1种致病性鳗弧菌胞外蛋白酶的分离纯化及性质精.docx

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1种致病性鳗弧菌胞外蛋白酶的分离纯化及性质精

第9卷第4期2002年12月

中国水产科学

JournalofFisherySciencesofChina

Vol.9No.4Dec.,2002

1种致病性鳗弧菌胞外蛋白酶的分离纯化及性质

陈吉祥,刘　霜,李　筠,王祥红,杜宗军,于德华,纪伟尚,（青岛海洋大学海洋生命学院,达尔文实验室,山东青岛266003

摘要:

从山东省莱州海区自然发病的花鲈（Lateolobraxjapanicus体内分离到1株致病性鳗弧菌,经硫酸铵盐析、

DEAE2SepharoseFastFlow和Sephadex2G100凝胶层析等方法从其培养液中分离纯化了1种胞外蛋白酶。

用SDS2PAGE电泳测得蛋白质的分子量为3617kD,酶的最适温度为50℃,对热不稳定,70℃15min完全失去活力;最适pH为710;1mmol/L的PMSF对酶活性无影响,部分金属离子如Cu2+、Fe2+、Fe3+、Zn2+对酶活力有抑制作用,而Ca2+对酶有一定程度的激活作用,1mmol/LEDTA能完全抑制酶的活性,表明该酶是1种金属蛋白酶。

关键词:

鳗弧菌;胞外蛋白酶;分离纯化;理化性质

中图分类号:

S941142　　　　文献标识码:

A　　　　　　-8737-05

收稿日期:

2001-11-221

基金项目:

国家自然科学基金资助项目（39870581;英国达尔文项目

（162/8/0651

作者简介:

陈吉祥（1963-男,副研究员,博士后,从事海洋微生物学与免疫学1

　　子,已从霍乱弧菌、创伤弧菌-3][4]从11种胞外蛋白酶,证明其对虹鳟;Lamas[5]利用鳗弧菌及其胞外蛋白产物对虹鳟进行腹腔注射后,虹鳟表现出极为相似的症状。

肖慧等[6]从山东沿海养鱼场发病鱼的体内分离到1株致病性鳗弧

菌,感染实验表明该菌株对花鲈（Lateolabrax

japanicus等海水养殖鱼类有较强的致病性,常伴有

严重的血管出血及组织损伤、出血等病症。

本研究从其胞外产物中分离纯化了1种胞外蛋白酶,并进行酶的理化性质研究,以探讨该菌胞外产物对鱼类组织损伤及致病作用的机制。

1　材料和方法111　实验菌株

致病性菌株W-1分离自山东省莱州湾海区发

病的花鲈（Lateolabraxjapanicus,经细菌形态学、

Biolog系统鉴定为鳗弧菌（Vibrioan2

guillarum。

112　试剂及仪器

DEAE2SepharoseFastFlow、Sephadex2G100购

自Pharmacia公司,SDS、丙烯酰胺、牛血清蛋白、N,N’2亚甲基双丙烯酰胺、考马斯亮蓝R-250、PMSF

等购自上海生物工程公司,其余试剂为国产分析纯。

蛋白层析系统购自上海沪西仪器厂,UV-730紫外分光光度计购自日本岛津公司,DYY-Ⅲ垂直板电泳仪购自北京六一仪器厂。

113　实验方法

11311　细菌培养及胞外产物获得　细菌的培养用2216E海水液体培养基,培养温度28℃,培养时间24h,振荡频率为180r/min。

培养物于4℃5000r/min离心10min,收集上清液,再分别用0145μm

和0120μm滤膜过滤,滤液-20℃保存备用。

11312　酶的分离纯化

（1硫酸铵盐析　将上述培养过滤液取出置室

温融化后,缓慢加入（NH42SO4粉末至80%饱和度,4℃过夜,于10000r/min离心15min,收集沉淀,并溶解于40mL0.02mol/LpH718的Tris2HCl缓冲液,于4℃条件下透析24h,其间充分换水并搅动。

最终体积50mL左右。

（2DEAESepharoseFastFlow层析　

将透析

液直接加入经0102mol/LpH7.8Tris2HCl缓冲液平衡好的DEAE-SepharoseFastFlow柱（110cm×15cm,用含0~0.5mol/LNaCl的相同缓冲液梯度洗脱,流速24mL/h,每管1mL收集洗脱液,测定蛋白吸收和酶活力。

（3SephadexG2100柱层析　将收集的上述酶溶液充分透析,并用PEG浓缩至体积为6mL左右,然后加入到用0102mol/LpH7.8Tris2HCl平衡的SephadexG2100柱（1cm×100cm。

用相同缓冲液洗脱,流速15mL/h,每管1mL收集洗脱液,测定蛋白吸收和酶活力。

收集酶活力集中部分,冷冻干燥。

11313　酶活力测定　参照Inamura方法[4],以偶氮酪蛋白为底物。

具体方法为015mL偶氮酪蛋白溶液（5mg/mL,pH8.0Tris2HCl缓冲液配制,加入011mL酶溶液,再加入014mL双蒸水,混匀后于25℃保温20min。

加入5%的三氯乙酸溶液315mL,于室温3000r/min离心5min,收集上清加入015mol/LNaOH溶液4.5mL,于440nm

OD值。

在该条件下OD值每增加1

1个酶活力单位（U。

11314　Brad2ford方法进行[7],。

11315　SDS2PAGE　蛋白酶的分子量测定采用SDS2PAGE垂直板电泳法:

浓缩胶浓度3%,分离胶浓度10%,考马斯亮蓝R2250染色,中分子量标准蛋白包括磷酸化酶B、牛血清蛋白、卵清蛋白、羧肽酶、蛋清溶菌酶。

11316　温度对酶活性的影响　按11313方法在不同温度下测定酶活力,确定酶的最适温度,另外将蛋白酶溶液于不同温度保温,每隔15min取样并迅速冷却到室温,再测定酶的活力,确定温度对酶活力影响。

11317　pH对酶活力的影响　分别以不同pH的缓冲液配制底物并稀释酶液,再按11313方法测定酶活力,确定酶的最适pH。

11318　酶抑制剂及金属离子对酶活力影响　将各种酶抑制剂及金属离子分别加入到酶溶液中,于25℃保持10min,再用常规方法测定酶活力,并计算酶的活力剩余。

2　结果

211　鳗弧菌蛋白酶的分离纯化

鳗弧菌蛋白酶粗酶液经硫酸铵盐析后,在DEAE2Sepharose柱层析中,2峰,在SephadexG1002峰,1,

性为15U/,4142,酶的收率为

根据该酶在SDS-PAGE电泳中的迁移率,通过作图法求得酶的分子量3617kD（图1。

213　温度对酶活力的影响

该酶的最适反应温度为50℃（图2,是一热不稳定酶,温度较高时,随时间延长,活力部分丧失,超过70℃时15min酶活力即完全丧失（图3。

214　pH对酶活力的影响

该酶的最适pH为710,pH<4时蛋白酶活力很低,而在pH6~10时蛋白酶较稳定（图4。

表1　鳗弧菌胞外蛋白酶的纯化

Table1　PurificationofproteaseofVibrioanguillarumW-1

纯化步骤Purificationprocess体积/mL

Volume

总活力/U

Totalactivity

比活力/（U・mg-1

Specificactivity

得率/%

Yieldrate

纯化倍数Relativepurification

培养过滤液

Culturefilter

9001001193×1067114×1041001001100硫酸铵沉淀

Ammoniumsulfate

501001126×1069166×104621641135

DEAE2sepharosefastflow柱层析

DEAE2sepharosefastflow

61007192×1052120×105411073108

SephadexG2100层析SephadexG2100281004197×1052196×105251234142913

第4期　　　　　　　　　　陈吉祥等:

1种致病性鳗弧菌胞外蛋白酶的分离纯化及性质

图1　SDS2PAGE电泳测定鳗弧菌胞外蛋白酶的分子量

Fig.1　Molecularweightanalysisofproteasefrom

V.anguillarumbySDS2PAGE.

A1标准分子量蛋白:

磷酸化酶b（97400,牛血清白蛋白（66200,

卵清蛋白（42700,碳酸酐酶（31000,溶菌酶（14400;B1鳗弧菌蛋白酶

A.Standardmolecularweightproteins:

Phosphorylaseb（97

400,Bovineserumablumin（66200,Ovalbuminb（42700,Carbonican2hydrase（31000,Lysozyme（14400;B.Proteasefrom.

angillarum.

图2　鳗弧菌胞外蛋白酶的最适反应温度

Fig.2　OptimumtemperatureofproteasefromV.anguil2

larum

215　酶抑制剂和金属离子对酶活力的影响

如表2所示,SDS可部分抑制酶的活力,2

mol/L的Urea对酶活力影响不大,而增加到8mol/L时酶活力部分丧失;1mmol/L的PMSF对酶活力无影响,1mmol/L的EDTA完全抑制酶的活性

。

部分金属离子对该酶有一定的抑制作用,其中Cu2

+、Fe2+、Fe3+、Zn2+抑制作用较为明显,而Ca2+对酶有一定程度的激活作用（表3。

图3　温度对鳗弧菌胞外蛋白酶稳定性的影响

Fig.3　Effectsoftemperatureonstabilityofproteasefrom

V.anguillarum

图4　鳗弧菌胞外蛋白酶的最适pH

Fig.4　OptimumpHofproteasefromV.anguillarumW-1

表2　抑制剂对鳗弧菌胞外蛋白酶的影响

Table2　EffectsofinhibitorsonV.anguillarumW21pro2

tease

抑制剂

Inhibitor

浓度/

（mmol・L-1

Concentration

酶活力/

（U・mL-1

Enzymeactivity

相对活力/%Relativeactivity影响

Effect

对照

Control9200

100100EDTA0110595064167-1100

00100-SDS011735079189-1100265028180-

Urea200092001001008000695075154-PMSF

01109500100100100

9500

10000

3　讨论

胞外蛋白酶被认为是许多细菌病原的毒力因子,但不同的细菌所产生的胞外蛋白酶不同,即使同一菌种的不同菌株其胞外蛋白酶也有一定的差异,

23　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　中国水产科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　第9卷

Miyoshi等[8]从创伤弧菌（Vibriovulnificus分离得到一种金属蛋白酶,其分子量为45kD;Arnesen等[9]发现杀鲑气单胞菌（Aeromonassalmonicidia的个别菌株胞外产物含有高分子量（89~100kD和低分子量（37kD的2类蛋白酶,而大部分菌株只有高分子量蛋白酶,提纯后的低分子量蛋白酶是一种金属蛋白酶,能被EDTA和过量的Zn2+所抑制。

Inamura等[4]从一株致病性鳗弧菌胞外产物中分离到的蛋白酶分子量为36kD,该酶的最适pH为7~8,最适温度50℃,能被EDTA所抑制。

Farrell等[10]通过硫酸铵盐析、DEAE2Sepharose层析、SepharcrylS2200层析及DEAE高效液相层析从鳗弧菌514分离纯化到分子量为38kD和40kD的2种蛋白酶,前者在pH中性偏碱的条件下保持最大活力,对丝氨酸、酪氨酸或酸性蛋白酶抑制剂不敏感,而被EDTA所抑制,属于金属蛋白酶。

表3　金属离子对鳗弧菌胞外蛋白酶的影响

Table3　EffectsofmetalionsonV.anguillarumW212tease

抑制剂Inhibitor

浓度/

（mmol・L-1

酶活力/

（-

Effect

对照

Control

9200100100

CaCl201109550103126+110010600115100+ZnSO40110275029185-11001501163-MgSO40110790085187-1100755082106-FeSO40110725078180-1100360039130-FeCl30110500154-1100160017139-CuSO40110400143-110000-

　　本实验从鳗弧菌W-1培养液分离到的胞外蛋白酶分子量为3617kD,是一热不稳定性蛋白酶,丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF对该酶无抑制作用,110mmol/L的EDTA能使酶活力完全丧失,说明该酶不属于丝氨酸蛋白酶类,而是一种金属蛋白酶;金属离子Cu2+、Fe2+、Fe3+、Zn2+、Mg2+等都对该酶具有抑制作用,而Ca2+对酶有一定的激活作用,可能与活性部位金属离子的取代或位阻作用有关;在酸性环境酶活力迅速丧失,在pH6~10保持较高的酶活性,在碱性条件下酶活力较稳定,该金属蛋白酶与Farrell[10]分离的低分子量组分相似。

各种胞外蛋白酶通过不同方式对宿主发生作用,如霍乱弧菌金属蛋白酶可破坏宿主细胞受体,切断和激活霍乱毒素A亚单位,并能降解肠粘膜以利于霍乱毒素的作用;创伤弧菌金属蛋白酶能通过降解基质膜Ⅳ型胶原蛋白引起溶血反应;嗜水气单胞菌胞外蛋白酶能引起鲫鱼的败血症症状[11],有关鳗弧菌W-1胞外蛋白酶的作用,我们将另文报道。

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80-841

123第4期　　　　　　　　　　陈吉祥等:

1种致病性鳗弧菌胞外蛋白酶的分离纯化及性质　　　　　　　　　　　　

Purificationofanextracellularproteasefrom

Vibrioanguillarumanditsphysicochemicalproperties

CHENJi2xiang,LIUShuang,LIYun,WANGXiang2hong,

DUZong2jun,YUDe2hua,JIWei2shang,

（DarwinLaboratory,CollegeofMarineLifeSciences,OceanUniversityofQingdao,Qingdao266003,China

Abstract:

AstrainofVibrioanguillarumW-1wasisolatedfromthediseasedseaperch（Lateolabraxjaponi2cusinLaizhouBay,ShandongProvince,andanextracellularproteasewaspartiallypurifiedfromthecultureso2lutionoftheV.anguillarumbyammoniumsulfate,DEAE2epharosefastflowandSephadexG-100.There2sultsshowthat,themolecularweightofthepurifiedenzymefromV.anguillarumbySDS-PAGEis36.7kD;theoptimumtemperaturefortheenzymeactivityis50℃,andtheenzymeisheatlabilethatitwouldentire2lyloseitsactivityin15minat70℃;theoptimumpHis7.0;1mmol/LofEDTAandsomemetalions（Cu2+,Fe2+,Fe3+,Zn2+caninhibittheenzymeactivity,butCa2+isonthecontrarythatitcantheenzymetosomeextent.1mmol/LofPMSFhasnoeffectontheenzyme,andtheenzymeisakindofmelallo2protease.

Keywords:

Vibrioanguillarum;extracellularprotease;;

赵法箴　男,1935年5月出生,研究员,中国工程院院士。

海洋生物学家。

现任中国水产科学研究院黄海水产研究所名誉所长,农业部科学技术委员会委员,中国水产学会副理事长,全国政协委员。

长期从事海水养殖、对虾养殖与及实验生态研究。

主持完成“对虾工厂化全人工育苗技术”研究,获国家科学技术进步一等奖、世界知识产权组织金奖,