植物生理学中各项生理指标的测定方法.docx

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植物生理学中各项生理指标的测定方法

植物生理学中各项生理指标的

测定方法

.实验内容

实验1MDA（丙二醛）含量测定所需试剂：

10%三氯乙酸（TCA（纯）0.25%硫代巴妥酸

（纯）

实验2：

可溶性蛋白含量测定所需试剂：

考马斯亮蓝G-25095%乙醇85%磷酸

实验3：

SOD超氧化物歧化酶）酶活性测定所需试剂：

dl-甲硫氨酸（Met）NBTEDTA-Na2核

实验4：

CAT过氧化氢酶）活性（过氧化氢酶）测定所需试剂：

PBS（PH=7.0）30%H2O2

实验五：

Apx（抗坏血酸过氧化物酶）活性（即ASA-POD活性）测定所需试剂：

ASA（分子量167.12）（乙=胺四乙酸二钠）EDTA-Na2PBS（pH7.0）30%H2O实验6：

ASA（维生素C）含量测定

偏磷酸95%乙醇磷酸4%2,2-二联吡啶

FeCI3（或FeCI3・6H2O

实验7：

GSH谷胱甘肽,媚力肽GSHGSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合而成的三肽化合物）含量测定所需试剂：

NaH2PO42H2ODTNB（二硫代硝基苯甲酸）

PBS（PH6.8）

实验8：

脯氨酸测定所需试剂：

磺基水杨酸甲苯茚三酮冰乙酸

85%磷酸

试验9：

叶绿素含量测定。

80%丙酮

试验9:

GF活性测定

试验10：

过氧化氢含量测定。

三氯乙酸

试验11：

超氧阴离子含量测定

二．酶液和母液提取

1.酶液提取所需试剂：

50mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.8）（内含1%（m/v）聚乙烯吡哆烷酮PVP），

O.lmmol/LEDTANa或EDTA,也可为（内含2%（m/v）PVP）,

0.2mmol/LEDTANa或EDTA（先配制后用缓冲液定容）

2.ASA.GSH母液提取所需试剂：

5%偏磷酸

1．抗氧化酶酶液提取（SOD.POD.CAT：

1g（根据样品的量，少的可以适当减少）叶片加入预冷5ml.50mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.8）

4°C冷冻15000g离心20分钟

上清液即为酶液（5C下保存一两天内备用，中短期用

-20C保存）

2.ASA.GSH母液提取：

0.1g叶片加入3ml预冷5%偏磷酸溶液

4C冷冻14000g离心10分钟

上清液即为母液（5°C下保存备用）

（偏磷酸可显著沉淀蛋白质和保护ASA）

酶液提取所需试剂：

PVP（聚乙烯吡哆烷酮）：

1%（1g溶于100ml水），1000ml需称取10g，此处用PBS

EDTA-Na2:

0.1mmol/L（37.2mgEDTA-Na2溶于1000ml蒸馏水），此处用PBS

PBS（缓冲液）配制方法：

①Na2HPO412H2O②NaHPO4・2H2O

取①71.64g，蒸馏水定容至1L,取②31.21g定容至1L,放置4C冰箱备用

PH=7.8取①91.5ml+②8.5ml=100ml（浓度0.2mol/L）

需要0.05mol/Lf将上述溶液烯释至400ml（0.2mol/L*0.1=0.05mol/L*V）

母液提取所需试剂：

5%偏磷酸：

称5g纯偏磷酸，定容至100ml蒸馏水（需加热溶解，温度在50-60C）偏磷酸有剧毒

（偏磷酸难溶解，先得用研钵提前研碎，后用磁力搅拌器溶解一到两天后再定容）

（现所用为38%HPQ所以需称65.7895g，定容至500ml）

三．实验步骤

实验1:

MDA含量测定

1.1所需试剂：

10%三氯乙酸（TCA（纯）称10g

定容至100ml

0.25%硫代巴妥酸（纯）称

0.25g用10%TCA定容至100ml

（配制时，可一次完成，先配TCA不要定容，再加入硫代巴比妥酸，然后定容，若难溶解，可以在磁力搅拌器上微热）

1.2步骤：

取0.3g叶片，加4ml磷酸缓冲液研磨，

加入4ml0.25%的硫代巴比妥酸（溶于10%的三

氯乙酸）溶液

J摇匀

95°C加热15分钟

J快速冷却

3000g离心15分钟

取上清测定OD532，OD600，OD450值

按公式求MDA浓度=6.45X（OD32-OD。

。

）-0.56OD45°

（卩mol/L）

可溶性糖浓度=11.71XOD450（mmol/L）最后计算MDA含量（卩mol/gFW）=[4X（MDA浓度x）X10-3/0.1]

同时，可测得可溶性糖含量（mmol/gFW）=4X

（可溶性糖浓度x）X10-3/0.1

（用多波长测定，在测定之前一定要矫正基线，公式中

的参数可以直接在分光光度计上输入）注意：

以0.25%的硫代巴妥酸溶液作空白调零

MDA含量测定的改进

1.可以用做酶活性时提取的酶液来直接测定MDA含量，用量可以定为1.0、1.5或2.0（较好）ml。

2.硫代巴妥酸溶液改为0.5%的硫代巴比妥酸（溶于20%的三氯乙酸）溶液。

实验2:

可溶性蛋白含量

（参照Bradford方法测定），以BSA作为标准蛋白（牛血清蛋白）

2.1所需试剂及配制：

牛血清蛋白（BSA，考马斯亮蓝

G-250，95%^醇，85%磷酸

考马斯亮蓝G-250蛋白染色剂的配制：

称取100mg考马斯亮蓝G-250,溶于50ml95%L醇，加入100ml85%的磷酸，最后蒸馏水定容到1L，混匀，放置过夜，过滤后贮放在棕色瓶中，常温下可放置一个月。

•标准曲线制作：

1标准溶液配制：

称取10mg牛血清蛋白标准液，溶于蒸馏水，定容至100ml,制成100卩g/ml的标准液，4°C下保存备用。

（必须是牛血清蛋白向水中溶解，不能颠倒）

2取6支具塞试管（10ml）,按下表配制含0-100卩g/ml的牛血清蛋白液各1ml（★调零管）

★123456

020406080100

（卩g）

3各试管加入5mlG-250染色剂，翻转混合，放置2分钟'595nm比色，绘制过原点标准曲线（方程式）。

（相关系数要两个9以上）

2.2步骤:

1标准曲线（参考邹琦）（595nm比色）

注意：

制作通过原点的标准曲线，以含0卩g蛋白质液

调零

2取0.1g样品，加5ml蒸馏水提取，5000g离心10分钟，取上清1ml测定

31ml样液+5mlG-250液盖塞翻转混合数次，最后595nm比色，直接从标准曲线读含量。

（此方法反应十分迅速，2分钟即达到平衡，其结合物在室温下1小时内保持稳定）

实验3:

SOD酶活性

3.1步骤：

1.取50卩l酶液

1加入2ml39mmol/L甲硫氨酸（Met）

22ml0.225mmol/LNBT,（氮蓝四唑）

31ml0.6mmol/LEDTA-Na?

（①②③可以配制在一个试剂瓶里）

41ml0.012mmol/L核黄素，摇匀。

（现配现用）

2.（人工培养箱内）4000Lx日光灯下放置30分钟后，

温度控制在30°C，于暗处终止反应。

（用大烧杯套着小烧杯，将试管放在同心圆内，每隔

5min转过90度，转四次。

对照（不加酶液）每次至少对称地放3支，调零的不照光和不加酶液）

3.560nm处测吸光值，酶活性以抑制NBT光反应50%为一个酶活单位表示。

（实验中可将除酶液和核黄素外其它试剂按比例混合好后，一次加入5ml，然后依次加入核黄素和酶液，以不加酶液的照光管为对照。

）_

3.2所需试剂：

dl-甲硫氨酸（Met）39mmol/L1.1638g/g00ml以NBT0.225mmol/L（0.01840均克）/100ml

0.0368g/200ml

EDTA-Na0.6mmol/L0.0223g/100ml

核黄素0.012mmol/L0.0045g/L或

0.0045g/100ml用时稀释10倍

各试剂溶液均在用前配置，配置好后均应避光保存，尤其是核黄素，必须随用随配，避光保存。

试验进行时一次性加5ml的反应混合液配置方法：

Met+NBT+EDTA-Na2

200mll+200ml+100ml

另外反应时间30分钟过长，改为20分钟适合

SOD舌性（酶单位u/gFW）=（A0-A1）*V/A0*0.5*FW*a

A0---对照照光管光吸收值；A1---样品管光吸收值。

V---样液总体积（ml）5mlFW---鲜重（g）1g

a---测定用样品的量（ml）0.1ml

实验4:

CAT活性（过氧化氢酶）

4.1所需试剂：

1PB（SPH=7.0）50mmol/L（61份50mmol/lNa2HPO4,39份50mmol/lNaH2PO4）

215mmol/L"0（以30%HQ配）

（取85.2卩L30%H2Q2,以50mmol/LPBS（（PH7.0）定容至100ml）

4.2步骤:

1.3ml50mmol/LPBS（PH7.0）加入50卩l酶液

（加比色杯的盖子摇2-3下，让酶液与缓冲液充分分散）再加入5卩l15mmol/LH2Q摇匀（加比色杯的盖子摇2-3下，让酶液与缓冲液充分分散）。

2.240nm处作时间扫描（每0.5分钟测1次，共测3分钟）

3.CAT活性以每分钟消耗1卩mol的HO为一个酶活单位。

活性计算改动：

（以每分钟OD值减少0.01为一个酶活单位u）（2005和2006年均是按OD值减少0.01算的）

（以每分钟OD直减少0.1为一个酶活单位u）

注意：

以PBS作空白调零50mmol/L

实验5:

APX活性（抗坏血酸过氧化物酶）（即ASA-POD舌性）

5.1所需试剂：

ASA（分子量167.12）0.3mmol=0.052836（g）（乙=胺四乙酸=钠）EDTA—Na2（以PBS配成0.1mmol/L=0.0372（g）/L）

50mmol/LPBS（pH7.0）

9mmol/LH2Q（以30%bD配制）

（51卩l30%H2Q2定容至100ml）

计算为：

K1=2.8，K2=3，K3=-1，K4=100可得到总取样（5ml酶液或1g样）的最终活性。

酶活性单位为卩mol/g（鲜重）・min

以后APX活性测定可参考沈文飚：

抗坏血酸过氧化物酶活性测定的探讨

3ml反应液中含50mmol/LPBS,pH7.0,0.1mmol/LEDTA（或EDTA-Na2），0.1mmol/LH2O20.5（或0.3）mmol/LAsA最后加入适量酶液（20、50、100ul均可）启动反应，连续记录测定室温下290nm吸收值的变化。

以不加H2O2作为对照，H2O2本身对AsA的氧化作用在测定时间内由于吸收值变化太小可忽略不计。

室温下每分钟氧化1umolAsA的酶量作为一个酶活性单位（U）（吸光系数为2.8mmol/Lcm）

5.2步骤：

1.配反应液（50mmol/LPBS（pH7.0），内含0.1mmol/LEDTA-Na2,含0.3mmol/LASA）

2.样品