Asp、Gly、Ser构成发光环，现已将这种蛋白质的基因作为生物转基因的标记，在转基因技术中，这种蛋白质的作用是（ ）
A．促使目的基因导入宿主细胞中
B．促使目的基因在宿主细胞中复制
C．使目的基因容易被检测出来
D．使目的基因容易成功表达
答案 C
4．下列哪项不是表达载体所必需的组成成分（ ）
A．目的基因B．启动子
C．终止子D．抗青霉素基因
答案 D
知识点三 将目的基因导入受体细胞
5．人们将苏云金芽孢杆菌中的抗虫基因导入棉花细胞中培育成为抗虫棉，这个过程中所利用的主要原理是（ ）
A．基因突变B．基因重组
C．基因工程D．染色体变异
答案 B
解析 将苏云金芽孢杆菌的抗虫基因导入棉花细胞中，通过DNA复制、转录、翻译合成特定的蛋白质，表现出特定的性状。
此题易错选C。
基因工程是一种技术手段，而不是生物学原理，抗虫棉的培育利用的是基因工程这一技术手段使基因发生重组。
6．基因工程常用的受体细胞有（ ）
①大肠杆菌 ②枯草杆菌 ③支原体 ④动植物细胞
A．①②③④B．①②③C．②③④D．①②④
答案 D
知识点四 目的基因的检测与鉴定
7．检测转基因生物是否转录出mRNA，应通过何种分子杂交方法实现（ ）
A．DNA—DNA杂交B．DNA—RNA杂交
C．RNA—蛋白质杂交D．蛋白质—蛋白质杂交
答案 B
8．利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需要的产品。
下列选项中能说明目的基因完成了在受体细胞中的表达的是（ ）
A．棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因
B．大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNA
C．山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列
D．酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白
答案 D
9．基因工程的正确操作步骤是（ ）
①构建基因表达载体 ②将目的基因导入受体细胞
③检测目的基因的表达是否符合特定性状要求
④提取目的基因
A．③②④①B．②③①③
C．④①②③D．③④①②
答案 C
10．下列有关PCR技术的叙述，正确的是（ ）
A．作为模板的DNA序列必须不断地加进每一次的扩增当中
B．作为引物的脱氧核苷酸序列必须不断地加进每一次的扩增当中
C．反应需要的DNA聚合酶必须不断地加进反应当中
D．反应需要的DNA连接酶必须不断地加进反应当中
答案 B
11．用某人的胰岛素基因制成的DNA探针，能与之形成杂交分子的是（ ）
①该人胰岛A细胞中的DNA ②该人胰岛B细胞中的mRNA ③该人胰岛A细胞中的mRNA ④该人肝细胞中的DNA
A．①③④B．①②③
C．①②④D．②
答案 C
12．在基因表达载体的构建中，下列说法不正确的是（ ）
①一个基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止子
②有了启动子才能驱动基因转录出mRNA
③终止子的作用是使转录在所需要的地方停止
④所有基因表达载体的构建是完全相同的
A．②③B．①④C．①②D．③④
答案 B
13．质粒是基因工程中最常用的载体，它存在于许多细菌体内，某细菌质粒上的标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因（目的基因）是否转移成功。
外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上生长情况也不同，如图所示外源基因在质粒中可插入的位置有a、b、c三点。
某同学根据实验现象对其插入的位点进行分析，其中分析正确的是（ ）
实验现象
实验推论
在含青霉素培养基上生长情况
在含四环素培养基上生长情况
目的基因插入的位置
A
能生长
能生长
a
B
不能生长
能生长
b
C
能生长
不能生长
c
D
不能生长
不能生长
c
答案 B
14．棉铃虫是一种危害棉花的害虫。
我国科学工作者发现一种生活在棉铃虫消化道内的苏云金芽孢杆菌能分泌一种毒蛋白使棉铃虫致死，而这种毒蛋白对人畜无害。
通过基因工程方法，科学家采用花粉管通道法将毒蛋白基因转入棉花植株并成功表达，棉铃虫吃了这种转基因棉花的植株后就会死亡。
花粉管通道法是指：
利用植物花粉萌发时形成的花粉管通道将毒蛋白基因送入胚囊，进而导入不具备细胞壁的合子或早期胚体细胞，借助天然的种胚系统，形成含有目的基因的种胚。
（1）下列所示的黏性末端是由______种限制酶作用产生的。
（2）利用花粉管通道法将毒蛋白基因导入棉花细胞，此过程是基因操作的基本步骤中的第三步，即__________________________。
为减少获得目的基因的盲目性，在获得真核生物的目的基因时，应尽量采用________________________________________________________
的方法。
（3）该目的基因在导入受体细胞前需要与载体结合，目前经常使用的载体有______________、________________________________________________________________________
和______________________。
（4）检测该目的基因是否表达的方法是________________________________________
________________________________________________________________________。
答案
（1）4
（2）将目的基因导入受体细胞 人工合成目的基因 （3）质粒 λ噬菌体的洐生物 动植物病毒
（4）让害虫吃棉花，观察害虫的生存状态
15．酵母菌的维生素、蛋白质含量高，可生产食品和药品等。
科学家将大麦细胞的LTP1基因导入啤酒酵母菌中，获得的啤酒酵母菌可产生LTP1蛋白，并酿出泡沫丰富的啤酒。
基本操作过程如图所示，请据图回答下列问题：
（1）该技术定向改变了酵母菌的性状，这种可遗传变异属于________________。
（2）从大麦细胞中可直接分离获得LTP1基因，还可采用__________方法获得目的基因。
本操作中为了将LTP1基因导入酵母菌细胞内，所用的载体是____________________________。
（3）要使载体与LTP1基因连接，首先应使用__________进行切割。
假如载体被切割后，得到的分子末端序列为AATTCG，则能与该载体连接的LTP1基因分子末端是____________。
A．GCTTAAB．TAATTCC
C．CTTTAGD．AAATCT
（4）切割完成后，采用____________酶将载体与LTP1基因连接，连接后得到的DNA分子称为__________。
（5）此操作中可以分别用含有青霉素、四环素的两种选择培养基进行筛选，则有C进入的酵母菌在选择培养基上的生长情况是____________________________________________
________________________________________________________________________。
（6）除了看啤酒泡沫丰富与否外，还可用什么方法检测LTP1基因在啤酒酵母菌中是否表达？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案
（1）基因重组
（2）人工合成 质粒 （3）限制酶 A （4）DNA连接 重组DNA（重组质粒） （5）能在含有青霉素的培养基上存活，但不能在含有四环素的培养基上存活 （6）检验转基因啤酒酵母菌能否产生LTP1蛋白
16．我国曾经发生过因“非典型性肺炎”而死亡的病例，经研究发现，该病是由SARS病毒（一种RNA病毒）感染所引起的疾病。
SARS病毒表面的S蛋白是主要的病毒抗原，在SARS病人康复后的血清中有抗S蛋白的特异性抗体。
某研究小组为了研制预防SARS病毒的疫苗，开展了前期研究工作，其简要的操作流程如图：
（1）实验步骤①所代表的反应过程是______________________。
（2）步骤②构建重组表达载体A和重组表达载体B必须使用限制性核酸内切酶和________酶，后者的作用是将用限制性核酸内切酶切割的________________和________________连接起来。
（3）如果省略步骤②而将大量扩增的S蛋白基因直接导入大肠杆菌，一般情况下，不能得到表达的S蛋白，其原因是S蛋白基因在大肠杆菌中不能________________，也不能________________。
（4）为了检验步骤④所表达的S蛋白是否与病毒S蛋白有相同的免疫反应特性，可用________________________________________________________________________
与________________进行抗原—抗体特异性反应实验，从而得出结论。
（5）步骤④和⑥的结果相比，原核细胞表达的S蛋白与真核细胞表达的S蛋白的氨基酸序列________（填“相同”或“不同”），根本原因是______________________。
答案
（1）反转录
（2）DNA连接 载体 S蛋白基因
（3）复制 合成S蛋白基因的mRNA （4）大肠杆菌中表达的S蛋白 SARS康复病人血清 （5）相同 表达蛋白质所用的基因相同
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