突变人CD59分子抗MAC沉积在糖尿病血管病中的作用.docx

1、突变人CD59分子抗MAC沉积在糖尿病血管病中的作用突变人CD59分子抗MAC沉积在糖尿病血管病中的作用（作者:_单位: _邮编: _） 【摘要】 目的: 研究糖化人突变(HM)CD59作为补体攻膜复合体(MAC)抑制物在糖尿病血管病病理机制中的重要作用。方法: 构建2种HMCD59重组质粒, 转染CHO细胞; FCM、 Western blot筛选高表达细胞。糖化, BCECF释放试验测定糖化HM CD59和糖化HN CD59抗补体活性。ELISA测定30例糖尿病无血管病变组和30例型糖尿病血管病组血清PDGF BB、 VEGF含量。结果: 筛选细胞株表达率分别为59.8%、 53.7%、

2、54.5%; BCECF释放试验显示糖化前转染突变CD59细胞比较糖化后细胞染料释放率低(P0.01); 而正常CD59细胞比较糖化后细胞染料释放率无统计学意义。 型糖尿病有血管病变组与糖尿病无血管病变组相比, 血清PDGF BB、 VEGF明显增高(P0.01)。结论: 证实HMCD59易糖化抗补体活性下降加速糖尿病血管病的发生发展。 【关键词】 CD59; 真核表达; 糖化; 补体; 免疫分子Abstract AIM: To investigate the function of human mutant CD59 in diabetic pathology. METHODS: The r

3、ecombinant PALTER MAX plasmid containing human mutant CD59 cDNA and pcDNA plasmid were cotransfected into CHO cells using cation lipoid mediating method. Highly expressed cells were selected by flow cytometry and Western blot, which were then cultivated in high glucose. The functions of restricting

4、complement membrane attack complex formation of glycated HMCD59 and HNCD59 were detected by BCECF release test. ELISA was used to detect the serum concentration of PDGF BB and VEGF in 30 patients of typediabetes without vascular proliferate complication and 30 typediabetes patients with vascular pro

5、liferate complication. RESULTS: The expression rate of HM1CD59, HM2CD59, HNCD59 cells was 53.7%, 54.5% and 59.8%, respectively. BCECF release test indicated the release rate of glycated HMCD59 cells was higher than that of unglycated ones (P0.01)while no significant differences were found between no

6、rmal HNCD59 cells and glycated ones. The serum concentration of PDGF BB and VEGF in patients with typediabetes markedly increased (P0.01). CONCLUSION: The decrease of glycated restricting complement membrane attack complex results in the accelerating of human vascular proliferate complication of dia

7、betes.KeywordCD59; eukaryotic expression; glycation; complement; immunological molecule补体调节蛋白CD59通过干扰补体攻膜复合体(membrane attack complex, MAC)的形成, 保护宿主细胞免受补体的攻击。已有报道, MAC刺激内皮细胞释放成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)及血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor, PDGF), 这两种因子可刺激成纤维细胞、 平滑肌细胞、 肾小球基底膜细

8、胞和血管内皮细胞大量增殖1, 最终导致糖尿病血管病。MAC在糖尿病血管壁的增长性沉积已有文献报道。糖化被认为是糖尿病组织损伤的主要病理机制2。如果被糖化的蛋白质单氨基靠近活性位点就会影响蛋白质的功能。通过观察糖化蛋白的三维结构得以证实, 糖化易发生于靠近咪唑基的氨基或赖 赖氨基的一部分。人类CD59NMR3, 4结构揭示了蛋白质赖氨酸K41是糖化位点, 它距离惟一含有咪唑基的组氨酸H44大约 5 。而且, K41邻近CD59功能基团W405。这表明K41位点易于糖化使CD59失去活性。根据人类CD59分子的结构, 人们发现在高血糖环境下, 在CD59易于糖基化的位点K41 H44上确实存在基因

9、突变, 即HMCD59: K38 C39 W40 K41 H42 E43 Q44 C45 N46 F47(正常HCD59: K38 C39 W40 K41 F42 E43 H44 C45 N46 F47), 在糖尿病患者的尿液中已经提取出了此HMCD59, 经测序得到证实。基于此, 本课题设计两种突变CD59cDNA序列连接于PALTER质粒转染CHO细胞, 筛选高表达细胞株, 通过BCECF释放试验证实了糖化人突变CD59在糖尿病血管并发症病理机制中的重要作用。应用酶联免疫吸附实验法测定型糖尿病患者血清血小板衍生生长因子BB(PDGF BB)、 血管内皮生长因子(vascular endot

10、helial growth factor, VEGF)含量, 探讨这些免疫分子与糖尿病血管病变发生发展之间的相关性。1 材料和方法1.1 材料 CHO细胞株购自中科院上海细胞生物学研究所, 大肠杆菌DH5由本室保存。pALTER MAX、 pcDNA3由美国哈佛大学惠赠; 2, 7 二羧乙基 5 6羧基荧光素(BCECF)为Sigma产品; 彩色蛋白质marker为Gibco产品。Lipfectamine 2000购自InvitrogenTMlife technologies 。PDGF BB、 VEGF试剂盒由美国RD SYSTEMS公司提供。型糖尿病无血管病变组30例, 型糖尿病有血管病变

11、组30例, 均符合1997年美国糖尿病学会(ADA)诊断标准。1.2 方法1.2.1 目的基因的选择及引物设计 (1)目的基因的选择: 1号人突变CD59(HM1) 42位(F)氨基酸突变为组氨酸(H)相应密码子CAT(H)取代TTT, 即X37 X38 C39 W40 K41 H42 X43 X44 C45 X46; 2号人突变CD59(HM2)43位(E)氨基酸突变为组氨酸(H)相应密码子CAT(H)取代GAG, 即X37 X38 C39 W40 K41 X42 X43 H44 C45 X46。(2)引物设计: 根据已公布正常人CD59基因及已构建CD59cDNA重组载体序列设计2对突变C

12、D59基因引物序列, 1对常规上下游引物(pT7, T3)根据待插入CD59cDNA模板两侧pT7、 T3 RNA聚合酶启动子序列设计。每种突变基因再合成一对带有诱变位点的互补寡核苷酸引物(1 8F, 1 8R), 2对突变引物长度均为28碱基, 错配碱基位于中央。引物序列如下: 常规引物pT7为5 TAA TAC GAC TCA CTA TAG GC 3; 常规引物T3为5 ATT AAC CCT CAC TAA AGG GA 3; HM1/F为5 AAG TGT TGG AAG CAT GAG CAG TGC AAT T 3; HM1/R为5 ATT GCA CTG CTC ATG CTT

13、 CCA ACA CTT G 3; HM2/F为5 G TGT TGG AAG TTT CAT CAG TGC AAT TTC 3; HM2/R为 5 GAA ATT GCA CTG ATG AAA CTT CCA ACA C 3。1.2.2 重组PCR定点突变获取目的突变基因 EcoR I单酶切, T4连接酶连接, 构建pALTER MAX 突变CD59重组质粒, pALTER MAX结构图(图1), pcDNA结构图均含有氨苄青霉素抗性基因pcDNA 含G418抗性基因。图1 pALTER MAX结构图Fig 1 Construction of pALTER MAX1.2.3 人基因突变C

14、D59重组质粒(pALTER CD59)的扩增及鉴定 pALTER CD59质粒转化大肠杆菌DH5: 感受态细菌的制备; pALTER CD59质粒转化大肠杆菌DH5; 阳性菌落的筛选; 碱裂解法小提取pALTER CD59质粒。pALTER CD59质粒的酶切鉴定: 以EcoR对碱裂解法获取的重组质粒DNA进行37过夜单酶切, 注意标记好管号, 同时设空pALTER质粒阴性对照, 酶切产物进行12 g/L的琼脂糖凝胶电泳, 每孔加样品10 L, 以及DNA标准分子量参照, 观察结果, 筛选含重组基因的转化子。重组子的序列分析鉴定: DNA自动序列测定仪测定并筛选出插入序列正确的细菌克隆, 命

15、名为pALTER HM1CD59和pALTER HM2CD59。扩增提取质粒备用(1号2号重组质粒方法相同)。1.2.4 HMCD59、 HNCD59转染CHO细胞 应用F12培养基作转染及克隆筛选培养液、 1640作细胞扩增培养液(含青霉素100 g/L、 链霉素100 g/L及100 mL/L新生牛血清)。阳离子脂质体法介导pcDNA与pALTER CD59质粒共转染CHO细胞: 转染前1 d, 消化并按1106细胞/孔的数量接种于24孔板中37、 CO2孵箱培养24 h, 细胞达到80%90%汇合; 稀释1 L PALTE CD59重组质粒于100 L血清培养基的转染管中, 混匀; 稀释

16、1 L脂质体于100 L无血清培养基的转染管中, 混匀, 室温放置5 min; 混合稀释的质粒和脂质体, 室温放置2030 min; 无血清无双抗培养液洗细胞1次; 将质粒和脂质体混合液加入细胞中, 轻混; 37、 CO2孵箱培养46 h; 加入1 mL含200 mL/L FBS无双抗的培养液培养24 h; 2.5 g/L胰酶消化23 min, 每孔分别取20 L、 200 L、 1.5 mL于3个10 mL完全培养液的大板中培养。G418(400800) mg/L筛选阳性克隆。1.2.5 HMCD59在CHO细胞中表达的检测 (1)流式细胞术检测并筛选高表达克隆: 2.5 g/L胰酶消化pALTER CD59转染CHO细胞成单细胞悬液, 细胞计数获取1106个细胞, PBS洗3次, 1 5