毛细管等电聚焦电泳CIEF法标准操作规程SOP.docx

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毛细管等电聚焦电泳CIEF法标准操作规程SOP

毛细管等电聚焦电泳（CIEF法）标准操作规程

类别

工作标准文件

文件编号

XXXX

版本号

V01

页码

共15页

执行日期

2019年XX月X日（禁止复印）

审批页

—

起草人

审核人

审核人

批准人

部门

分析研究部

分析研究部

分析研究部

质量保证部

姓名

签名

日期

年月日

年月日

年月日

年月日

颁发部门：

质量保证部

分发部门：

分析研究部

拷贝号：

NO./

文件变更历史

版本号

执行日期

变更原因、依据及变更内容

V00

2019年XX月XX日

新文件体系的新文件

1目的

规范毛细管等电聚焦电泳（CIEF法）检验的操作过程。

2范围

本规程适用于常规毛细管等电聚焦电泳检验，涉及到蛋白质等电点相关指标的测定。

3定义

3.1CIEF：

毛细管等电聚焦电泳。

3.2pI：

等电点。

3.3DDI：

超纯水。

4环境、健康和安全

4.1乙酸其水溶液呈弱酸性且腐蚀性强，蒸汽对眼和鼻有刺激性作用，因此需适当防护。

4.2氨水具有刺激性气味，易挥发，有毒，对眼、鼻、皮肤有刺激性和腐蚀性，能使人窒息。

有燃烧爆炸危险。

应储存于阴凉、干燥、通风处，远离火种、热源。

5培训

5.1培训部门：

分析研究部。

5.2培训对象：

分析研究部相关人员。

5.3培训方式和时数：

授课，8小时。

5.4考核方式：

现场操作。

6职责

6.1质量保证部：

负责监督本文件的执行。

6.2分析研究部：

负责严格执行本规程规定。

7程序（内容）

7.1原理

两端电极槽中分别加入酸液和碱液，施加电压后毛细管中的操作电解质溶液逐渐形成pH梯度，各溶质在毛细管中迁移至各自的等电点（pI）时变为中性形式聚焦的区带，而后改变检测器末端电极槽储液的pH值的方法使溶质通过检测器。

采集色谱图后，根据各markerpI值与色谱峰的迁移时间的线性关系，从而得到供试品的pI值。

7.2实验材料

7.2.1试药与试液

如无特殊说明，所有试液有效期均为2~8℃，保存3个月。

7.2.1.1通用

编号

名称

来源/配制

1

超纯水

电阻率不低于18.2MΩ·cm，如无特殊说明，本方法所有试液均用超纯水配制。

2

亚氨基二乙酸

Sigma，货号220000

3

磷酸

Sigma，货号345245

4

Urea

Sigma，货号U0631

5

乙酸

Sigma，货号320099

6

1mol/LNaOH溶液

Sigma，货号72082

7

3~10两性电解质

GE公司，货号17-0456-01

8

CIEFGel

Sciex，货号477497

9

阳极稳定液（0.20mol/L亚氨基二乙酸溶液）

称取亚氨基二乙酸0.27g于15ml离心管中，加10ml水使之溶解，混匀备用。

10

阳极缓冲液

（0.20mol/L磷酸溶液）

加水49.3ml于50ml离心管中，加磷酸685μl，混匀备用。

11

尿素溶液

（4.30mol/LUrea溶液）

称取Urea10.8g，加水使之溶解，并稀释定容至50ml，混匀备用。

12

化学迁移液

（0.35mol/L乙酸溶液）

加水49ml于50ml离心管中，然后加1ml乙酸，混匀备用。

13

阴极缓冲液（0.30mol/LNaOH溶液）

加水35ml于50ml离心管中，然后加1mol/L氢氧化钠溶液15ml，混匀备用。

7.2.1.2正向方法（乙酸迁移法缓）

编号

名称

配制

1

L-Arg

Sigma，货号A5006

2

3MUrea-CIEFGel（3.00mol/LUrea胶溶液）

称取尿素1.8g，加CIEFGel使之溶解，并稀释定容至10ml，混匀后用5μm针头过滤器过滤备用。

3

阴极稳定液（0.50mol/LL-Arg溶液）

称取L-Arg0.87g于15ml离心管中，加10ml水使之溶解，混匀备用。

7.2.1.3反向方法（氢氧化铵迁移法）

编号

名称

配制

1

5mol/L氢氧化铵溶液

Sigma，货号318612

2

6MUrea-CIEFGel（6.00mol/LUrea胶溶液）

称取尿素3.6g，加CIEFGel使之溶解，并稀释定容至10ml，混匀后用5μm针头过滤器过滤备用。

3

化学迁移液（出口端，0.10mol/L氢氧化铵溶液）

加水49ml于50ml离心管中，然后加1ml5mol/L氢氧化铵溶液，混匀备用。

7.2.2标准物质

名称

来源

货号

markerpI3.4

北京博思雅生化技术研究院

BSYK016-04

markerpI4.1、5.5、7.0、9.5、10.0

SCIEX

A58481

7.2.3仪器与用具

7.2.3.1毛细管电泳仪：

SCIEX公司PA800plus或CESI8000Plus。

7.2.3.2检测器：

紫外检测器，波长280nm。

7.2.3.3毛细管卡盒：

适用于7.2.2.1的毛细管电泳仪。

7.2.3.4毛细管：

中性涂层毛细管（内径50μm），切割至总长为30.2cm，有效长度为20cm。

7.2.3.5孔塞：

孔塞大小2（100μm×200μm）。

7.2.3.6超滤柱：

Millipore，货号UFC5010BK。

7.2.3.7其他：

样品瓶、蓝色橡胶瓶盖、内插管、移液器、离心机、离心管、超滤柱、量瓶、电子天平、涡旋混合仪。

7.3操作步骤

7.3.1供试品超滤

7.3.1.1取供试品150~350μg加至超滤柱中，再加超纯水定容至500μl，以每分钟不低于13000转离心不少于15分钟。

7.3.1.2弃废液，加超纯水450μl于超滤柱中，以每分钟不低于13000转离心不少于15分钟。

7.3.1.3重复7.3.1.2至少1次。

7.3.1.4取出超滤柱，将其倒转装入一个干净的离心管中，以每分钟不低于3500转离心不少于3分钟收集样品。

7.3.2供试品配制

7.3.2.1样品缓冲液

乙酸

迁移法

（3MUrea-CIEFGel200μl、3~10两性电解质12μl、阴极稳定液20μl、阳极稳定液2μl、pI标准品各2μl）*（N+1）；N为样品数量。

旋涡混匀30S后备用。

氢氧化铵迁移法

（6MUrea-CIEFGel90μl、3~10两性电解质6μl、阳极稳定液15μl、pI标准品各2μl）*（N+1）；N为样品数量。

旋涡混匀30S后备用。

7.3.2.2各项目所用marker如下：

BF08

pI3.4、pI4.1、pI5.5

BF15

pI4.1、pI7.0、pI9.5

BF16

pI3.4、pI4.1、pI5.5

通用

pI4.1、pI7.0、pI9.5

7.3.2.3取240μl上述样品缓冲液与10μl超滤后供试品混合并充分涡旋混匀30S。

将样品移至内插管中，确认内插管下端无气泡后，将内插管放入样品瓶中并盖好蓝色橡胶瓶盖，放入样品托盘中。

7.3.3缓冲液瓶的准备

7.3.3.1在每个样品瓶中放入指定的试剂1.5ml，废液瓶中放入0.8ml超纯水，用蓝色橡胶瓶盖盖好。

7.3.3.2根据选用方法按照7.3.5将缓冲液瓶放入缓冲托盘中，再将托盘放入毛细管电泳仪。

7.3.4缓冲瓶的摆放

7.3.4.1乙酸迁移法缓冲液的摆放，如图7.1所示：

图7.1乙酸迁移法缓冲液的摆放图示

①为超纯水、②为阳极缓冲液、③为尿素溶液、④为CIEFGel、⑤为化学迁移液（0.35mol/L乙酸溶液）、⑥为废液、⑦为阴极缓冲液。

7.3.4.2氢氧化铵迁移法的摆放，如图7.2所示：

图7.2氢氧化铵迁移法的摆放图示

①为超纯水、②为阳极缓冲液、③为尿素溶液、④为CIEFGel、⑤为化学迁移液（入口缓冲液为0.35mol/L乙酸溶液，出口缓冲液为0.10mol/L氢氧化铵溶液）、⑥为废液、⑦为阴极缓冲液。

7.3.5编辑方法并调用

7.3.5.1毛细管的预处理：

CIEFGel在50psi压力下冲洗5分钟，然后用超纯水在50psi压力下冲洗2分钟，最后用尿素溶液在50psi压力下冲洗5分钟。

每次运行前应进行。

7.3.5.2供试品分离方法主要参数

样品进样：

在25psi压力下进样99秒。

聚焦：

25kV下运行5~45分钟。

在乙酸迁移法中，聚焦勾选Normal模式；在氢氧化铵法中，聚焦勾选Reverse模式。

迁移过程：

30kV下运行15~45分钟。

在乙酸迁移法中，迁移电压勾选Normal模式；在氢氧化铵法中，迁移电压勾选Reverse模式

样品室温度：

2~8℃。

毛细管温度：

18~22℃。

检测器波长：

280nm。

7.3.6供试品检测：

将供试品位置号编辑入序列表中，输入相应供试品名称与文件名称，并调用相关方法。

运行序列开始检测分析。

7.4结果分析

7.4.1在质量分析表中，输入marker的理论等电点及其迁移时间。

以各marker相对应迁移时间为X轴，以各marker理论等电点值为Y轴，进行线性回归，通过回归方程计算目的蛋白质的等电点。

7.4.2按面积归一化法计算，以供试品主峰的校正峰面积（CPA）占所有峰CPA之和的百分比计算主峰的所占比例，并分别统计酸性峰与碱性峰所占比例。

7.5判定标准

见各品种项下要求。

7.6注意事项

7.6.1缓冲液瓶的数量取决于样品的个数，保证每8个循环都能使用新的缓冲液。

7.6.2在乙酸迁移法中，聚焦和迁移电压为Normal模式；在氢氧化铵法中，聚焦和迁移电压为Reverse模式。

8相关文件

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9参考文献

9.1BECKMANCOULTER.UserManuals[M].PA800plusPharmaceuticalAnalysisSystemCapillaryIsoelectricFocusing（cIEF）Analysis.B25804AA,January2013

9.2于传飞,郭玮,王兰,等.成像毛细管等点聚焦电泳法对单克隆抗体制品的电荷异质性分析[J].药物分析杂志,2014,34（7）:

1212-1215.

10流程图

————

11附录

毛细管等电聚焦电泳（CIEF法）测定记录

品名

批号/编号

规格

开检日期

年月日

检验依据

一、实验材料

1、仪器设备

名称

生产厂家/型号

设备编号

毛细管电泳仪

□SCIEX/PA800plus

□SCIEX/CESI8000Plus

离心机

EppendorfCentrifuge5418R

2、缓冲液

缓冲液名称

编号

阳极缓冲液（0.20mol/L磷酸溶液）

阴极缓冲液（0.30mol/L氢氧化钠溶液）

尿素溶液（4.3mol/L尿素溶液）

化学迁移液（0.35mol/L乙酸溶液）

化学迁移液（0.10mol/L氢氧化铵溶液）

阳极稳定液（0.20mol/L亚氨基二乙酸溶液）

阴极稳定液（0.50mol/LL-精氨酸溶液）

3MUrea-cIEFGel（3.00mol/L尿素胶溶液）

6MUrea-cIEFGel（6.00mol/L尿素胶溶液）

3、试药、试液耗材

名称

生产厂家

货号

批号/编号

NeutralCapillary

SCIEX

477441

CIEFMarkerKit

SCIEX

A58481

其他：

CIEFGel

SCIEX

477497

3~10两性电解质

GE

17-0456-01

超滤柱

Millipore

UFC5010BK

二、操作步骤

1、取供试品μg加至超滤柱中，再加超纯水定容至500μl，以每分钟转离心分钟。

2、弃废液，加超纯水450μl于超滤柱中，以每分钟转离心分钟。

3、重复操作步骤2共计次。

4、取出超滤柱，将其倒转装入一个干净的离心管中，以每分钟转离心分钟收集样品。

5、根据下表配制样品缓冲液，将μl配制完成的样品缓冲液与μl超滤后样品溶液混合，充分混匀后将其移至内插管中，将内插管放入样品瓶中并盖好蓝色橡胶瓶盖，放入样品托盘中。

试剂名称

取样量（μl）

试剂名称

取样量（μl）

3~10两性电解质

MarkerpI

阴极稳定剂

MarkerpI

阳极稳定剂

MarkerpI

□3MUrea-CIEFGel□6MUrea-CIEFGel

6、缓冲液瓶的准备

按照下表位置，在每个样品瓶中放入指定的试剂1.5ml，废液瓶中放入0.8ml超纯水，用蓝色橡胶瓶盖盖好。

InletBufferTray

位置

A

B

C

D

E

F

名称

DDI

DDI

极缓冲液

尿素溶液

Gel

化学迁移液-乙酸

OutletBufferTray

位置

A

B

C

D

E

F

名称

DDI

废液

极缓冲液

化学迁移液

□乙酸□氢氧化铵

废液

N/A

7、在计算机中打开软件32Karat，建立新的序列程序，输入对应的供试品名称与位置，并选择相应的分离方法对供试品进行分析测定。

三、数据积分

1、点击“File”选择“Data”与“Method”，选择对应的数据与方法；

2、点击“IntegrationEvents”添加积分参数；

3、点击“Analyze”对数据积分；

4、点击“Method”选择“QualitativeAnalysis”输入对应marker理论值与迁移时间；

5、点击“Analyze”计算等电点；

6、保存方法并打印报告。

四、结果判定

1、标准规定：

□

□N/A

2、检验结果：

3、检验结论：

□符合规定□不符合规定□N/A

五、备注

1、附检测图谱页。

2、

操作人/日期：

复核人/日期：

以下无内

容。

毛细管等电聚焦电泳（CIEF法）测定记录

（适用于多个样品）

品名

批号/编号

规格

开检日期

年月日

检验依据

一、实验材料

1、仪器设备

名称

生产厂家/型号

设备编号

毛细管电泳仪

□SCIEX/PA800plus

□SCIEX/CESI8000Plus

离心机

EppendorfCentrifuge5418R

2、缓冲液

缓冲液名称

编号

阳极缓冲液（0.20mol/L磷酸溶液）

阴极缓冲液（0.30mol/L氢氧化钠溶液）

尿素溶液（4.3mol/L尿素溶液）

化学迁移液（0.35mol/L乙酸溶液）

化学迁移液（0.10mol/L氢氧化铵溶液）

阳极稳定液（0.20mol/L亚氨基二乙酸溶液）

阴极稳定液（0.50mol/LL-精氨酸溶液）

3MUrea-cIEFGel（3.00mol/L尿素胶溶液）

6MUrea-cIEFGel（6.00mol/L尿素胶溶液）

3、试药、试液耗材

名称

生产厂家

货号

批号

NeutralCapillary

SCIEX

477441

CIEFMarkerKit

SCIEX

A58481

其他：

CIEFGel

SCIEX

477497

3~10两性电解质

GE

17-0456-01

超滤柱

Millipore

UFC5010BK

二、操作步骤

1、样品超滤

样品批号/编号

供试品体积（μl）

蛋白量（μg）

加水定容至500μl,14000rpm,15min

弃废液,加水450μl,14000rpm,15min

4500rpm,3min收集样品

次

次

定容至μl

次

次

定容至μl

次

次

定容至μl

次

次

定容至μl

次

次

定容至μl

次

次

定容至μl

2、样品缓冲液

试剂名称

取样量（μl）

试剂名称

取样量（μl）

3~10两性电解质

MarkerpI

阴极稳定剂

MarkerpI

阳极稳定剂

MarkerpI

□3MUrea-CIEFGel□6MUrea-CIEFGel

3、样品准备

样品批号/编号

超滤后样品体积

（μl）

样品缓冲液体积

（μl）

充分混匀后将移至内插管中，将内插管放入样品瓶中并盖好蓝色橡胶瓶盖，放入样品托盘中。

4、缓冲液瓶的准备

按照下表位置，在每个样品瓶中放入指定的试剂1.5ml，废液瓶中放入0.8ml超纯水，用蓝色橡胶瓶盖盖好。

InletBufferTray

位置

A

B

C

D

E

F

名称

DDI

DDI

极缓冲液

尿素溶液

Gel

化学迁移液-乙酸

OutletBufferTray

位置

A

B

C

D

E

F

名称

DDI

废液

极缓冲液

化学迁移液

□乙酸□氢氧化铵

废液

N/A

5、在计算机中打开软件32Karat，建立新的序列程序，输入对应的供试品名称与位置，并选择相应的分离方法对供试品进行分析测定。

三、数据积分

1、点击“File”选择“Data”与“Method”，选择对应的数据与方法。

2、点击“Method”选择“QualitativeAnalysis”输入对应marker理论值与迁移时间；

3、点击“IntegrationEvents”添加积分参数。

4、点击“Analyze”对数据积分。

四、结果判定

1、标准规定：

□

□N/A

2、检验结果及结论

批号/编号

主峰

pH值

pH值范围

检验结论

符合

规定

不符合规定

N/A

□

□

□

□

□

□

□

□

□

□

□

□

□

□

□

□

□

□

五、备注

1、附检测图谱页。

2、

操作人/日期：

复核人/日期：