二甲基β环糊精他克莫司包合络合物白蛋白毫微粒的制备特征和药物代谢动力学研究.docx
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二甲基β环糊精他克莫司包合络合物白蛋白毫微粒的制备特征和药物代谢动力学研究
二甲基-β-环糊精他克莫司包合络合物白蛋白毫微粒的制备、特征和药物代谢动力学研究
文献来源：
InternationalJournalofPharmaceutics427（2012）410–416
翻译者：
1042705张怡頔1042831徐熙
作者ShanshanGao（b）,JunSun（b）,DongjunFu（b）,HongliZhao（a）,MinboLan（a）,FengGao（a,b,c,∗）
（a）华东理工大学上海化学功能材料重点研究所
（b）华东理工大学大学药学院制药部
（c）华东理工大学上海新药设计重点研究所
文章信息：
文章历史2011年11月15日收到
从2011年12月30日开始校正
2012年1月24日发表
2012年2月2日网上提供
关键词：
二甲基-β-环糊精他克莫司包合络合物
白蛋白毫微粒
持续释放
摘要：
本实验的研究目的是为临床上的抗癌试剂他克莫司找到一种新的能显著降低严重副作的处方。
结果发现一种新型的处方：
用超声波将他克莫司和一种亲水性的环糊精衍生物-二甲基-β-环糊精（药物辅料）络合。
复合显示器结果出人意料地表明这种方法提高了他克莫司的溶解度。
牛血清白蛋白毫微粒通过148.4到262.9nm的胶体分散的方法从已经完成的二甲基-β-环糊精他克莫司包合络合物络直接制备。
毫微粒的稳定胶体分散体是在-24.9到-38.4毫伏的电位之间形成的。
他克莫司的包封效率提高了1.57倍之高。
另外，特别值得注意的是，他克莫司持续不变地从毫微粒中释放。
作为证明，药物代谢动力学研究表明，与直接由牛血清白蛋白包合的毫微粒比较，二甲基-β-环糊精他克莫司包合络合物牛血清白蛋白毫微粒明显提高了药物的峰值、半衰期和平均滞留时间，降低了最大浓度。
总之，这些结果都表明这种改良的递送方法对于不充分溶解的他克莫司及其衍生物有了及其重要的提高。
1.介绍
他克莫司（FK506，分子量822.05，水溶性为1.3ug/ml），是一种从链霉菌属中分离出的有免疫抑制作用，且在临床上被用来对肝脏和肾脏移植后器官自我免疫排斥起预防作用的疏水大环内脂。
近来，有报道称，他克莫司可以通过与红细胞和血浆蛋白紧密结合在体内广泛分布。
但是，这种分布受个人差异和给药途径的不同所影响。
举例来说，胃肠道因为有很低的生物利用度和副作用，只有一个很窄的治疗窗。
另外，他克莫司显示有很低的口服生物利用度和一个吸收差异性的宽量程，对于肾和肝移植的患者来说，从4%到89%。
对于静脉给药，由于其低溶解度，经常使用一些会诱导毒性的助溶剂和注射用油。
β-环糊精及其衍生物作为普遍的增溶剂时，由于其低的生物毒性和高的生物相溶性获得了可观的注意力。
作为药物包容物的吸引人的材料，β-环糊精可以被进一步地化学改性来提高它的理化性质。
很多研究表明加入β-环糊精可以提高毫微粒的负载效率，降低药物的释放。
Ferreira和合作者制备了羟丙基β-环糊精的包合络合物，且药物的水溶解度成线性增加。
（2,6）-二甲基-β-环糊精，一种β-环糊精的衍生物，其空腔深度和表面活性很好地改良了，就像其溶解度也增加了25倍之多。
人们已经开始探测各种β-环糊精衍生物在肾异体移植中可以提高溶解效果和他克莫司的稳定性。
二甲基β-环糊精已经被发现其在提高他克莫司的溶解度和稳定性有神奇的作用。
现代毫微技术被认为是一种新出现的会聚的技术，被称为21世纪最重要的技术之一。
毫微技术被广泛认为有巨大的潜力，能给研究和应用的很多领域带来好处。
研究表明，白蛋白毫微粒对填充的亲水药物有更高的负载量，能更好地控制释放和稳定储存。
此外，白蛋白有几种特别的性质，包括安全性，无毒性，无免疫原性，生物可降解性和生物相容性。
因此，白蛋白可以充当很好的药物给药传递系统。
在药物的释放之后，白蛋白毫微粒可以通过代谢分解被机体吸收，却不会产生有害的残渣物质。
另外，白蛋白分子有许多官能团，因此考虑不同的目的可以方便地职能化。
一般制备白蛋白毫微粒的方法包括超声波乳化法、去溶剂化法、PH凝固法和盐析法等等。
对于去溶剂法，几种因素会影响白蛋白毫微粒，比如药物、白蛋白的剂量、白蛋白毫微粒的制备包括脱水剂、交联剂、PH、交联时间和搅拌速度。
通过白蛋白的携带作用，白蛋白毫微粒可以通过固化和分离成为固体的球状物。
它们可以装入胶囊，吸附不同种类的药物比如多肽、基因而应用于各种疾病。
受控制的白蛋白毫微粒存储器不仅可以减轻毒性，当用于静脉注射时，还可以获得确定的持续性作用。
目前，关于他克莫司装载毫微粒的研究基本着重于使用聚乳酸和丙烯酸作为载体材料。
而关于二甲基-β-环糊精他克莫司包合络合物白蛋白毫微粒的研究还未发表。
现在研究的目的就是制定一个新颖的毫药物递药系统（NDDS），二甲基-β-环糊精他克莫司包合络合物白蛋白毫微粒。
首先，他克莫司通过超声波的方法与二甲基-β-环糊精形成络合物来合成到亲水的环糊精衍生物上。
接下来，二甲基-β-环糊精他克莫司包合络合物牛血清白蛋白毫微粒通过去溶剂-化学交联法制备。
其理化被确定（捕获效率，装填效率，体外释放，显像白蛋白的容量分配）。
另外，这些毫微粒的药物动力学参数在肾体外移植时被调查。
2.材料和方法
2.1化学原料和试剂
他可莫司（FK506，纯度大于99.1%）从中国上海桥化学药品有限公司购得。
β-环糊精（纯度大于99.0%）从中国上海开阳生物技术有限公司购得。
牛血清白蛋白（BSA，纯度96-99%）从中国上海原聚生物技术有限公司购得。
戊二醛是从中国药学会上海化学试剂公司获得。
实验中用到的雄性大鼠是由复旦大学动物科学实验室经学校伦理委员会同意之后提供的。
本次研究中用到的其它试剂都是高效液相色谱试剂或等级试剂。
2.2他可莫斯高效液相色谱法体内体外的测定
用一种改良的反相高压液相层析系统对他可莫斯进行测定。
这个系统包括：
两个模型LC-10ADvp泵,一个SPD-10AVP二极管阵列紫外线Vis探测器以及一个SCL-10AVP系统控制器。
色谱分离是建立在一个Platisil（铂金）ODS反相C18柱（4.6mm×250mm,5μm,Dikma,北京,中国）。
流动相是由乙腈与水按体积比60：
40的比例组成，并用正磷酸调节Ph至2.7，在室温下以1.0 ml/min的平稳流量混合。
检测波长定在215nm吸光度。
注射体积20 μl，保留时间9.8min。
他可莫斯测定出来的标准曲线在溶液浓度范围内显示出很好的线性关系。
测定的有效性在老鼠血浆样本的分析检验上得到了证实。
2.3空白牛血清白蛋白毫微粒的制备
空白牛血清白蛋白毫微粒用前人描述过的去溶剂化技术（HermannJosephMuller，1996）制备。
实验中，分别用2ml的10，25，50，75，100和150 mg/ml，10mM氯化钠浓聚物溶解牛血清白蛋白，并且用滴定的方法将各个溶液的PH调至2，3，4，5，6，7，8，9，10，11和12.在室温的条件下，600转每分钟的搅拌速度连续加入4-8ml乙醇就可以将牛血清白蛋白转变成毫微粒。
乙醇的加入用一个恒流泵来实现以确保毫微粒的生成率在1.0ml/min。
在去溶剂化过程中，含水4.17%戊二醛溶液的加入确保了颗粒的稳定性。
混悬液在室温下搅拌18个小时就可以实现交联的过程。
合成的毫微粒在12000rpm反复离心20分钟可以被纯化，并且在水中用超声处理实现再分散可以去除辅料如：
乙醇和戊二醛。
用3%甘露醇作为低压冻干保护试剂进行冷冻干燥就可以得到干燥的毫微粒。
2.4牛血清白蛋白毫微粒的降解
毫微粒的讲解是由胰岛素决定的。
牛血清白蛋白毫微粒作为上面除了粒子稳定的程度之外被准备。
一些已知数量干燥的牛血清白蛋白毫微粒被放置在ph6.8的磷酸盐缓冲液中，并且分为有1%胰岛素和没有胰岛素，在37°C水浴中培养。
用紫外分光光度计（T6-1650F,中国北京）565nm波长测得毫微粒悬浮液的浑浊度。
牛血清白蛋白毫微粒制剂由三个独立的样本值得。
分析结果取样本平均值和标准差。
（1）降解率（%）=（毫微粒的初始浓度–t时间毫微粒的浓度）/毫微粒的初始浓度
2.5牛血清白蛋白的膨胀
牛血清白蛋白毫微粒的膨胀度在软水里24小时后可得。
把已知重量的牛血清白蛋白毫微粒分散在水里，并且以150rpm震摇。
在37摄氏度经过一段时间后，以12000rpm的速度对悬浮液离心20分钟，所得沉淀进行称重。
膨胀度按公式
（2）进行计算：
（2）膨胀度=（毫微粒的湿重–毫微粒的干重）/（毫微粒的干重）X100%
2.6二甲基-β-环糊精他克莫司包合络合物的制备
二甲基-β-环糊精他克莫司包合络合物以1:
3,1:
5或1:
10的比例用超声波的方法制得（Hirayama等人，1996）。
称计算好重量的他可莫斯和二甲基-β-环糊精，并溶解在50%或70%的乙醇溶液中，在特定的温度下彻底超声15到30分钟。
待溶剂蒸发完之后，洗涤二甲基-β-环糊精他克莫司包合络合物固体两次，在室温下减压干燥，并存储在干燥器中。
2.7他克莫司牛血清白蛋白毫微粒的制备
用去溶剂方法制备他克莫司牛血清白蛋白毫微粒。
在室温条件下，分别取1ml溶解在乙醇中浓度为：
0，2，2.5，3，3.5，4和5mg/ml的他可莫斯溶液加到2ml牛血清白蛋白溶液浓度为50mg/ml中。
在室温下，800rpm搅拌速度连续加入3ml乙醇可以使得牛血清白蛋白毫微粒变形。
接下来的步骤按2.2中所描述的进行。
2.8二甲基-β-环糊精他克莫司包合络合物白蛋白毫微粒的制备
为了制得二甲基-β-环糊精他克莫司包合络合物白蛋白毫微粒，分别取18，21，24，30，45和60mg二甲基-β-环糊精他克莫司包合络合物溶解在2ml牛血清白蛋白溶液中，在室温条件下，600rpm速度不断搅拌，用管式泵以1ml/min速度加入4ml乙醇。
接下来的步骤按2.2中所描述的进行。
2.9牛血清白蛋白毫微粒的物理化学性质
制备的毫微粒的平均粒径，尺寸分布和电位差是由DB—525激光粒子尺寸仪（Brookhaven仪器公司，美国）的动态光散射决定的。
冷冻干燥过的毫微粒的生态学检查是用电子显微镜扫描（SEM）。
毫微粒是冷冻干燥的，被铂包裹着，用一台扫描电子显微镜（JSM-6360LV,JEOLLtd.,东京，日本）观察到。
2.10牛血清白蛋白毫微粒的产率
制备好毫微粒之后，毫微粒的上浮物用12000rpm，4摄氏度离心20分钟可以实现分离。
用软化水稀释过的上浮物用考马斯亮蓝培养10分钟。
用紫外分光光度法（GeneralAnalysisofGeneralInstrument,北京，中国）595nm波长对牛血清白蛋白进行测定（Bradford,1976）。
标准曲线方程被用来计算结晶出的牛血清白蛋白的浓度。
（3）产率（%）=（毫微粒中牛血清白蛋白的重量/牛血清白蛋白的总量）X100%
2.11包封率和填充率
制备好毫微粒之后，我们收集上浮物并在其中加入乙醇使蛋白质沉淀。
他可莫斯在上浮物中的浓度由高效液相测得。
包封率和填充率按如下公式计算。
（4）包封率（%）=（毫微粒中他可莫斯的重量/他可莫斯的总重量）X100%
（5）填充率（%）=（毫微粒中他可莫斯的重量/毫微粒的总重量）X100%
2.12毫微粒的体外药物释放
用潜伏期的方法调查二甲基-β-环糊精他克莫司包合络合物白蛋白毫微粒的药物释放。
10mg毫微粒悬浮在50ml包含0.1%（v/v）吐温-80，ph为7.4的磷酸缓冲盐溶液中，用恒温（37.0 ± 0.5 °C）水浴加热保持100rpm振颤。
在不同的时间间隔，样本撤回，用相同体积的新鲜磷酸缓冲盐溶液替代，样本用0.22微米过滤装置过滤并用高效液相分析。
积聚的释放百分比在每一个时间段计算。
2.13动物实验
雄性大鼠（250 ± 15 g）,前一整晚禁食，由静脉注射一剂量相同量他可莫斯0.5mg/kg。
注射前，他可莫斯乙醇溶液用保护液稀释。
九只老鼠被任意的分为三组。
组A:
他可莫斯给药组；组B：
他可莫斯牛血清白蛋白毫微粒给药组；组C：
二甲基-β-环糊精他克莫司包合络合物白蛋白毫微粒给药组。
血样（0.2ml）是在一个特定的时间段从老鼠尾巴血管抽得的。
将血样进行离心得到血浆（100 μl）。
在血浆中加入2ml乙醚并混合2分钟。
所得混合物1000rpm离心2分钟，上层物质（1.5ml）用氮气转移干燥。
残渣溶解在200 μl流动相中，他可莫斯在血浆中的浓度有高效液相测得。
2.14统计分析
多个组比较是由单向方差分析（方差分析）,然后通过LSD使用统计软件（SPSS,芝加哥）。
所有的数据都取其平均值和标准差。
P-值小于0.05在统计学上被认为是有意义的。
3.结果与讨论
3.1空白牛血清白蛋白毫微粒的制备和鉴定
在这个研究中，我们研究了PH、牛血清白蛋白浓度和乙醇剂量对产率的影响和制备的空的牛血清白蛋白毫微粒的平均颗粒大小。
（见表一）当PH值大于12或小于3时，牛血清白蛋白毫微粒由于过量的电荷无法形成。
当PH值在4或者11时，牛血清白蛋白毫微粒获得很低的产率（<30%）。
牛血清白蛋白毫微粒在PH为5或6时聚集因为这时的PH很接近牛血清白蛋白的等电点（PH5.4），这可能会导致牛血清白蛋白溶解度的急剧下降，从而产生的很多的沉淀和聚合物。
但是，牛血清白蛋白毫微粒在PH为7到9时获得理想的直径。
当牛血清白蛋白的浓度大于150mg/ml时，很少量的乙醇添加就很容易导致聚集。
当牛血清白蛋白浓度小于10mg/ml时，4ml乙醇的添加对于牛血清白蛋白的沉降是过量的。
乙醇使用得越多，牛血清白蛋白去溶剂化的程度越高，会导致毫微粒的产率变高，但是牛血清白蛋白毫微粒直径会有轻微增加。
基于这些研究，我们获得了理想的牛血清白蛋白毫微粒的制备条件：
当牛血清白蛋白的浓度为50mg/ml，乙醇消耗量为4ml时，8-9的PH会得到平均直径为148.4–151.4nm，产率在97.5±0.1%，球状分布良好的牛血清白蛋白毫微粒。
表一：
通过化学交联去溶剂法鉴定牛血清白蛋白毫微粒（平均数±SD,n=3）
pH
牛血清白蛋白浓度（mg/ml）
乙醇（ml）
形态
产率（%）
颗粒大小（nm）
多分散性索引
2
50
8
Unformed
–
–
–
3
50
8
Unformed
–
–
–
4
50
4
Spherical
<30
–
–
5
50
4
Aggregated
–
–
–
6
50
4
Aggregated
–
–
–
7
50
4
Spherical
96.3 ± 0.06
284.6 ± 14.9
0.12
8
10
4
Aggregated
–
–
–
8
25
4
Spherical
99.9 ± 0.06
191.9 ± 4.2
0.24
8
50
4
Spherical
97.0 ± 0.10
151.4 ± 9.0
0.28
8
75
4
Spherical
96.2 ± 0.06
284.6 ± 1.9
0.18
8
100
4
Spherical
95.2 ± 0.15
296.9 ± 11.0
0.03
8
150
4
Aggregated
–
–
–
8
50
5
Spherical
99.0 ± 0.06
217.0 ± 11.1
0.11
8
50
6
Spherical
99.5 ± 0.10
221.3 ± 3.2
0.19
8
50
8
Spherical
99.8 ± 0.12
270.5 ± 15.8
0.23
9
50
4
Spherical
97.5 ± 0.06
148.4 ± 7.9
0.31
10
50
4
Spherical
96.4 ± 0.10
170.4 ± 5.3
0.28
11
50
4
Spherical
<30
–
–
12
50
4
Unformed
–
–
–
3.2牛血清白蛋白毫微粒的降解和溶胀
我们调查了有酶和无酶情况下牛血清白蛋白毫微粒的降解。
在无1%胰蛋白酶时，24小时只有低于3%的牛血清白蛋白毫微粒降解；而又胰蛋白酶时，获得了18.8%的降解。
由于其水合作用，白蛋白毫微粒在有水环境下会溶胀。
伴随着水合作用，小孔、空穴和通道会在微粒基质中出现。
牛血清白蛋白毫微粒的溶胀程度在0.5个小时达到83%，在2个小时后降到40.4%。
在动态平衡的过程后，溶胀程度稳定在45.4%。
研究表明，在初级阶段，毫微粒通过孔道吸收快速溶胀，这样就会使药物迅速释放到毫微粒的表面。
在达到平衡后，药物通过框架和毫微粒的分解作用缓慢释放。
在现在的研究中，我们认为携带物只有一点持续释放作用。
图一在PBS中牛血清白蛋白毫微粒的降解过程。
牛血清白蛋白毫微粒在PBS中有酶和无酶情况下（PH6.8）。
牛血清白蛋白毫微粒直径为148.4±7.9nm（就如表一所示）。
图二牛血清白蛋白毫微粒在水中的溶胀程度。
牛血清白蛋白毫微粒的直径为148.4±7.9nm（如表一所示）
3.3二甲基-β-环糊精他克莫司包合络合物的制备和鉴定
这个包和络合物是通过超声波的方法制备的。
我们发现二甲基-β-环糊精他克莫司包合络合物的重量比率会影响捕获效率，且包封率比乙醇浓度更重要。
（表二）但是，在超声波使用得过程中，沉淀在使用50%乙醇作为溶剂后的几天出现在管子的底部。
这表明一些他克莫司由于其50%的乙醇中有限的溶解度从二甲基-β-环糊精他克莫司包合络合物释放出来了。
因此，我们使用了75%的乙醇作为溶剂。
另一方面，较高的温度和更长的反应时间会导致更好的捕获效率和包封率，因为增加的温度或者延伸的超音时间会增加他克莫司分子和二甲基-β-环糊精的接触，从而使包和络合物的形成更简单。
根据单一因素实验，最好的形成条件是：
保持二甲基-β-环糊精和他克莫司的比率是5：
1；75%的乙醇溶液；在40摄氏度在超声波下30分钟。
二甲基-β-环糊精他克莫司包合络合物的捕获效率，包封率和产率分别是57.3±2.7%，12.4±0.3%和76.8±2.1%。
由于二甲基-β-环糊精的加入，他克莫司的溶解度增加了200倍之多。
这表明二甲基-β-环糊精的空穴能更好地与他克莫司分子结合在一起。
有关温度增加和超声波时间延长对他克莫司稳定性的影响的研究还是需要的。
表二通过超声波实验制备二甲基-β-环糊精他克莫司包合络合物的鉴定
FK506:
DM-β-CD比值（w/w）
温度（°C）
时间（min）
乙醇（%）
捕获效率（%）
包封率（%）
产率（%）
1:
3
20
15
75
16.7 ± 2.9
5.6 ± 0.7
71.0 ± 2.3
1:
5
20
15
50
20.4 ± 2.2
4.9 ± 0.5
72.5 ± 1.9
20
30
75
38.9 ± 2.3
8.8 ± 0.5
74.4 ± 1.6
40
15
75
25.0 ± 2.4
6.2 ± 0.6
76.3 ± 2.3
40
30
50
53.0 ± 2.9
12.0 ± 0.7
73.0 ± 1.5
40
30
75
57.3 ± 2.7
12.4 ± 0.3
76.8 ± 2.1
1:
10
20
15
75
71.0 ± 4.7
7.0 ± 0.3
82.7 ± 2.7
3.4二甲基-β-环糊精他克莫司包合络合物白蛋白毫微粒的制备和鉴定
在这个研究中，基于空的牛血清白蛋白毫微粒（图3A），我们获得了他克莫司白蛋白毫微粒（图3B）和二甲基-β-环糊精他克莫司包合络合物白蛋白毫微粒（图3C）。
他克莫司浓度对白蛋白毫微粒性质影响（表三）当他克莫司的浓度从0变为10mg/ml时，毫微粒的直径从148.4增加到262.9nm，这样可能会与更多的他克莫司或者二甲基-β-环糊精他克莫司包合络合物的包裹有关。
毫微粒的直径应该在100到270nm之间，这样有助与白蛋白进入体循环。
另一方面，当他克莫司的浓度增加时，尽管包封率轻微提高了，但是更多的药物在毫微粒的表面装配，这会使电动势从−38.4mV改变为−24.9mV。
相同的他克莫司浓度，二甲基-β-环糊精他克莫司包合络合物白蛋白毫微粒的捕获效率是他克莫司白蛋白毫微的1.57倍。
这可能是因为亲水的牛血清白蛋白很难将疏水的他克莫司包裹住。
相反地，难溶的他克莫司对于亲水外表面可以很容易就包住牛血清白蛋白的二甲基-β-环糊精的疏水空腔是很适合的，因此会提高他克莫司的溶解度和保证了更多的他克莫司被包裹入二甲基-β-环糊精白蛋白毫微粒。
从大体上来说，考虑带大小，电位，特别是捕获效率，我们使用3.5mg/ml他克莫司来制备二甲基-β-环糊精他克莫司包合络合物白蛋白毫微粒，因为这时捕获效率最大达到95.5±0.5%。
图3牛血清白蛋白毫微粒的扫描电子显微照片（A）空的牛血清白蛋白毫微粒（B）他克莫司白蛋白毫微粒（C）二甲基-β-环糊精他克莫司包合络合物白蛋白毫微粒
表三通过化学交联去溶剂法鉴定二甲基-β-环糊精他克莫司包合络合物白蛋白毫微粒
他克莫司浓度（mg/ml）
FK506/DM-β-CD（w/w）
捕获效率（%）
包封率（%）
颗粒大小e（nm）
分散性索引
电位（mV）
产率（%）
0
0/0
–
–
148.4 ± 7.9
0.21
−37.8 ± 0.3
97.5 ± 0.1
0/18
–
–
225.1 ± 10.3
0.24
−38.0 ± 0.3
95.9 ± 0.4
2
2/0
43.9 ± 1.7
0.88 ± 0.04
183.2 ± 2.1
0.27
−27.5 ± 0.5
98.1 ± 0.2
2.5
2.5/0
40.7 ± 0.4
1.02 ± 0.01
217.3 ± 4.1
0.21
−28.1 ± 0.6
97.7 ± 0.2
3
3/0
41.6 ± 1.4
1.25 ± 0.04
219.0 ± 9.2
0.25
−27.7 ± 0.2
97.6 ± 0.1
1/5
83.4 ± 1.1
2.12 ± 0.07
225.8 ± 1.1
0.13
−33.3 ± 0.2
94.7 ± 0.3
3.5
3.5/0
60.6 ± 2.5
2.12 ± 0.09
218.5 ± 6.0
0.26
−26.4 ± 0.4
97.6 ± 0.2
1/5
95.5 ± 0.5
3.20 ± 0.04
245.2 ± 7.5
0.15
−38.4 ± 0.5
95.6 ± 0.3
4
4/0
31.5 ± 0.4
1.74 ± 0.12
220.1 ± 3.4
0.15
−33.1 ± 0.3
93.8 ± 0.4
1/5
37.2 ± 4.2
1.49 ± 0.17
224.5 ± 6.1
0.21
−35.5 ± 0.8
97.5 ± 0.1
5
5/0
29.5 ± 3.0
1.47 ± 0.15
233.5 ± 5.3
0.18
−30.2 ± 0.3
96.5 ± 0.2
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