突变人CD59分子抗MAC沉积在糖尿病血管病中的作用.docx

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突变人CD59分子抗MAC沉积在糖尿病血管病中的作用

突变人CD59分子抗MAC沉积在糖尿病血管病中的作用

（作者:

___________单位:

___________邮编:

___________）

【摘要】目的:

研究糖化人突变（HM）CD59作为补体攻膜复合体（MAC）抑制物在糖尿病血管病病理机制中的重要作用。

方法:

构建2种HMCD59重组质粒,转染CHO细胞;FCM、Westernblot筛选高表达细胞。

糖化,BCECF释放试验测定糖化HMCD59和糖化HNCD59抗补体活性。

ELISA测定30例糖尿病无血管病变组和30例Ⅱ型糖尿病血管病组血清PDGFBB、VEGF含量。

结果:

筛选细胞株表达率分别为59.8%、53.7%、54.5%;BCECF释放试验显示糖化前转染突变CD59细胞比较糖化后细胞染料释放率低（P0.01）;而正常CD59细胞比较糖化后细胞染料释放率无统计学意义。

Ⅱ型糖尿病有血管病变组与糖尿病无血管病变组相比,血清PDGFBB、VEGF明显增高（P0.01）。

结论:

证实HMCD59易糖化抗补体活性下降加速糖尿病血管病的发生发展。

【关键词】CD59;真核表达;糖化;补体;免疫分子

　　[Abstract]AIM:

ToinvestigatethefunctionofhumanmutantCD59indiabeticpathology.METHODS:

TherecombinantPALTERMAXplasmidcontaininghumanmutantCD59cDNAandpcDNAplasmidwerecotransfectedintoCHOcellsusingcationlipoidmediatingmethod.HighlyexpressedcellswereselectedbyflowcytometryandWesternblot,whichwerethencultivatedinhighglucose.ThefunctionsofrestrictingcomplementmembraneattackcomplexformationofglycatedHMCD59andHNCD59weredetectedbyBCECFreleasetest.ELISAwasusedtodetecttheserumconcentrationofPDGFBBandVEGFin30patientsoftypeⅡdiabeteswithoutvascularproliferatecomplicationand30typeⅡdiabetespatientswithvascularproliferatecomplication.RESULTS:

TheexpressionrateofHM1CD59,HM2CD59,HNCD59cellswas53.7%,54.5%and59.8%,respectively.BCECFreleasetestindicatedthereleaserateofglycatedHMCD59cellswashigherthanthatofunglycatedones（P0.01）whilenosignificantdifferenceswerefoundbetweennormalHNCD59cellsandglycatedones.TheserumconcentrationofPDGFBBandVEGFinpatientswithtypeⅡdiabetesmarkedlyincreased（P0.01）.CONCLUSION:

Thedecreaseofglycatedrestrictingcomplementmembraneattackcomplexresultsintheacceleratingofhumanvascularproliferatecomplicationofdiabetes.

　　[Keyword]CD59;eukaryoticexpression;glycation;complement;immunologicalmolecule

补体调节蛋白CD59通过干扰补体攻膜复合体（membraneattackcomplex,MAC）的形成,保护宿主细胞免受补体的攻击。

已有报道,MAC刺激内皮细胞释放成纤维细胞生长因子（basicfibroblastgrowthfactor,bFGF）及血小板衍生生长因子（plateletderivedgrowthfactor,PDGF）,这两种因子可刺激成纤维细胞、平滑肌细胞、肾小球基底膜细胞和血管内皮细胞大量增殖[1],最终导致糖尿病血管病。

MAC在糖尿病血管壁的增长性沉积已有文献报道。

糖化被认为是糖尿病组织损伤的主要病理机制[2]。

如果被糖化的蛋白质单氨基靠近活性位点就会影响蛋白质的功能。

通过观察糖化蛋白的三维结构得以证实,糖化易发生于靠近咪唑基的氨基或赖赖氨基的一部分。

人类CD59NMR[3,4]结构揭示了蛋白质赖氨酸K41是糖化位点,它距离惟一含有咪唑基的组氨酸H44大约5。

而且,K41邻近CD59功能基团W40[5]。

这表明K41位点易于糖化使CD59失去活性。

根据人类CD59分子的结构,人们发现在高血糖环境下,在CD59易于糖基化的位点K41H44上确实存在基因突变,即HMCD59:

K38C39W40K41H42E43Q44C45N46F47（正常HCD59:

K38C39W40K41F42E43H44C45N46F47）,在糖尿病患者的尿液中已经提取出了此HMCD59,经测序得到证实。

　　基于此,本课题设计两种突变CD59cDNA序列连接于PALTER质粒转染CHO细胞,筛选高表达细胞株,通过BCECF释放试验证实了糖化人突变CD59在糖尿病血管并发症病理机制中的重要作用。

应用酶联免疫吸附实验法测定Ⅱ型糖尿病患者血清血小板衍生生长因子BB（PDGFBB）、血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）含量,探讨这些免疫分子与糖尿病血管病变发生发展之间的相关性。

　　1材料和方法

　　1.1材料CHO细胞株购自中科院上海细胞生物学研究所,大肠杆菌DH5α由本室保存。

pALTERMAX、pcDNA3由美国哈佛大学惠赠;2’,7’二羧乙基56羧基荧光素（BCECF）为Sigma产品;彩色蛋白质marker为Gibco产品。

Lipfectamine2000购自InvitrogenTMlifetechnologies。

PDGFBB、VEGF试剂盒由美国RDSYSTEMS公司提供。

Ⅱ型糖尿病无血管病变组30例,Ⅱ型糖尿病有血管病变组30例,均符合1997年美国糖尿病学会（ADA）诊断标准。

　　1.2方法

　　1.2.1目的基因的选择及引物设计

（1）目的基因的选择:

1号人突变CD59（HM1）42位（F）氨基酸突变为组氨酸（H）相应密码子CAT（H）取代TTT,即X37X38C39W40K41H42X43X44C45X46;2号人突变CD59（HM2）43位（E）氨基酸突变为组氨酸（H）相应密码子CAT（H）取代GAG,即X37X38C39W40K41X42X43H44C45X46。

（2）引物设计:

根据已公布正常人CD59基因及已构建CD59cDNA重组载体序列设计2对突变CD59基因引物序列,1对常规上下游引物（pT7,T3）根据待插入CD59cDNA模板两侧pT7、T3RNA聚合酶启动子序列设计。

每种突变基因再合成一对带有诱变位点的互补寡核苷酸引物（18F,18R）,2对突变引物长度均为28碱基,错配碱基位于中央。

引物序列如下:

常规引物pT7为5′TAATACGACTCACTATAGGC3′;常规引物T3为5′ATTAACCCTCACTAAAGGGA3′;HM1/F为5′AAGTGTTGGAAGCATGAGCAGTGCAATT3′;HM1/R为5′ATTGCACTGCTCATGCTTCCAACACTTG3′;HM2/F为5′GTGTTGGAAGTTTCATCAGTGCAATTTC3′;HM2/R为5′GAAATTGCACTGATGAAACTTCCAACAC3′。

　　1.2.2重组PCR定点突变获取目的突变基因EcoRI单酶切,T4连接酶连接,构建pALTERMAX突变CD59重组质粒,pALTERMAX结构图（图1）,pcDNA结构图均含有氨苄青霉素抗性基因pcDNA含G418抗性基因。

　　图1pALTERMAX结构图

　　Fig1ConstructionofpALTERMAX1.2.3人基因突变CD59重组质粒（pALTERCD59）的扩增及鉴定pALTERCD59质粒转化大肠杆菌DH5ɑ:

感受态细菌的制备;pALTERCD59质粒转化大肠杆菌DH5ɑ;阳性菌落的筛选;碱裂解法小提取pALTERCD59质粒。

pALTERCD59质粒的酶切鉴定:

以EcoRⅠ对碱裂解法获取的重组质粒DNA进行37℃过夜单酶切,注意标记好管号,同时设空pALTER质粒阴性对照,酶切产物进行12g/L的琼脂糖凝胶电泳,每孔加样品10μL,以及DNA标准分子量参照,观察结果,筛选含重组基因的转化子。

重组子的序列分析鉴定:

DNA自动序列测定仪测定并筛选出插入序列正确的细菌克隆,命名为pALTERHM1CD59和pALTERHM2CD59。

扩增提取质粒备用（1号2号重组质粒方法相同）。

　　1.2.4HMCD59、HNCD59转染CHO细胞应用F12培养基作转染及克隆筛选培养液、1640作细胞扩增培养液（含青霉素100g/L、链霉素100g/L及100mL/L新生牛血清）。

阳离子脂质体法介导pcDNA与pALTERCD59质粒共转染CHO细胞:

转染前1d,消化并按1×106细胞/孔的数量接种于24孔板中37℃、CO2孵箱培养24h,细胞达到80%～90%汇合;稀释1μLPALTECD59重组质粒于100μL血清培养基的转染管中,混匀;稀释1μL脂质体于100μL无血清培养基的转染管中,混匀,室温放置5min;混合稀释的质粒和脂质体,室温放置20～30min;无血清无双抗培养液洗细胞1次;将质粒和脂质体混合液加入细胞中,轻混;37℃、CO2孵箱培养4～6h;加入1mL含200mL/LFBS无双抗的培养液培养24h;2.5g/L胰酶消化2～3min,每孔分别取20μL、200μL、1.5mL于3个10mL完全培养液的大板中培养。

G418（400～800）mg/L筛选阳性克隆。

　　1.2.5HMCD59在CHO细胞中表达的检测

（1）流式细胞术检测并筛选高表达克隆:

2.5g/L胰酶消化pALTERCD59转染CHO细胞成单细胞悬液,细胞计数获取1×106个细胞,PBS洗3次,15