微生物实验报告2.docx
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微生物实验报告2
微生物学大试验
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1.培养基配置及消毒灭菌
1.1通用培养基配制（液体、固体、半固体三种）
1.1.1试验目
（1）了解配制微生物培养基原理和培养基种类。
（2）掌握配制微生物通用培养基通常方法和操作步骤。
1.1.2试验原理
培养异养细菌最常见培养基是牛肉膏蛋白胨培养基,它是一个天然培养基。
牛肉膏是牛肉浸液浓缩物,含有丰富营养物质,它不仅能为微生物提供碳源、氮源,还含有多个维生素。
蛋白胨是酪蛋白、大豆蛋白或鱼粉等经蛋白酶水解后中间产物,含有䏡、胨和氨基酸等丰富含氮素营养物,所以完全能满足大多数异养细菌对营养需要。
1.1.3材料和器皿
（1）试剂:
牛肉膏、蛋白胨,NaCl,1mol/LNaOH,1mol/LHCl。
（2）器皿:
台秤,玻璃烧杯,搪瓷烧杯,三角瓶,量筒,漏斗,试管,玻璃棒等。
（3）其她:
pH试纸,牛角匙,牛皮纸,棉花,纱绳,灭菌锅等。
1.1.4方法和步骤
1.配制牛肉膏蛋白胨培养基
（1）配方及配量:
牛肉膏1.5g,蛋白胨5g,NaCl2.5g,琼脂（固体6g半固体0.4g液体不加）蒸馏水500ml
（2）称取药品:
根据营养基配方与配量分别称取各药品,取少于总量水于烧杯中,将培养基成份（琼脂除外）逐一加入水中待溶。
（3）加热溶解:
将烧杯放在石棉网上,用文火加热,并不停用玻璃棒搅拌,使各药品快速溶解,然后补水至500ml。
（4）调整pH:
用1mol/lNaOH调pH至7.2—7.4.避免调过碱,应缓慢加入,边加入边搅拌,并用pH试纸测酸碱度值。
（5）分装:
将配制好培养基分装到对应玻璃器皿中,并在固体和半固体培养基中加入琼脂,贴好标签,待灭菌。
1.2加压蒸汽灭菌法
1.2.1试验目
知道加压蒸汽灭菌原理及其安全使用注意事项。
1.2.2试验原理
以加热密封锅体内水和水蒸气压力来提升锅体内蒸汽温度而达成对物品灭菌目。
1.2.3方法和步骤
（1）加水:
取出装料桶,往锅内加水至与搁架圈一样高度为止。
（2）装料:
将待灭菌物品放入装料桶内并放回锅。
（3）加盖
（4）排气:
在水煮沸后,以蒸汽驱赶锅内空气沿排气软管从排气阀中溢出,待空气排尽后,才可关闭气阀继续加热。
（5）升压、保压、降压
（6）取料
1.2.4注意事项
（1）注意检验锅体和锅盖上部件是否完好,并严格根据操作程序进行,避免发生各类意外事故。
（2）灭菌时切勿私自离开岗位,要注意压力表指针动态;要按培养基中营养成份耐热程度来设置合理灭菌温度与时间,以免营养成份过多被破坏。
（3）务必待锅压下降到零后再打开排气阀和锅盖,不然因锅内压力忽然下降,使瓶装培养基或其她液体因压力瞬时下降而发生复沸腾,从而造成瓶内液体沾湿棉塞或溢出等事故。
（4）在放入灭菌料桶前,切记应往锅体内加入适量水,若锅体内无水或水量不够等均会造成在灭菌时引发重大事故。
2.大肠杆菌接种方法（穿刺接种法和液体接种法）
2.1穿刺接种法
2.1.1试验材料目
掌握穿刺接种法并观察细菌在半固体培养基中运动力。
2.1.2试验原理
穿刺接种法就是用接种针挑取少许菌苔,直接刺入半固体直力柱培养基中央一个接种法。
2.1.3方法和步骤
1、接种前准备
（1）标明菌名
（2）旋松棉塞（3）点燃酒精灯
2、穿刺接种法（直握法）
（1）挑取菌种:
在超净台中,酒精灯旁,左手持菌种管,右手拿接种针,经火焰灭菌后,用持针右手拔出试管塞,试管口过火灭菌后再将接种针伸入菌种管中,现在斜面上端冷却后挑取少许菌苔,移出接种针,管口再过火,塞上塞子,将菌种管放回试管架上。
（2）刺穿接种:
左手拿直立柱试管,在火焰旁用右手小指和掌边拔出塞子。
随之将试管口朝下,同时将接种针从直立柱培养基中央自下而上直刺到离管底1-1.5cm处（切勿穿透培养基）,然后沿原穿刺线拔出接种针。
管口过火,塞上塞子,插在试管架上。
（3）灭接种针上残菌:
将带有菌接种针在火焰上烧红,经灭菌后才能够放在桌面上。
随手再将塞子塞紧,以防脱落。
3、培养
将已接种直立柱试管置37℃恒温箱中,培养24h后取出,经过透射光目测细菌在穿刺线上生长情况,并统计结果。
4、接种后处理
（1）清洗:
将废弃菌种管塞子拔去,置水浴中煮沸20min,然后刷洗洁净,倒置于试管架上,沥干。
（2）整理:
清理桌面。
2.1.4试验结果
结果总体上来说算不错,穿刺线形状如玻璃棒,有扩散现象;边缘不整齐,这说明了大肠杆菌有鞭毛,可运动。
2.1.5注意事项
（1）半固体培养基琼脂用量依据琼脂牌号不一样而定。
其硬度判定,以培养基冷却凝固后,用手轻敲即碎为准。
为使培养基透明而不浑浊,配置培养基必需过滤。
（2）接种前应该将接种针拉直,穿刺时手要平稳,不可左右摆动。
（3）穿刺接种时,接种针不可穿透培养基。
2.2液体接种法
2.2.1试验目
掌握利用多种接种工具进行液体接种步骤及方法。
观察细菌在液体培养时群体特征。
2.2.2试验原理
在无菌操作条件下,用无菌接种环、滴管、移液管或移液枪等接种工具将斜面菌种或菌种悬液移接到液体培养基中一个方法。
在定量接种时可用移液管进行。
2.2.3方法与步骤
接种环接种
1、接种前准备
（1）标明菌名
（2）旋松棉塞（3）点燃酒精灯
2、接种操作关键点
左手持试管,右手拿接种环,在火焰上灭菌后,将接种环伸入菌种管中,现在斜面上端冷却后挑取少许菌苔转移到试管新鲜培养液中,让接种环在液面和管壁交界处反复摩擦及振荡,以洗下环上菌体,使其均匀分散入培养液中,然后移出接种环,塞上塞子,并立刻烧去环上菌体。
3、混匀培养液:
用拇指和中指捏住试管上部,食指摁住塞子,将试管底部在左手手掌心上轻拍振荡,使成团细菌细胞与培养液充足混匀。
4、适温培养:
将试管插于试管架上,置于37℃恒温箱中,培养24h后取出,观察细菌在液体培养基中生长特征,并统计结果。
2.2.4试验结果
没摇动前,液面微浑浊,有一层菌膜覆盖,
且管底有大量菌体沉淀,摇动后观察到液体有絮状
浑浊。
3.大肠杆菌菌种分离三种方法（平板划线法、平板涂布法和倾注法）
3.1平板划线法
3.1.1试验目
了解平板划线法分离菌种基础原理,并熟练掌握其操作方法。
3.1.2试验原理
平板划线法是指把杂菌样品经过在平板表面划线稀释而取得单菌落方法。
通常是将混杂在一起不一样种微生物或同种微生物群体中不一样细胞,经过在分区平板表面上作数次划线稀释,形成较多独立分布单个细胞,经培养而繁殖成相互独立多个单菌落。
通常认为这种单菌落就是某微生物纯种。
实际上同种微生物数个细胞在一起经过繁殖也能够形成一个单菌落,故在科学研究中,尤其在遗传学试验或菌种判定工作中,必需对试验菌种单菌落进行数次划线分离,才可取得可靠纯种。
具体划线形式有多个,现在关键说一个,将一个平板分成A、B、C、D4个面积不一样小区进行划线,A区面积最小,作为待分离菌菌源区,B和C为经过初步划线稀释过渡区,D区则是关键单菌落收获区,它面积最大,出现单菌落概率也最高。
由此可见,这4个区面积安排应该做到D>C>B>A。
3.1.3方法与步骤
1、倒平板
将冷却至50℃左右培养基按无菌操作方法倒入平板中,平置,待凝。
2、做分区标识
在皿底用笔划出4个不一样面积区域,使D>C>B>A,且各区夹角应为120°左右,方便使D区与A区所划出来线条平行、美观。
3、划线操作
（1）挑取菌样:
选择平整圆滑接种环,按无菌操作法挑取少许含菌试样。
（2）先划A区:
将平板倒置于煤气灯旁,用左手取出平板皿底,使平板表面大致垂直于桌面,并让平板面向火焰。
右手持含菌接种环,先在A区轻巧地划上3-4条连续平行线看成初步稀释菌源。
烧去接种环上残余菌样。
（3）划其它区:
将烧去残菌后接种环在平板培养基边缘冷却一下,并使B区转至划线位置,把接种环经过A区而移至B区,随即在B区轻巧地划上6—7条致密平行线,接着再以一样操作在C区和D区划上更多平行线,并使D区线条与A区平行（但不能与A或B区线条接触）,最终,将左手所持皿底放回皿盖中。
烧去接种环上残菌。
5、恒温培养
将划线后平板至28℃倒置培养2-3d。
6、挑单菌落
良好结果应该在C区出现部分单菌落。
而在D区出现较多独立分布单菌落。
然后从经典单菌落中挑取少许菌体至试管斜面,经培养后即为初步分离纯种。
7、清洗培养皿
将废弃带菌平板作煮沸杀菌后进行清洗、晾干。
3.1.4试验结果
有A、B、C、D四个区,且D区有单菌落出现,试验结果很好。
3.1.5注意事项
（1）为了取得良好划线效果,可事先用原纸垫在空培养皿内划上4个区,并用接种环练习划线动作,待经过模拟试验后熟练操作与掌握划线要领,再进行正式平板划线。
（2）用于划线接种环,环柄宜长些（约10cm）,环口应十分圆滑,划线时环口与平板间夹角宜小些,动作要轻巧,以防划破平板。
（3）用于平板划线培养基,琼脂含量宜高些（2%左右）,不然会因平板太软而被划破。
（4）平板不能倒得太薄,最好在使用前一天倒好。
为预防平板表面产生冷凝水,倒平板前培养基温度不能太高。
3.2涂布平板法和浇注平板法
3.2.1目
了解用浇注平板法和涂布平板法分离微生物纯种原理,并掌握相关具体操作方法。
3.2.2原理
浇注平板法和涂布平板法是两种最常见菌种分离纯化方法,它们不仅可用于分离纯化,还可用于计数等。
浇注平板法是将待分离试样用生理盐水等稀释液作梯度系列稀释后,取其中一适宜稀释度少许菌悬液加至无菌培养皿中,立刻倒入融化固体培养基,经充足混匀后,置适温下培养。
最终可从其表面和内层出现很多单菌落中,选择经典代表,将其转移到斜面上培养后保留,此即为初步分离纯种。
涂布平板法是指取少许梯度稀释菌落,置于已凝固无菌平板培养基表面,然后用无菌涂布玻棒把菌液均匀地涂布在整个平板表面,经培养后,在平板培养基表面会形成多个独立分布单菌落,然后挑取经典代表移接至斜面上培养后保留。
分离某一新菌种时,为确保所获纯种可靠性,通常可用上述方法反复分离数次来实现。
在上述两种方法中,浇注平板法较适合兼性厌氧细菌和酵母菌分离,而涂布平板法则更适于好氧性和有气生菌丝放线菌和细菌分离。
3.2.3方法和步骤
1、浇注平板法
（1）培养皿编号:
取6支无菌培养皿,分别编上10-4、10-5和10-63种稀释度（各2皿）。
（2）稀释菌样:
取6支无菌试管,依次编号10-1-10-6,在各管中分别加入生理盐水4.5ml,然后逐层稀释。
（3）吸收菌液:
从10-4、10-5和10-6各管中,分别吸出0.2ml菌液加至对应编号无菌培养皿中。
（4）浇培养基:
向各培养皿中分别倒入充足融化并冷却至45℃左右琼脂培养基,并立刻将培养基充足混匀,并立刻放平,待凝。
（5）恒温培养:
将含菌平板倒置在各组培养皿筒内,在37℃恒温箱中培养24h左右。
（6）挑单菌落:
用灭菌后接种环分别挑取大肠杆菌至试管斜面,经培养后保留。
2、涂布平板法
（1）浇制平板:
先将融化并冷却至50℃左右牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒入无菌培养皿中,每皿约15ml,共6皿。
待待均匀铺开后,放平,待凝。
分别编上10-4、10-5和10-6,各2皿。
（2）菌样稀释:
取6支无菌试管,依次编号10-1-10-6,在各管中分别加入生理盐水4.5ml,然后逐层稀释。
（3）滴加菌液:
吸收菌液:
从10-4、10-5和10-6各管中,分别吸出0.2ml菌液加至对应编号平板表面上。
（4）涂布平板:
左手执培养皿,并将皿盖开启一缝,右手拿涂布玻璃把平板上一滴菌液轻轻涂开、均匀涂满整个平板,并预防平板培养基破损。
（5）平板培养:
将平板倒置放在各组培养皿筒内,置37℃恒温箱中培养24h左右。
（6）挑单菌落:
用灭菌后接种环分别挑取大肠杆菌至试管斜面,经培养后保留。
3.2.4试验结果
浇注平板法
因操作时候培养基没有摇匀,造成菌落分布不均匀,在其表面及内部都有菌落分布。
涂布平板法
表面有大量菌体生长,但因涂抹时候不均匀,造成菌体分布不均匀。
且太密集,长不开。
3.2.5注意事项
（1）在浇注平板中,注入培养基不能太热,不然会烫死微生物;在混匀时,动作要轻巧,应数次上下、左右、顺或逆时针方向旋动。
（2）做涂布用平板,琼脂含量可合适高些,倒平板时培养基不宜易在平板表面形成冷凝,不然易在平板表面形成冷凝水,造成菌落扩展或蔓延。
若将凝固平板先倒置、搁在皿盖上并留一开口,事先放在37℃恒温箱中一段时间,则可确保平板表面无冷凝水形成。
（3）挑取单菌落时,应注意选择分散、孤立并含有经典特征菌落,以立刻取得纯种。
4.水中细菌总数测定和菌种保藏
4.1水中细菌总数测定
4.1.1试验目
（1）学习并掌握水样采集和水样中细菌总数测定方法
（2）了解水质情况与细菌数量在饮水中关键性
4.1.2试验原理
水中细菌总数可作为判定被检水样被有机物污染程度标志。
细菌数量越多,则水中有机物质含量越大。
在水质卫生学检验中,细菌总数是指1ml水样在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基中经37℃、24h培养后所生长出细菌菌落数。
4.1.3试验方法与步骤
1.水样采集和保留
（1）自来水:
先将水龙头用火焰烧灼3min灭菌,然后再放水5~10min,最终用无菌容器接取水样,并速送回试验室检测。
（2）池水、河水或湖水:
将无菌带玻璃塞瓶瓶口向下浸入距水面10~15cm深层水中,然后翻转过来,除去玻璃塞,水即流入瓶中,当取完水样后,立即瓶塞塞好（注意:
采样瓶内水面与瓶塞底部间留些空隙,方便在测定时可充足摇匀水样）,再从水中取出。
2.水中细菌总数测定
（1）自来水:
用无菌移液管吸收1ml水样,加入无菌培养皿中（每个水样反复3个培养皿）,然后在每个上述培养皿内个加入约15ml已融化并冷却至45~50℃牛肉膏蛋白胨琼脂培养基,并轻轻旋转摇动,使水样与培养基充足混匀、冷凝后即成检测平板。
然后将其倒置于37℃恒温箱内培养24h。
（2）池水、河水或湖水
①水样稀释:
取3~4支无菌试管,依次编号为10-1、10-2、10-3（或10-4）,然后在上述每支试管中加入9ml无菌水。
接着取1ml水样加入到10-1试管中,摇匀（注意:
这根已接触过原液水样移液管尖端不能再接触10-1试管中液面）,另取1ml无菌移液管从10-1试管中吸1ml水样至10-2试管中（注意点同上）,如此稀释至10-3或10-4管（稀释倍数视水样污染程度而定,取在平板上能长出30~300个菌落稀释倍数为宜）。
②加稀释水样:
最终3个稀释度试管中各取1ml稀释水样加入无菌培养皿中,每一稀释度反复2个培养皿。
③加入融化培养基:
在上述每个培养皿内加入约15ml已至融化并冷却至45~50℃牛肉膏蛋白胨琼脂培养基,随即快速而轻巧地摇匀。
④待凝培养:
待平板完全凝固后,倒置于37℃培养箱中培养24h。
3.记菌落数
将培养24h平板取出,用肉眼观察,记平板上细菌菌落数。
4.1.4试验结果
污水涂抹部分其表面有菌落,但涂抹不好,有涂到边缘上,菌落大约40个;而自来水涂抹部分其表面无菌落。
4.1.5注意事项
水样采集后,应速送回试验室测定,若来不及测定应放在4℃冰箱存放,若无低温保藏条件,应在汇报中注明水样采集与测定间隔时间。
通常较清洁水可在12h内测定,污水须在6h内结束测定。
4.2菌种保藏
4.2.1试验目
（1）了解甘油法保留微生物菌种原理
（2）掌握简易甘油保藏菌种方法
4.2.2试验原理
在长久微生物菌种保种实践中发觉,即使在相当宽低温保藏范围内,温度越低越能保持菌种活性[液氮（-196℃）比干冰（-70℃）好,干冰优于-20℃,-20℃比0℃或4℃好],但因为菌种在冷冻和冻融操作中会造成对细胞损伤,而利用40%左右甘油或合适浓度二甲基亚砜等作为保护剂对细胞加以保护,可降低冻、融过程中对细胞原生质及细胞膜损伤。
因为在合适浓度甘油中,将会有少许甘油分子渗人细胞,使菌种细胞在冰冻过程中缓解了其因为强烈脱水及胞内形成冰晶体而引发破坏作用。
再将甘油保留菌种放在-20℃左右冰箱（能维持生命和保持极微细胞代谢率）或超低温冰箱（-70℃以下）中保藏。
4.2.3试验方法及步骤
1.无菌甘油制备
将80%甘油置于三角瓶内,塞上绵塞,外加牛皮纸包扎,加压蒸气灭菌（121℃,20min）后备用。
2.保藏培养物制备
（1）菌种活化:
将待保藏菌种在斜面上传代活化1~2代。
（2）菌种纯化:
将活化后斜面菌种在对应平板培养基上做划线分离、培养并挑选最经典单菌落移接斜面后进行适温培养,再作菌种性能检测。
（3）性能检测:
对已纯化菌种作多种经典特征检测或质粒等判定。
（4）菌种培养物制备:
接种上述待保留菌种（作斜面、平板划线或液体接种）,适温下培养。
3.保藏菌悬液制备
（1）液化法
①菌液制备:
将菌种培养液离心（4000r/min）,倾去上清液,并用对应新鲜培养液制备成一定浓度菌悬液（108~109/ml）。
然后用无菌移液管吸收1.5ml,置于一支带有螺口密封圈盖无菌试管（或无菌Eppendorf加0.5ml）中。
②滴加甘油:
再加入1.5ml灭菌80%甘油,使甘油浓度为40%左右为宜,旋紧管盖或塞紧Eppendorf管（加0.5ml甘油）盖子。
③振荡混匀:
振荡密封菌种小试管或Eppendorf管,使培养液与甘油充足混匀。
（2）菌苔法
①菌悬液制备:
培养适龄斜面或平板菌苔作甘油菌种保留用。
用生理盐水洗下菌苔细胞制成一定浓度（108~109/ml）菌悬液。
②滴加甘油:
加等量甘油混匀,制备成含40%左右甘油菌悬液。
（3）低温保留
上述两种甘油菌悬液即可在-20℃左右低温下保藏（此温下40%甘油菌悬液即不会冻结）。
4.快速冷冻
也可将上述甘油菌悬液管置于乙醇-干冰或液氮中速冻,然后作超低温保藏。
此法可延长保留期限。
5.超低温保藏
速冻甘油菌种管置于-70℃以下保藏,保留期检测中切莫反复冻融,通常细菌或酵母菌种保留期为3~5年。
6.菌种保藏期限检测试验
（1）取菌样:
在保藏期间可用无菌接种环蘸取甘油菌悬液（或刮取超低温保藏甘油菌冻结物）,快速盖好菌种管返回冰箱,切忌将菌种管放置在室温下冰融,从而加速其内细胞死亡。
（2）接种斜面:
将蘸有甘油菌悬液（冻结物）接种到对应斜面培养基上,适温培养后判定各菌种保藏情况。
（3）再保藏制备:
用接种环挑取斜面上已长好细菌培养物,置于装有2ml对应培养液试管中,再加入等量灭菌80%甘油,振荡混匀后再分装菌种管。
（4）分装菌种管:
将上述甘油菌悬液分装于灭菌具螺口密封圈盖试管或无菌Eppendorf管中,按上法直接低温保留或速冻后作超低温长久保藏。
4.2.5注意事项
1．甘油法保藏菌种时应尤其注意菌体与甘油充足混匀。
2.菌体与甘油混匀后冰冻必需快速,每次取样时严防出现反复冻融现象,以预防菌种死亡。
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