实验教案.docx

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实验教案

实验一 基本操作训练

[实验目的]

1． 掌握一般玻璃仪器的洗涤方法和刻度吸量管的使用

2． 了解实验室的一般规则，点收实验仪器

3． 了解生物化学实验的基本要求，强调实验考核的方法

4． 了解实验报告的内容和书写格式

[实验规则]

1． 穿白大褂，保持安静

2． 爱护仪器，若不慎损坏及时报告老师

3． 保护实验台

4． 节约使用试剂

5． 废液废物的处理，安排值日

6． 养成良好的实验习惯

[实验要求]

1． 预习

2． 原始记录本

3． 实验报告的书写

[清点仪器]

   P2表1

[玻璃仪器的洗涤]

1． 一般玻璃仪器：

肥皂水刷洗→自来水冲洗→蒸馏水润洗→倒置沥干

2． 容量分析仪器

[吸量管]

1． 分类：

奥氏吸量管；移液管；刻度吸量管

2． 使用方法：

拿→取→调→放

3． 选用原则

[液体的混匀]

1． 旋转法

2． 指弹法

3． 甩动法

4． 倒转法

5． 搅拌法

实验二血红蛋白衍生物吸收光谱测定

[实验目的]

1． 掌握分光光度法的原理及722型分光光度计的使用

2． 掌握物质吸收光谱的绘制方法

3． 熟悉氧合血红蛋白和碳氧血红蛋白的吸收光谱

[实验原理]

血红蛋白衍生物具有特征性吸收光谱，可作为它们定性和定量分析的基础。

本实验先制备血红蛋白衍生物HbO2、HbCO，在不同波长（λ）下测其吸光度（A），并以A为纵座标，λ为横座标绘制两者的吸收光谱。

分光光度法

1． 光吸收基本定律—Beer定律

2． 溶剂空白

3． 吸收曲线

722型光栅分光光度计的结构

[基本操作]

1． 制备血红蛋白衍生物HbO2、HbCO

全血2滴+蒸馏水10ml→HbO2液（鲜红色）

HbO2液5ml+CO→HbCO液（樱桃红色）

2． 在500—600nm分别测定HbO2、HbCO吸光度

在722型分光光度计上，以蒸馏水作为空白调零，在相应峰值的10nm范围内每隔2nm记录一次吸光度值，其余每隔10nm记录一次。

   3．以A为纵座标，λ为横座标绘制两者的吸收光谱

[注意事项]

1． 722型分光光度计的使用

2． 比色杯的使用

[小结]

1． 有的学生忘记分光光度计的使用，应反复强调之。

2． 有的学生长时间测量，导致分光光度计稳定性下降。

[思考题]

1． 什么叫吸收光谱？

测定HB及其衍生物的吸收光谱有何意义？

2． HB属于哪类蛋白质？

它的吸收光谱的特征反映它的什么结构成分？

3． 什么叫吸光度、透光度、消光系数？

实验三酵母RNA的提取及核酸成分鉴定

[实验目的]

1． 掌握浓盐法提取酵母的原理及方法

2． 熟悉核酸成分鉴定的方法

3． 掌握离心机的使用及注意事项

[实验原理]

酵母细胞中RNA含量多，利用浓盐及加热的条件，使酵母细胞中的RNA以可溶性钠盐的形式析出，离心后在低温中调节pH值至RNA等电点使其沉淀，再离心得到RNA，利用其不溶于有机溶剂的性质去除杂质，提纯RNA。

此方法得到的是变性及部分降解的RNA。

RNA可用酸解，酸解组分分别进行鉴定。

磷酸与钼酸铵作用生成磷钼酸，在有还原剂存在的情况下可生成钼兰；核糖在浓酸作用下脱水，再与5-甲基间苯二酚反应生成鲜绿色物质；嘌呤与硝酸银在碱性环境下共热生成嘌呤盐基银，为棕褐色沉淀。

[基本操作]

1． 提取RNA

2． 离心分离RNA

3． 沉淀RNA

4． 离心洗涤RNA

5． 水解RNA

6． 鉴定RNA水解成分

[注意事项]

1． 离心机的使用及离心前的平衡

2． 两次离心各保留什么

3． 两次调pH值各用什么试纸及比色卡

4． 两次使用氨水分别在什么时候

[小结]

1． 硝酸银与嘌呤反应速度较慢，可能与实验条件有关。

2． 钼蓝检验磷酸时，硫酸铁结晶不宜过多，否则会引起溶液混浊。

[思考题]

1． 两种氨水分别于什么时候用？

2． 两次离心各保留什么？

3． 两种PH试纸及纸板怎么用？

实验四Folin—酚试剂法测血清总蛋白含量

[实验目的]

1． 掌握L—B定律在定量实验中的运用

2． 掌握Folin—酚试剂法的显色原理

    3．掌握用标准管法及标准曲线法的计算过程

4．掌握设计定量分析实验的方法

[实验原理]

本实验运用两种方法测定血清总蛋白。

1．L—B定律在定量实验中的运用

   ①L—B定律:

指溶液对辐射能的吸收与溶液中的吸收物质的浓度和溶液的厚度成正比，其数学表达式为log（P0/P）=εbc=A

   ②标准曲线的绘制：

波长的选择；适当的分析条件；5个以上的标准溶液。

   ③结果与计算：

标准曲线法；标准管法。

   ④误差分析：

L—B定律的局限性；仪器误差；化学误差；人为误差。

   2．Folin—酚试剂法的显色原理

   ①碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜复合物。

   ②蛋白质-铜复合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂，生成兰色物质。

在一定条件下，兰色强度与蛋白质含量成正比。

[基本操作]

   1．取洁净试管7支，按下表操作（单位：

ml）

空白管

标准管

待测管

1

2

3

4

5

6

7

标准蛋白液

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

—

待测血清

—

—

—

—

—

—

1.0

蒸馏水

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

—

—

试剂甲

3.0

3.0

3.0

3.0

3.0

3.0

3.0

混匀，室温放置10分钟

试剂乙

0.3

0.3

0.3

0.3

0.3

0.3

0.3

立即混匀，速度要快

30分钟以后，以空白管为对照，在660nm处比色。

2．绘图及结果计算

[注意事项]   吸量管的选用

[小结]

1． 加入各管试剂时动作要快，否则各试管反应时间不同，影响结果。

2． 复习分光光度计的使用。

[思考题]

1． 什么叫标准曲线？

2． 绘制标准曲线有何实用意义？

实验五 蔗糖酶和淀粉酶的专一性

[实验目的]

1． 理解酶专一性的含义

2． 学习一种定性检查还原性糖的方法

[实验原理]

酶作用有专一性，一种酶只作用于一种或一类化合物的一定化学键，催化一定的化学反应，产生一定的产物。

蔗糖是二糖，由葡萄糖和果糖组成；棉子糖是三糖，由半乳糖、葡萄糖和果糖。

两者分子内部均有α-吡喃葡萄糖1、2β呋喃果糖苷键，此化学键可被蔗糖酶催化水解，故蔗糖酶可水解蔗糖及棉子糖。

淀粉是大分子物质，由许多葡萄糖分子以α1、4葡萄糖苷键及α1、6葡萄糖苷键连接而成，唾液淀粉酶专一水解α1、4葡萄糖苷键，所以可水解淀粉，但不能催化蔗糖和棉子糖的水解。

蔗糖、棉子糖和淀粉均无还原性，但它们的水解产物中均有还原性糖，班氏试剂与还原性糖在共热时可产生红棕色氧化亚铜沉淀，可据此检验蔗糖、棉子糖和淀粉有无水解。

[基本操作]

1． 蔗糖酶的提取

   酵母2g+甲苯2ml→搅拌至酵母液化，加水5ml后混匀→3000转/分离心10分钟→收集沉淀→加水1.5ml甲苯0.2ml→混匀后30℃水浴过夜→稀醋酸调pH至3.5-4.0→3000转/分离心10分钟→收集上清液→加硅藻土少量→混匀后过滤→滤液用氨水中和至pH值5→4℃保存备用

2． 淀粉酶的提取

   用水漱口后取唾液过滤即可

3． 酶专一性的鉴定

   按照书上表格加入试剂后在37℃水浴30分钟，另取6支各加班氏试剂1ml沸水浴后取保温过试管中的液体分别加入，继续沸水浴并观察结果。

[注意事项]

1． 注意蔗糖酶提取中几次调pH值及作用

2． 注意离心前的平衡

3． 注意各水解液的吸量管不能混用

4． 淀粉与蔗糖酶反应管可能出现假阳性

[小结]

   1．本实验较易成功，现象明显。

   2．如在唾液中加入少许氯化钠，可提高活性。

[思考题]

1． 联系实验解释酶作用的专一性。

2．根据实验结果指出淀粉酶和蔗糖酶分别催化什么化学键的水解。

3．淀粉与蔗糖酶反应管经常出现假阳性，为什么？

实验六 底物浓度及抑制剂对酶活性的影响

[实验目的]

1． 通过实验加深对酶动力学理论的理解

2． 掌握用Lineweaver-Burk方程求米氏常数

3．熟悉碱性磷酸酶所催化的化学反应及酶活性的检测方法

4．进一步熟悉分光光度法

 [实验原理]

酶动力学研究酶促反应速度（初速度）与影响因素（酶浓度、底物浓度、温度、pH值、激活剂、抑制剂等）之间的关系。

本实验以碱性磷酸酶为例，磷酸苯二钠为底物，磷酸氢二钠为竞争性抑制剂。

反应产物苯酚在碱性环境下还原磷钨酸-磷钼酸试剂，生成兰色物质。

在一定条件下，兰色强度与苯酚含量成正比。

控制反应时间在一定初速度范围，则反应速度与苯酚产量即兰色强度成正比，可据此用吸光度代替反应速度分析其与底物浓度及抑制剂之间的关系。

[基本操作]

取12支洁净的试管，做好标记，按实验教材表加入试剂，在分别以0管为空白调零，在660nm处比色。

[注意事项]

1． 底物0管均为0.2ml

2． 第一次混匀后于37℃预热5分钟

3． 两种碱性缓冲液不能混淆

4． 加碱性磷酸酶及酚试剂用微量加样器

①    0管不能加酶

②    每管准确计时

③试管一直置于水浴箱中

[结果计算]

以1/A—1/[S]作图，求出Km值及表观Km值。

[小结]

1． 本实验应重点介绍米氏方程及其意义。

2． 应严格控制实验条件、加样量、温度反应时间等。

[思考题]

   1．底物浓度、竞争性抑制剂对米氏常数有何影响？

实验七 血清蛋白电泳

[实验目的]

1． 了解电泳的基本原理及分类

2． 掌握用醋酸纤维薄膜分离血清蛋白的原理和方法

3．了解血清蛋白质的种类和结构特点

[实验原理]

   1．定义：

带电颗粒在电场中向电性相反的方向移动的现象。

可分为自由界面电泳与区带电泳，其中区带电泳为生物学中常用的技术。

   2．分类：

分类方法及类型

   3．基本原理：

V=Eq/6πrη

   4．血清蛋白的分离：

蛋白质是两性电解质，各种等电点不同，在缓冲溶液中依分子量大小与带电量不同区分。

   5．固定染色和漂洗

[基本操作]

1． 泡膜

2． 仪器准备

3． 点样

4． 电泳

5． 固定染色

6． 漂洗

7． 观察结果及定量

[注意事项]

   点样是本实验成功的关键，一定要强调及示范。

正式电泳前进行预电泳

[小结]

1． 电泳时电压过高，易导致蛋白质受热变性，形成及不规则的色带。

2． 洗脱时将上一次的洗脱液尽量从薄膜上流尽再转入下一洗脱皿，这样可提高洗脱效率。

[思考题]

   1．为何电泳法可分离血清蛋白？

实验八 凝胶过滤分离高铁血红蛋白及高铁氰化钾

[实验目的]

1． 了解层析技术分类及其分离物质的基本原理

2． 掌握分子筛效应分离物质的原理

3． 掌握凝胶过滤分离物质的方法

[实验原理]

   本实验利用层析法分离分子量大小不同的物质。

层析的定义及分类

   凝胶的结构与性质：

交联葡聚糖的交联度、G值与工作范围

   分子筛效应：

根据分子量大小分离物质

   透析的原理：

半透膜

   鉴定：

蛋白质用沉淀反应，磷酸用颜色反应

[基本操作]

1． 凝胶准备

2． 装柱

3． 样品处理

4． 上样

5． 洗脱

6． 收集

7． 透析

8． 鉴定

[注意事项]

凝胶及透析袋的回收。

[小结]

   1．关于实验中若干概念性术语宜先做解释。

2．上样步骤要强调，并先做示范。

[思考题]

1． 凝胶过滤的原理是什么？

2． 什么叫透析，反透析，透析平衡及超滤？

实验九 乳酸脱氢酶同工酶活性测定

[实验目的]

1．  掌握同工酶的概念及乳酸脱氢酶同工酶活性测定的临床意义

2． 掌握乳酸脱氢酶同工酶活性测定的原理和方法

3． 通过实验加深对同工酶含义的理解

4．进一步熟悉电泳技术的原理和方法

 [实验原理]

     不同组织有不同的同工酶谱，当组织受损时，其酶谱可以在血液中反映出来，有助于诊断与观察疾病预后。

乳酸脱氢酶同工酶在一般组织中有五个组分，其亚基组成如下表：

LDH1

LDH2

LDH3

LDH4

LDH5

亚基

H4

H3M

H2M2

HM3

M4

H和M亚基的一级结构已知，M亚基喊碱性氨基酸较多，因此在pH8.6的缓冲液中，M亚基带电荷较H亚基少。

故在此缓冲液中，从LDH1到LDH5带负电荷量依次递减，各份向正级移动的速度不同而可以分离。

其中LDH1泳动最快，依次为LDH2、LDH3、LDH4，最慢为LDH5。

酶活性的检测需利用酶将特定的底物转化为有色物，或者偶联显色反应，即电泳后将支持物与含有底物（包括其它显色所需试剂）的另一支持物相互接触，在适当环境中保温，从而检测酶的活性。

本实验采用偶联显色反应。

[基本操作]

1．泡膜

2．仪器准备

3．点样

4．电泳

5．保温染色

   6．观察结果

[小结]

1． 本实验中，盖膜是本实验成功的关键，予操作示范。

2． 点样量要比醋酸纤维薄膜电泳稍多。

[思考题]

   1．同工酶的概念是什么？

实验十 聚丙烯酰胺凝胶电泳

[实验目的]

1． 掌握不连续电泳分离物质的三个效应

2． 掌握聚丙烯酰胺凝胶的制备技术

3． 比较交联葡聚糖与聚丙烯酰胺凝胶分子筛效应的异同

[实验原理]

本实验采用不连续系统（即缓冲液成分、pH值及凝胶孔径不连续）聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过浓缩效应、分子筛效应、电荷效应，可将血清中各蛋白质成分按其分子大小、电荷多少而进行高效分离。

1．聚丙烯酰胺凝胶的制备、结构和性质：

①聚合反应②催化体系③影响因素④结构与性质。

2．聚丙烯酰胺凝胶电泳的不连续体系

3．浓缩效应

4．电荷效应

   5．分子筛效应（与交联葡聚糖相比较）

   6．蛋白质的分离

[基本操作]

1． 准备电泳管

2． 分离胶的制备与灌分离胶

3． 浓缩胶的制备与灌浓缩胶

4． 准备电泳槽

5． 样品制备

6． 上样

7． 电泳

8． 剥胶

9． 固定、染色与漂洗

[注意事项]

示范剥胶

[小结]

1． 本实验综合了凝胶过滤和电泳技术，操作过程比较复杂，所以应详细讲解及示范。

2． Acr和bis都是剧毒物质，操作时要小心。

[思考题]

1． 圆盘电泳的分辨率为什么比其他电泳高？

2． 圆盘电泳的分子筛效应与凝胶过滤的分子筛效应原理上有何不同？

实验十一 酶法测定血清葡萄糖

[实验目的]

1． 掌握酶法测定血糖的原理和方法

2． 掌握血糖测定的临床意义

3． 了解血糖测定的方法学比较

[实验原理]

本实验反应分两步，首先葡萄糖与氧气在葡萄糖氧化酶的作用下生成葡萄糖酸与过氧化氢，接着过氧化氢与4-氨基安替比林和酚在过氧化物酶的催化下生成醌亚胺染料。

醌亚胺染料是一种红色染料，在一定条件下，红色程度与葡萄糖含量成正比。

在500nm波长下与标准同时比色测定求得血糖含量。

本法测得正常值约为3.9—6.1mmol/L

[基本操作]

   1．标本处理

      抽静脉血3000转/分离心10分钟，取上清液（血清）备用。

   2．取3支洁净小试管，按下表操作

空白管

标准管

待测管

血清（ul）

—

—

10

标准葡萄糖液（ul）

—

10

—

酶工作液（ml）

1.5

1.5

1.5

   混匀，置37℃水浴10分钟，在500nm波长下比色。

[注意事项]

1． 用小试管，0.5cm比色杯

2． 标准液取完后及时上盖

[结果计算]

血糖含量（mmol/L）=待测管吸光度/标准管吸光度×5.55mmol/L

[小结]

   1．本法特异性高，维生素C等引起负偏差。

2．标准液吸取后应立即盖上，以防水分挥发。

[思考题]

  1．酶法测血糖有什么优点？

  2.正常人饭后血糖测定时偏高，而饥锇时血糖仍维持正常水平，为什么？

实验十二 血清尿酸测定

原理：

尿酸是核苷酸中嘌呤分解代谢的最终产物，最终由肾脏排除。

血清尿酸含量测定对于痛风、肾炎、慢性白血病的疾病诊断有帮助。

   由于血清中蛋白质对尿酸的测定有干扰，在测定尿酸前，先用钨酸钠蛋白沉淀剂去除血清中的蛋白质。

尿酸则在碱性条件下能将磷钨酸还原成钼蓝，其蓝色的深浅与血清尿酸含量成正比，与同样处理的尿酸标准液一起比色，即能计算出血清尿酸的含量。

设计要求及提供的条件：

一.标准尿酸曲线的绘制：

1.标准尿酸液：

浓度为1mg/100ml;

2.做一空白管和五标准管，要求各标准管尿酸含量依次为0.005，0.010，0.015，0.020，0.025mg，各管需加标准液多少毫升？

（0.5’）

3.各管补充蒸馏水至3毫升，各管应加水多少毫升？

（0.5’）

4.各管依次加入14%碳酸钠1毫升、磷钨酸试剂1毫升，混匀，于室温静置15分钟；

5.以空白管对照，于660nm处比色，读取吸光度；（8分钟比完）

6.以各标准管尿酸含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

二.血清尿酸含量的测定：

1.样品为血清；

2.制备无蛋白血滤液：

取血清0.5毫升，加入多少毫升浓度为1g/100ml的钨酸钠蛋白质沉淀剂，钨酸钠蛋白质沉淀剂终浓度为0.009g/ml？

（0.5’）

3.假设待测血清尿酸含量为5mg/100ml，为使待测管与标准管第三管的尿酸含量（0.015mg）相当，应取无蛋白血滤液多少毫升？

（0.5’）

4.以标准管法计算血清尿酸含量，列出计算公式（以第三管为标准，注意稀释倍数）。

5.写出操作表格及简要步骤？

（1’）

6.列出本实验所需吸量管的型号及数量？

（1’）

三．操作

1.无蛋白血滤液制备：

0.5ml血清+4.5ml蛋白质沉淀剂，于小试管中混匀，3000转/分离心5分钟，小心将上清液倒入另一洁净试管中；

2.按下表操作

 试剂（ml）                 0              1                2               3             4                5            待测

UA标准液

蒸馏水

血滤液

0.0

3.0

0

0.5

2.5

0

1.0

2.0

0

1.5

1.5

0

2.0

1.0

0

2.5

0.5

0

0.0

0.0

3.0

14%碳酸钠

磷钨酸试剂

全部加1毫升

全部加1毫升

混匀，室温静置15分钟，以空白为对照，660nm处比色（8分钟内比色完毕）

3.绘制标准曲线，用标准曲线法和标准管法求取血清尿酸浓度

公式：

Cx（mg/ml）=Ax/As×Cx×10×5/3