1种致病性鳗弧菌胞外蛋白酶的分离纯化及性质精.docx

1、1种致病性鳗弧菌胞外蛋白酶的分离纯化及性质精第 9卷第 4期 2002年 12月中 国 水 产 科 学Journal of Fishery Sciences of ChinaVol. 9No. 4Dec. , 20021种致病性鳗弧菌胞外蛋白酶的分离纯化及性质陈吉祥 , 刘 霜 , 李 筠 , 王祥红 , 杜宗军 , 于德华 , 纪伟尚 , (青岛海洋大学 海洋生命学院 , 达尔文实验室 , 山东 青岛 266003摘要 :从山东省莱州海区自然发病的花鲈 (L ateolobrax japanicus 体内分离到 1株致病性鳗弧菌 , 经硫酸铵盐析 、DEAE 2Sepharose Fast

2、Flow 和 Sephadex 2G 100凝胶层析等方法从其培养液中分离纯化了 1种胞外蛋白酶 。 用 SDS 2PA GE 电泳测得蛋白质的分子量为 3617kD , 酶的最适温度为 50 , 对热不稳定 ,70 15min 完全失去活力 ; 最适 p H 为 710;1mmol/L 的 PMSF 对酶活性无影响 , 部分金属离子如 Cu 2+、 Fe 2+、 Fe 3+、 Zn 2+对酶活力有抑制作用 , 而 Ca 2+对酶有一定程度的激活作用 ,1mmol/L EDTA 能完全抑制酶的活性 , 表明该酶是 1种金属蛋白酶 。关键词 :鳗弧菌 ; 胞外蛋白酶 ; 分离纯化 ; 理化性质中

3、图分类号 :S941142 文献标识码 :A -8737-05收稿日期 :2001-11-221基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (39870581 ; 英国达尔文项目(162/8/065 1作者简介 :陈吉祥 (1963- 男 , 副研究员 , 博士后 , 从事海洋微生物学 与免疫学 1 子 , 已从霍乱弧菌 、 创伤弧菌 -34从 11种胞外蛋白 酶 , 证明其对虹鳟 ;Lamas 5利 用鳗弧菌及其胞外蛋白产物对虹鳟进行腹腔注射 后 , 虹鳟表现出极为相似的症状 。肖慧等 6从山东 沿海养鱼场发病鱼的体内分离到 1株致病性鳗弧菌 , 感 染 实 验 表 明 该 菌 株 对 花 鲈 (

4、L ateolabraxjapanicus 等海水养殖鱼类有较强的致病性 , 常伴有严重的血管出血及组织损伤 、 出血等病症 。本研究 从其胞外产物中分离纯化了 1种胞外蛋白酶 , 并进 行酶的理化性质研究 , 以探讨该菌胞外产物对鱼类 组织损伤及致病作用的机制 。 1 材料和方法 111 实验菌株致病性菌株 W -1分离自山东省莱州湾海区发病的花鲈 (L ateolabrax japanicus , 经细菌形态学 、Biolog 系统鉴定为鳗弧菌 (V ibrio an 2guillarum 。112 试剂及仪器DEAE 2Sepharose Fast Flow 、 Sephadex 2G1

5、00购自 Pharmacia 公司 ,SDS 、 丙烯酰胺 、 牛血清蛋白 、 N , N 2亚甲基双丙烯酰胺 、 考马斯亮蓝 R -250、 PMSF等购自上海生物工程公司 , 其余试剂为国产分析纯 。 蛋白层析系统购自上海沪西仪器厂 ,UV -730紫外 分光光度计购自日本岛津公司 ,D YY - 垂直板电 泳仪购自北京六一仪器厂 。 113 实验方法11311 细菌培养及胞外产物获得 细菌的培养用 2216E 海水液体培养基 , 培养温度 28 , 培养时间 24h , 振荡频率为 180r/min 。培养物于 4 5000r/min 离心 10min , 收集上清液 , 再分别用 01

6、45m和 0120m 滤膜过滤 , 滤液 -20 保存备用 。 11312 酶的分离纯化(1 硫酸铵盐析 将上述培养过滤液取出置室温融化后 , 缓慢加入 (N H 4 2SO 4粉末至 80%饱和 度 ,4 过夜 , 于 10000r/min 离心 15min , 收集沉 淀 , 并溶解于 40mL 0. 02mol/L p H 718的 Tris 2HCl 缓冲液 , 于 4 条件下透析 24h , 其间充分换水并搅 动 。 最终体积 50mL 左右 。(2 DEAE Sepharose Fast Flow 层析 将透析 液直接加入经 0102mol/L p H 7. 8Tris 2HCl

7、缓冲液 平衡好的 DEAE -Sepharose Fast Flow 柱 (110cm 15cm , 用含 00. 5mol/L NaCl 的相同缓冲液梯 度洗脱 , 流速 24mL/h , 每管 1mL 收集洗脱液 , 测 定蛋白吸收和酶活力 。(3 Sephadex G 2100柱层析 将收集的上述酶 溶液充分透析 , 并用 PEG 浓缩至体积为 6mL 左 右 , 然后加入到用 0102mol/L p H 7. 8Tris 2HCl 平 衡的 Sephadex G 2100柱 (1cm 100cm 。用相同 缓冲液洗脱 , 流速 15mL/h , 每管 1mL 收集洗脱 液 , 测定蛋白

8、吸收和酶活力 。 收集酶活力集中部分 , 冷冻干燥 。11313 酶活力测定 参照 Inamura 方法 4, 以偶氮 酪蛋白为底物 。 具体方法为 015mL 偶氮酪蛋白溶 液 (5mg/mL , p H 8. 0Tris 2HCl 缓冲液配制 , 加入 011mL 酶溶液 , 再加入 014mL 双蒸水 , 混匀后于 25 保温 20min 。加入 5%的三氯乙酸溶液 315 mL , 于室温 3000r/min 离心 5min , 收集上清加入 015mol/L NaOH 溶液 4. 5mL , 于 440nmOD 值 。 在该条件下 OD 值每增加 11个酶活力单位 (U 。11314

9、 Brad 2 ford 方法进行 7, 。11315 SDS 2PAGE 蛋白酶的分子量测 定采用 SDS 2PA GE 垂直板电泳法 :浓缩胶浓度 3%, 分离胶浓度 10%, 考马斯亮蓝 R 2250染色 , 中分子 量标准蛋白包括磷酸化酶 B 、 牛血清蛋白 、 卵清蛋 白 、 羧肽酶 、 蛋清溶菌酶 。11316 温度对酶活性的影响 按 11313方法在不 同温度下测定酶活力 , 确定酶的最适温度 , 另外将蛋 白酶溶液于不同温度保温 , 每隔 15min 取样并迅速 冷却到室温 , 再测定酶的活力 , 确定温度对酶活力影 响 。11317 pH 对酶活力的影响 分别以不同 p H

10、的缓 冲液配制底物并稀释酶液 , 再按 11313方法测定酶 活力 , 确定酶的最适 p H 。11318 酶抑制剂及金属离子对酶活力影响 将各 种酶抑制剂及金属离子分别加入到酶溶液中 , 于 25 保持 10min , 再用常规方法测定酶活力 , 并计算 酶的活力剩余 。2 结果211 鳗弧菌蛋白酶的分离纯化鳗 弧 菌 蛋 白 酶 粗 酶 液 经 硫 酸 铵 盐 析 后 , 在 DEAE 2Sepharose 柱层析中 , 2峰 , 在 Sephadex G1002峰 , 1,性为 15U/, 4142, 酶的收率为根据该酶在 SDS -PA GE 电泳中的迁移率 , 通 过作图法求得酶的分

11、子量 3617kD (图 1 。213 温度对酶活力的影响该酶的最适反应温度为 50 (图 2 , 是一热不 稳定酶 , 温度较高时 , 随时间延长 , 活力部分丧失 , 超 过 70 时 15min 酶活力即完全丧失 (图 3 。 214 pH 对酶活力的影响该酶的最适 p H 为 710,p H 4时蛋白酶活力很 低 , 而在 p H 610时蛋白酶较稳定 (图 4 。表 1 鳗弧菌胞外蛋白酶的纯化T able 1 Purif ication of protease of Vibrio anguillarum W -1纯化步骤 Purification process 体积 /mLVolu

12、me总活力 /UTotal activity比活力 /(U mg -1Specific activity得率 /%Y ield rate纯化倍数 Relative purification培养过滤液Culture filter900100119310671141041001001100硫酸铵沉淀Ammonium sulfate5010011261069166104621641135DEAE 2sepharose fast flow 柱层析DEAE 2sepharose fast flow610071921052120105411073108Sephadex G 2100层析 Sephadex

13、G 2100 2810041971052196105251234142 913第 4期 陈吉祥等 :1种致病性鳗弧菌胞外蛋白酶的分离纯化及性质 图 1 SDS 2PAGE 电泳测定鳗弧菌胞外蛋白酶的分子量Fig. 1 Molecular w eight analysis of protease fromV. anguillarum by SDS 2PAGE.A 1标准分子量蛋白 :磷酸化酶 b (97400 , 牛血清白蛋白 (66200 ,卵清蛋白 (42700 , 碳酸酐酶 (31000 , 溶菌酶 (14400 ;B 1鳗弧菌 蛋白酶A. Standard molecular weigh

14、t proteins :Phosphorylase b (97 400 , Bovine serum ablumin (66200 , Ovalbumin b (42700 , Carbonic an 2hydrase (31000 , Lysozyme (14400 ; B. Protease from .angillarum.图 2 鳗弧菌胞外蛋白酶的最适反应温度Fig. 2 Optimum temperature of protease from V. anguil 2larum215 酶抑制剂和金属离子对酶活力的影响如 表 2所 示 , SDS 可 部 分 抑 制 酶 的 活 力 ,

15、2mol/L 的 Urea 对酶活力影响不大 , 而增加到 8mol/L 时酶活力部分丧失 ;1mmol/L 的 PMSF 对酶活力 无影响 , 1mmol/L 的 ED TA 完全抑制酶的活性 。 部分 金 属 离 子 对 该 酶 有 一 定 的 抑 制 作 用 , 其 中 Cu 2 +、 Fe 2+、 Fe 3+、 Zn 2+抑制作用较为明显 , 而 Ca 2+对酶有一定程度的激活作用 (表 3 。图 3 温度对鳗弧菌胞外蛋白酶稳定性的影响Fig. 3 E ffects of temperature on stability of protease fromV. anguillarum图

16、4 鳗弧菌胞外蛋白酶的最适 pHFig. 4 Optimum pH of protease from V. anguillarum W -1表 2 抑制剂对鳗弧菌胞外蛋白酶的影响T able 2 E ffects of inhibitors on V. anguillarum W 21pro 2tease抑制剂Inhibitor浓度 /(mmol L -1Concentration酶活力 /(U mL -1Enzyme activity相对活力 /%Relative activity 影响Effect对照Control 9200100100EDTA 0110595064167-1100 001

17、00-SDS 011735079189-1100265028180-Urea 200092001001008000695075154-PMSF011095001001001009500100003 讨论胞外蛋白酶被认为是许多细菌病原的毒力因 子 , 但不同的细菌所产生的胞外蛋白酶不同 , 即使同 一菌种的不同菌株其胞外蛋白酶也有一定的差异 ,23 中 国 水 产 科 学 第 9卷Miyoshi 等 8从创伤弧菌 (V ibrio v ul nif icus 分离得 到一种金属 蛋 白 酶 , 其 分 子 量 为 45kD ; Arnesen 等 9发现杀鲑气单胞菌 (Aeromonas sal

18、 monici dia 的个别菌株胞外产物含有高分子量 (89100kD 和 低分子量 (37kD 的 2类蛋白酶 , 而大部分菌株只有 高分子量蛋白酶 , 提纯后的低分子量蛋白酶是一种 金属蛋白酶 , 能被 ED TA 和过量的 Zn 2+所抑制 。 Inamura 等 4从一株致病性鳗弧菌胞外产物中分离 到的蛋白酶分子量为 36kD , 该酶的最适 p H 为 7 8, 最 适 温 度 50 , 能 被 ED TA 所 抑 制 。 Farrell 等 10通 过 硫 酸 铵 盐 析 、 DEAE 2Sepharose 层 析 、 Sepharcryl S 2200层析及 DEAE 高效液相

19、层析从鳗 弧菌 514分离纯化到分子量为 38kD 和 40kD 的 2种蛋白酶 , 前者在 p H 中性偏碱的条件下保持最大 活力 , 对丝氨酸 、 酪氨酸或酸性蛋白酶抑制剂不敏 感 , 而被 ED TA 所抑制 , 属于金属蛋白酶 。表 3 金属离子对鳗弧菌胞外蛋白酶的影响T able 3 E ffects of metal ions on V. anguillarum W 212 tease抑制剂 Inhibitor浓度 /(mmol L -1酶活力 /(-Effect对照Control9200100100CaCl 201109550103126+ 110010600115100+ Zn

20、SO 40110275029185-11001501163-MgSO 40110790085187-1100755082106-FeSO 40110725078180-1100360039130-FeCl 30110500154-1100160017139-CuSO 40110400143-110000- 本实验从鳗弧菌 W -1培养液分离到的胞外蛋 白酶分子量为 3617kD , 是一热不稳定性蛋白酶 , 丝 氨酸蛋白酶抑制剂 PMSF 对该酶无抑制作用 ,110 mmol/L 的 ED TA 能使酶活力完全丧失 , 说明该酶 不属于丝氨酸蛋白酶类 , 而是一种金属蛋白酶 ; 金属 离子 C

21、u 2+、 Fe 2+、 Fe 3+、 Zn 2+、 Mg 2+等都对该酶具 有抑制作用 , 而 Ca 2+对酶有一定的激活作用 , 可能 与活性部位金属离子的取代或位阻作用有关 ; 在酸 性环境酶活力迅速丧失 , 在 p H 610保持较高的酶 活性 , 在碱性条件下酶活力较稳定 , 该金属蛋白酶与 Farrell 10分离的低分子量组分相似 。各种胞外蛋白酶通过不同方式对宿主发生作 用 , 如霍乱弧菌金属蛋白酶可破坏宿主细胞受体 , 切 断和激活霍乱毒素 A 亚单位 , 并能降解肠粘膜以利 于霍乱毒素的作用 ; 创伤弧菌金属蛋白酶能通过降 解基质膜 型胶原蛋白引起溶血反应 ; 嗜水气单胞

22、菌胞外蛋白酶能引起鲫鱼的败血症症状 11, 有关鳗 弧菌 W -1胞外蛋白酶的作用 , 我们将另文报道 。参考文献 :1 Booth B A , Finkelstein M B , Finkelstein R A . V ibrio cholerae Soluble haemagglutinin/protease is a metalloenzyme J.Infect Immun , 1984, 42:639-644.2 Miyoshi D L , Nakazawa H , K awata et al. Characterization of the hemorrhagic reaction

23、ibrio v ul nif icus metallopro 2 , a J.Infect Immune , -4855. , , 等 1嗜水气单胞菌胞外蛋白酶 EC 2 J1南京农业大学学报 ,1996,19 (3 :88-9414 Inamura H , Nakai Tand Muroga K. An extracellular protease produced by V ibrio anguillarum J.Bull Jap Soc Sci Fish , 1985,51(2 :1915-1920.5 Lamas J , Santos Y , Devesa S , et al. A c

24、omparison of pathogeni 2 cal changes caused by V ibrio anguillarum and its extracellular products in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss J .Fish Pathology , 1994, 29:79-89.6 肖 慧 , 李 军 , 王祥红 , 等 1鲈鱼苗烂鳃烂尾病病原菌的研究 J1青岛海洋大学学报 11999,29(1 :87-9317 Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantific

25、a 2 tion of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein 2dye binding J.Anal Biochem , 1976,72:248-254 8 Miyoshi N , Shimizu C , Miyoshi S , et al. Purification and charac 2 terization of V ibrio v ul nif icus protease J.Microbiol Immunol , 1987, 31(3 :13-25.9 Arnesen A , Eggse

26、t G , J rgensen T . Partial pruification and characterizatin of extracellular metalloproteases from Aermonas sal monici da spp. salmonicida J.J Fish Dis , 1995, 18:283-295.10 Farrell D H , Crosa J H. Purification and characterization of a se 2 creted protease from the pathogenic marine bacterium V i

27、brio an 2 guillarum J.Biochemistry , 1991, 30:3432-3436. 11 储卫平 , 陆承平 1嗜水气单胞菌胞外蛋白酶对鲫鱼的致病性 J1南京农业大学学报 ,2000,23(2 :80-841123第 4期 陈吉祥等 :1种致病性鳗弧菌胞外蛋白酶的分离纯化及性质 Purif ication of an extracellular protease fromVibrio anguillarum and its physicochemical propertiesCHEN Ji 2xiang , L IU Shuang , L I Yun , WAN

28、G Xiang 2hong ,DU Z ong 2jun , YU De 2hua , J I Wei 2shang ,(Darwin Laboratory , College of Marine Life Sciences , Ocean University of Qingdao , Qingdao 266003, China Abstract :A strain of V ibrio anguillarum W -1was isolated from the diseased seaperch (L ateolabrax japoni 2 cus in Laizhou Bay , Sha

29、ndong Province , and an extracellular protease was partially purified from the culture so 2 lution of the V . anguillarum by ammonium sulfate , DEAE 2epharose fast flow and Sephadex G -100. The re 2 sults show that , the molecular weight of the purified enzyme from V . anguillarum by SDS -PA GE is 3

30、6. 7 kD ; the optimum temperature for the enzyme activity is 50 ,and the enzyme is heatlabile that it would entire 2 ly lose its activity in 15min at 70 ; the optimum p H is 7. 0;1mmol/L of ED TA and some metal ions (Cu 2+, Fe 2+,Fe 3+,Zn 2+ can inhibit the enzyme activity ,but Ca 2+is on the contra

31、ry that it can the enzyme to some extent. 1mmol/L of PMSF has no effect on the enzyme ,and the enzyme is a kind of melallo 2 protease.K ey w ords :V ibrio anguillarum ; extracellular protease ; ;赵法箴 男 ,1935年 5月出生 , 研究员 , 中国工程院院士 。海洋生物学家 。现任中国水产科学 研究院黄海水产研究所名誉所长 , 农业部科学技术委员会委员 , 中国水产学会副理事长 , 全国政协 委员 。 长期从事海水养殖 、 对虾养殖与及实验生态研究 。 主持完成 “对虾工厂化全人工育苗技术” 研究 , 获国家科学技术进步一等奖 、 世界知识产权组织金奖 ,