肝肾阴虚型甲亢和脾肾阳虚型甲减患者血清蛋白质组的比较分析.docx

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肝肾阴虚型甲亢和脾肾阳虚型甲减患者血清蛋白质组的比较分析

肝肾阴虚型甲亢和脾肾阳虚型甲减患者血清蛋白质组的比较分析

摘要：

[目的]通过对肝肾阴虚型甲亢和脾肾阳虚型甲减患者血清蛋白质组的分析，阐述肝肾阴虚和脾肾阳虚的物质基础。

[方法]将正常人、

甲亢和甲减患者血清用亲和层析法除去其中的高丰度蛋白质，再甩双向电泳技术分析不同组样品蛋白质组的变化，所获的差异蛋白质用质谱

进行鉴定。

[结果]与正常人相比，肝肾阴虚型甲亢患者血清中RBP和TTR的表达量降低，而IGF一2、FDA—C、NF—KB及PTP表达量升高；脾

肾阳虚型甲减患者TTR表达量升高，NHE一1、ZAG、UCH、IGF一2和MHC—II蛋白则表达量下降。

肝肾阴虚型甲亢和脾肾阳虚型甲减相比，

ProapoA-I和TTR表达量降低，而NDU、SCDH／SCR、PK、CytP450蛋白、IGF一2和IRF一5表达增加。

[结论]肝肾阴虚型甲亢患者机体代谢

活跃．而脾肾阳虚型甲减患者则机体代谢减低，合成代谢的速度>分解代谢的速度。

肝肾阴虚型甲亢血清IGF一2表达升高，脾肾阳虚型甲减则

正好相反，说明血清IGF-2具有成为中医辨证肝肾阴虚和脾肾阳虚血清标志物的可能性。

肝肾阴虚型甲亢常

关键词：

肝肾阴虚；脾肾阳虚；甲亢；甲减；蛋白质组

中图分类号R582文献标识码：

A文章编号：

1005—5509（2012）01—0023一O4

AnalysingtheSerumProteomicsBetweenHyperthyroidismofYindeficiencyinLiverandKidneyandHypothyroidismofYangDeficiency

inSpleenandKidneyLuDezhao，SongJunling，WangPing’er，etalCollegeof￡咖Science，Zh~iangChineseMedicalUniversity,Hangzhour

310053）

Abstract：

[Objective]Materialbasisofyindeficiencyofliverandkidneyandyangdeficiencyofspleenandkidneywerestudiedbyanalysingthe

diferenceofserumproteomebetweenthepatientsofhyperthyroidismandhypothyroidism．[Methods]TheI1ighabumdanceproteinsintheserumof

normalpeople，hyperthyroidismpatientsandhypothyroidismpatientswereremovedwithProteo—ExtractAlbumin／lgGRemovalKitandtheproteins

wereseparatedbytwo—dimensionalelectrophoresisandanysisedwithsoftware．Thediferentproteinswereidentifiedwithmassspectrum．[Results]

Comparedwichthenormalpeople，theexpressionofretinolbindingproteinandtransthyretindecreasedwhiletheexpressionofinsuhngrowthfactor2，

aldolaseC，NF—KB，protein—tyrosinephosphataseincreasedintheserumofyindeficiencyofliverandkidneypatients，andtheexpressionofNa／H

hydrogenexchangerisoforml，Zn—a1pha一2一glyoprotein，ubiquitinC—terminalhydrolase，insulingrowthfactor一2，MHC一Ⅱdecreasedwhilethe

expressionoftransth~，retinincreasedintheserumofyangdeficiencyofspleenandkidney．Whencomparedwimthehypothyroidismpatientsofyang

deficiencyofspleenandkidney，theexpressionofproapohpoproteinApoA—Iandtransthyretindecreased，andtheexpressionofNADHubiquinone

dehydrogenase，short—chaindehydrogenase／reductase，pyruvatekinase，cytochromeP450，interferonregulatoryfactor5andinsulingrowthfactor2

increasedinyindeficiencyofhveranddneyhyperthyroid~m．eConclution]Theenergymetabolisminthepatientsofyindeficiencyofliverand

kidneywasactive．Incontrast，therewerelowenergymetabolisminthepatientsofyangdeficiencyofpleen—kidney．Theexpressionofinsulingrowth

factor2hascontraryvarianceinthisexperiment，soitmightbea$ek％lmmarkerfordiferentiatingzhengintraditionalchinesemedicine．

Keywords：

Yindeficiencyofliverandkidney；Yangdeficiencyofspleenandkidney；hyperthyroidism；hypothyroidism；proteome

肝肾阴虚证和脾肾阳虚证是临床常见的中医证候。

国内诸多学者对其物质基础和客观指标做了大量的研究，但尚无确定性的结论。

甲状腺功能亢进症（hypenhyroidism，简称甲亢）是以血液循环中甲状腺激素（Thyroidhormone，TH）水平增加、作用增强为特征的一种临床综合征。

在中医学中归属“瘿瘤”范畴，其中典型的发病原因首推“肝肾阴虚”Bl。

而与之相反。

甲状腺功能减退症（hypothyroidism，简称甲减）则是由于TH合成和分泌减少或组织利用不足导致的全身代谢减低综合征。

在中医学中归属“虚劳”或“虚损”范畴，其典型发病原因是“脾肾阳虚”【2】。

本研究分别以甲亢与甲减患者作为肝肾阴虚证和脾肾阳虚证的研究对象，拟通过检测患者血清蛋白质组的变

化，在分子水平上诠释肝肾阴虚证和脾肾阳虚证型基金项目：

国家自然科学基金项目（81102841）；浙江省中医药管理局重点项目（2006Z002）

Fundproject：

，nleNationalNaturalScienceFoundation（81102841）；KeyprojectofChinesemedicaladministrationinZhejiang

Province（2006Z002）

的物质基础及其与机体代谢之间的关系。

l材料和方法

1．1一般资料从浙江省中医院2009年9月至2010年lO月收治的患者或体检者中．选取甲亢、甲减和健康体检者各8例。

男性l2名，女性12名，年龄2O～40岁，平均（29．76+-4．87）岁，无心、脑、肾等严

重器质性病变。

3组在年龄、性别等基线资料方面比较。

差异无统计学意义f尸<0．05）。

1．2纳入标准甲亢患者总甲状腺素fTF4）>161．0

nmol·L～，总三碘甲状腺原氨酸（1Tr3）>2．5nmol·L～，第三代促甲状腺素（TSH）<0．4mlU·L一，游离甲状腺素（FT4）>24．45pmol·L一，游离三碘甲状腺原氨酸（FI'3）>7．22pmol·L～。

甲减患者TI'4<58nmol·L～，TT3<0．9nmol·L～，TSH>4．00mIU·L～，FT3<3．23

pmol·L～。

肝肾阴虚证和脾肾阳虚证辩证由两位主任中医师共同进行，结果一致才入选。

1．3研究对象的基本情况分析对实验中入选人浙江中医药大学学报2012年J月第36卷第J期群的基本情况、临床表现及相关指标进行测定，甲亢患者1Tr4、TT3、Fr3、FT4增加，TSH下降，临床表现

为颈部肿大伴心悸，多汗，烦躁易怒，手抖，头晕目眩，舌红少苔，脉细数，符合肝肾阴虚证表现；甲减患者TF4、Tr3下降，TSH增加，临床表现为畏寒怕冷，面色苍白，颜面浮肿，舌体胖大常伴有齿痕，脉迟缓，符合脾肾阳虚的表现。

见表1、表2。

表1研究对象基本情况（n=8，Y-zts）2928-oo矗s4

表2入选人群实验室检测指标（n=8。

±s）

1．4血清蛋白质的制备采集入选人群的外周血2mL，4℃，3000r／rain离心10min取上清。

将同组8个血清样品等量混合后用ProteoExtractAlbumin／IgGRemovalKitfMerck）除去高丰度的白蛋白和球蛋白。

采用Lowry法对蛋白质进行定量后保存于一80℃冰

箱备用。

1．5双向电泳将150~g样品用水化液定溶到450~L。

放入胶条槽内，采用EttanTMIPGPhor等电聚焦仪进行第一向电泳分离，每组重复3次。

等电聚焦参数为30V12h；500V1h；IO00Vlh；8000V8h；500V4h。

表面温度20℃，电流不超过50~A／胶。

等电聚焦后经平衡转移到预先配置好的浓度为10％的浓度均一的SDS聚丙烯酰胺凝胶中，进行第二向SDS—PAGE电泳分离，参数设置为：

5W／胶45rain；15W／胶

6h．当溴酚蓝染料迁移到胶的底部边缘即可结束电泳。

1．6凝胶银染后图像扫描与软件分析电泳结束后．取出凝胶转移到染色盒里进行硝酸银染色。

染色后的凝胶使用UMAXImageScanner凝胶扫描仪进行扫描成像，再用ImageMaster2D6．0图像分析软件进

行差异蛋白质分析。

以各组内2一DE蛋白质点最多的凝胶作为参考胶，进行组内组间匹配，选择表达水平上升或下降2OO％的蛋白作为差异蛋白质。

1．7胶内酶解及质谱鉴定制作2块制备胶，银染后切下差异蛋白质点，置于1．5mL的离心管中，经脱色液（50mmol·LNa2S203，15mmol·L～K3Fe（CN）6）脱色后加入5L浓度为12．5ng·胰蛋白酶（用200mmol·L～NH4HCO配制），37℃酶解过夜，酶解后用15txL萃取液（45％H20，5％TFA，50％乙腈）萃取3次，合并萃取液。

用真空浓缩仪进行浓缩后溶于含

1．21xL0．1％TFA中，点靶时0．31xL肽段和0．31xL饱和基质溶液（肉桂酸）直接点样，每点0．6txL，每点做2个重复，然后进行基质辅助激光电离飞行时间质谱分析并进行MALDI—TOF—TOF—MS检测，得到肽质量指纹图谱。

通过Mascot数据搜索，结合2一D图谱上蛋白质的分子量、等电点信息鉴定蛋白质l31。

1．8统计分析数据统计采用SPSS13．0统计软件，计量资料用均数±标准差表示（Y-+-s）。

有显著性差异。

P

2结果

2．1差异蛋白质组分析利用双向电泳技术获得正常人、肝肾阴虚型甲亢患者和脾肾阳虚型甲减患者血清蛋白质组图谱。

通过差异蛋白质组分析。

并选择表达量变化在200％以上的蛋白质作为表达显著

发生变化的差异蛋白质。

与正常对照组比较．肝肾阴虚甲亢和脾肾阳虚型甲减患者血清中分别有6个蛋白质表达显著发生变化；肝肾阴虚甲亢组与脾肾阳虚型甲减组比较，10个蛋白质表达发生了显著的变

化

l23

1．正常人血清：

2．肝肾阴虚型甲亢患者：

3．脾肾阳虚型甲减患者

图1血清双向电泳图谱（pH4-7，24cm1

2．2质谱鉴定实验所获差异蛋白质点经过胶内

酶解后用基质辅助激光电离飞行时间质谱进行检测。

在肝肾阴虚型甲亢患者血清中，视黄醇结合蛋白（RetinolBindingProtein，RBP）和转甲状腺素蛋白（Transthyretin，1_rR）表达量下调，胰岛素样生长因子一2（insulin—likegrowthfactor一2，IGF一2）、果糖二磷

酸醛缩酶CffructosediphosphatealdolaseC，FDA—C1、NF—KB和酪氨酸磷酸酶fprotein—tyrosinephosphatase，PrrP1表达量增加；脾肾阳虚甲减患者血清中．rrR表达量升高；泛素C末端水解酶（ubiquitinC—terminalhydrolase，UCH）、Na／H交换蛋白1

（sodium／hydrogenexchangerisoforml，NHE一1）、锌a一2

糖蛋白A链（Zn—Alpha一2一Glyoprotein，ZAG）、IGF一2和MHC—II蛋白质则表达量下降：

肝肾阴虚型甲亢和脾肾阳虚型甲减患者相比，前载脂蛋白A—I（ProapolipoproteinA—I，ProapoA—I）．）和rrrR表达量降低，而NADH辅酶脱氢酶（NADHdehydrogenaseubiquinone，NDU）、短链脱氢酶／还原酶fshortchaindehydrogenase／reductase，SCDH／SCR）、丙酮酸激酶（pyruvatekinase，PK）、细胞色素P450蛋白fcytochromeP450，CytP450）、超氧化物歧化酶2fsuperoxidedismutase2，SOD2）、血红素氧合酶（Hemeoxygenase，

HO）、IGF一2和干扰素调节因子5（interferonregulatory

factor5，IRF一5）表达增加。

见表3、表4、表5。

3讨论

现代研究认为肝肾阴虚和脾肾阳虚与神经、内表4脾肾阳虚甲减与正常对照组差异蛋白质相关信息表5肝肾阴虚甲亢与脾肾阳虚甲减患者差异蛋白质相关信息分泌、免疫系统关系密切。

表现为下丘脑一垂体一肾上腺皮质轴、下丘脑一垂体一甲状腺轴、下丘脑一垂体一性腺轴分泌紊乱。

肝肾阴虚和脾肾阳虚还与糖、脂肪、蛋白质代谢、能量代谢、免疫细胞因子、细胞核调控因子、酶和蛋白质等密切相关[41。

因此肝肾阴虚和脾肾阳虚是多因素、多环节、多通路发生病变的综

合结果，采用单因子的方法进行研究很难得到正确的结果。

为此我们在I临床选择阿胶黄精丸调理甲亢．经辨证确认肝肾阴虚型甲亢效果比较好．应用双向电泳和质谱技术对患者血清蛋白质组进行分析测

定，从血清蛋白质组表达水平上探讨脾肾阳虚证和肝肾阴虚证的物质基础，诠释肝肾阴虚证和脾肾阳虚证型与机体代谢之间的关系，这可能更符合中医辩证的本质。

实验中发现了一系列的蛋白质表达发生了变化，它们可能与肝肾阴虚证和脾肾阳虚证的发病有关。

RBP和TTR是肝脏合成的低分子蛋白质，1TR又称前白蛋白，是TH的运载蛋白，在血浆中二者共同参与维生素A的转运阁。

甲亢时RBP和1’rR表达减低，引起维生素A合成不足，进而不能转化为更多的辅酶。

甲亢患者血清RBP水平较正常人低，甲减则高于正常人。

同时肝肾阴虚型甲亢患者在高代谢状态下，能量代谢速度加快．FDA—C和P高表达有助于糖酵解和使乙酰辅酶A进入柠檬酸循环，产生大量ATP。

此外，甲亢患者在长期高浓度的TH刺激下．IGF一2等各种促生长因子过表达，使细胞有丝分裂速度加快『6】，导致甲状腺腺体组织增生肥大，甲状腺组织的增生反过来又释放了更多的甲状腺素，维持了机体的高代谢状态。

脾肾阳虚型甲减患者由于体内甲状腺素不足，局部组织的自分泌／旁分泌功能低下．使IGF一2表达量下降。

有文献显示IGF一2的分泌量与TH水平呈正相关【7-8]。

因此IGF一2的表达量可以作为TH水平高低的一个信号蛋白。

本实验结果也显示甲减患者IGF一2表达下调。

此外IGF一2还可以介导NHE一1的活性．NHE一1是存在于所有真核细胞中的一种跨膜蛋白[91．可以加快葡萄糖降解的速度，NHE一1表达量下降会导致糖酵解速度减慢，ATP生产减少。

ZAG表达量低下，使细胞膜上的B3肾上腺素受体不能被激活．进而cAMP信号转导途径中断。

使脂肪组织中cAMP含量减少，最终减慢了B一氧化速度㈣。

而UCH表达量下调，影响泛素一蛋白酶体途径水解蛋白质．干扰蛋白质的新陈代谢，最终均可影响机体能量代谢，使物质代谢减慢。

通过对肝肾阴虚型甲亢和脾肾阳虚型甲减的人血浆蛋白质组图谱的对比分析。

发现甲亢患者中NDU、SCDH／SCR、PK和CytP450蛋白质高水平的表达。

使柠檬酸循环和氧化磷酸化速度加快，并诱导IRF一5的表达。

IRF一5的过表达可以使生物氧化功能亢进，代谢速度加快。

作为一种信号转导激动剂，IRF一5的活化还有助于激发机体的免疫活性【ll】。

同时机体前载脂蛋白A—I和1TrR的下降，从而使合成代谢减慢。

脾肾阳虚型甲减患者则代谢率降低，机体柠檬酸循环、氧化磷酸化速度和脂肪酸降解速度均减慢．耗氧量减少，细胞代谢速度减慢。

综上所述，能量代谢在肝肾阴虚甲亢和在脾肾阳虚甲减的发病中起了至关重要的作用。

肝肾阴虚型甲亢组能量代谢活跃，氧化磷酸化和柠檬酸循环加速。

脾肾阳虚型甲减组能量代谢减低。

合成代谢的速度大于分解代谢的速度。

其发病机理可能与调节

IGF一2和IRF一5的表达有关。