对乙酰氨基酚对心肌细胞HO损伤保护作用.docx
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对乙酰氨基酚对心肌细胞HO损伤保护作用
对乙酰氨基酚对心肌细胞H2O2损伤的保护作用
辽孝
kg
屋
Me
学
dic
院
al
20o8Jun.
29（3）JLiaoningMedicaUniversity……
对酰氨基酚对心肌细胞H2O2损伤的保护作用
钟彩琴,刘义,吕俊杰.,胡长宏
（1.辽宁医学院药理学教研室,辽宁锦州121001;2.辽宁医学院附属第一医院骨科,辽宁锦州121001）
摘要:
目的研究对乙酰氨基酚（acetaminophen,APAP）对H:
0:
引起的心肌细胞损伤的保护作用.方法原代SD大
鼠乳鼠心肌细胞培养,48h后加入H:
（）2造成心肌细胞损伤,损伤前1h加入不同浓度的APAP作为保护剂.损伤6h后,
甲基四唑蓝比色（Mar）法测定线粒体脱氢酶活性,试剂盒测定培养液中乳酸脱氢酶（LDH）活性,心肌细胞中脂质过氧
化产物丙二醛（MDA）含量,超氧化物歧化酶（SOD）活性,Caspase一3活性.结果H:
O:
能明显造成心肌细胞损伤,表
现为:
细胞活力降低,LDH活性增加,MDA含量增加,SOD活性下降,easpase一3活性增高;20i.~mol?
L～,60ixmol?
L～,180Ixmol?
L的APAP对HO引起的心肌细胞损伤有保护作用,并随浓度增加保护作用加强.结论APAP能减轻
H2（）2对心肌细胞的损伤作用,抑制H2O2引起的培养心肌细胞凋亡.
关键词:
对乙酰氨基酚;H2O2;心肌细胞;凋亡
中图分类号:
Q952.6文献标志码:
A文章编号:
1674一o424（2008）O3—0206一o4
ProtectiveEffectofAcetaminophenonCulturedCardiacMyocytesJnjuredbyH202
ZHONGCaiqin,LIUYi,LVJunjie,HUChanghong
（1.DepartmentofPharmacology,LiaoningMedicalUniversity,Jinzhou121001China;
2.DepartmentofOrthopaedics,theFirstAffiliatedHospitalofLiaoningMedicalUniversity,Jinzhou121001China）
Abstract:
ObjectiveThepurposeofthisinvestigationwastodeterminetheroleofacetaminophenonculturedneonatalratcar-
diacmyoeytesinjuredbyH202.MethodsCulturedneonatalratcardiacmyocyteswerepretreatedwithacetaminophen（20Ixmol-
L"
6oIxmol?
L～and180I.tmol?
L）for1hbeforetreatedwithH2O2（0.2mmol?
L）for6h.Theactivityofdehydrogenase
inmitochondriawasdetectedbyMTTassay.TheactivityofLDH,contentofMDA,activityofSODandcaspase一3weredetermined
byLDH,MDA,SODandeaspase一3kit.ResultsThedescentoftheactivityofdehydrogenaseinmitochondriadetectedby
（Mar）,theincreaseofLDHinculturemedium,theelevationofMDAandtheincreaseactivityofcaspase一3inducedbytreatmentof
H2O2weresignificantlyreversedbyacetaminophen.Theeffectofacetaminophenwasincreasedwiththerisingofitsconcentration.
ConclusionsAeetaminophencoulddecreasetheinjuryofeardiomyoeytesinducedbyH202,inhibittheapoptosisofeardiomyoeytes
inducedbyH2O2,andthiscardioprotectiveeffectmayberelatedtotheantioxidantnatureofthedrug.
Keywords:
acetaminophen;hydrogenperoxide;eardiomyocyte;apoptosis
对乙酰氨基酚（acetaminophen,APAP）作为
治疗疼痛和发热的主要药物已有50多年的历史了,
遗憾的是,关于APAP的研究一直集中在解热镇痛
和肝毒性方面,而该药对哺乳动物其它器官（如
心脏和循环系统）的作用却被忽略了.直到今天,
人们关于APAP对哺乳动物的呼吸,肾脏,内分
泌,神经,胃肠道,心血管系统的作用还知之甚
少.最近国外研究显示,APAP对哺乳动物心肌有
保护作用:
APAP对豚鼠离体心脏缺血再灌注损伤
有保护作用【】;对在体犬的心肌梗死有保护作
用.但其对心肌保护作用的确切机制以及对培
养心肌细胞损伤的作用还有待于进一步研究.本实
验通过HO引起的培养心肌细胞损伤模型进一步
探索APAP在细胞水平对心肌的作用及其机制.
1材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物出生2—3d的Sprague—Dawley
（sD）大鼠,雌雄不拘,由辽宁医学院实验动物
中心提供.
作者简介;钟彩琴（1981）,女,山西省晋城市人,在读硕士研究生,主要研究方向为心血管药理学.
通信作者:
刘义（1964）,男,辽宁省锦州市人,教授,硕士研究生导师,主要研究方向为心血管药理学.
钟彩琴,等:
对乙酰氨基酚对心肌细胞H:
O:
损伤的保护作用
1.1.2主要药品和试剂APAP:
Sigma公司,用
前溶于DMEM,配成所需浓度,调pH值为7.2;
Trypsin（1:
250）:
Sigma公司;DMEM低糖培养
基:
Gibco公司;新生牛血清:
杭州四季青生物科
技有限公司;LDH,MDA,SOD试剂盒:
南京建
成生物工程研究所;M,rI':
Sigma公司;培养板:
Becton公司.
1.1.3主要仪器79—1磁力加热搅拌器:
'江南
金坛电视大学应用电子厂;OLYMPUS倒置显微
镜:
日本;800型离心沉淀器:
上海手术器械厂;
全自动生化分析仪:
BECMANCX5PRO;恒温水浴
振荡器:
江苏金坛中大仪器厂;DG3022A型酶标
仪:
南京东华电子集团;恒温水浴振荡器:
江苏金
坛中大仪器厂.
1.2方法
1.2.1原代心肌细胞培养取出生2～3d的SD
大鼠乳鼠,雌雄不拘..无菌条件下,酒精消毒皮
肤,开胸剪取心脏,用DMEM液洗涤3次后,剪
成约1mm的小块,加人0.08%胰蛋白酶消化液5
mL,在磁力搅拌器上（35℃～37℃）进行消化.
重复以上过程4～6次,直至将组织块消化,细胞
分离完全.以1000r/min离心8～10rain,吸弃上
清液,加人含15%新生牛血清的DMEM培养基
（含庆大霉素4万U?
L）,混悬沉淀的细胞,以
100钼钢网过滤后置人CO孵箱,37℃静置培养
1.5～2h,以差速贴壁法纯化心肌细胞.将细胞密
度调至（5×10）?
mL或（1×10.）?
mL～,
0.4%台盼蓝染色,活细胞存活率>90%,接种培
养板（培养瓶）,送人通以5%CO孵箱.每48h
更换1次培养液,培养2～3d,进行指标测定.
1.2.2实验分组将培养48h的细胞分为5组
①正常对照组:
不加任何药物;②HO损伤组;
@20txmol?
LAPAP保护组;④60txmol?
L
APAP保护组;⑤18Otxmol?
LAPAP保护组.损
伤组在正常心肌细胞培养48h后加人终浓度0.2
mmo|?
L的HO作用6h;各保护组加人不同浓
度的APAP孵育1h后,加人与损伤组相同的处理
因素.
1.2.3线粒体脱氢酶活性测定原代心肌细胞培
养,将细胞密度调至（1×10）?
mL～,接种于
96孔培养板,各组分别对应加人处理因素.于测
试前4h,每孔加人2OLMTT（MTT终浓度0.5
mg?
mL）;于cO孵箱中继续培养4h后弃去培
养液,每孔加人二甲基亚砜100L,震荡10min,
使充分溶解,用酶联检测仪检测各孔OD值（检测
波长为570nm）,可间接反映细胞活性的高低.
1.2.4心肌细胞SOD,MDA,LDH的测定收集
细胞参照试剂盒说明书MDA采用硫代巴比妥显色
法测定,SOD采用黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶法测定活
性.收集培养上清液根据试剂盒说明用全自动生化
分析仪测培养介质中LDH活力.
1.2.5Caspase一3活性的定量检测收集细胞,
每份样本加人5OL细胞裂解液,冰上孵育1O
min,离心（10000r/min,4℃,5min）,留取上
清（其中5L用BCA法作蛋白定量）.吸取含
100Ixg蛋白的细胞裂解上清,用细胞裂解液补足
至总体积5OL,加5OL反应缓冲液于每一样品
管中并加5L底物,37℃避光4h.用酶标仪在
405nm处测定其吸光值,用OD值间接表示
caspase一3的活性o
1.2.6统计分析实验数据应用SPSS11.5软件
包进行统计分析,采用方差分析及LSD—t检验进
行统计学处理.
2结果
2.1APAP对心肌细胞活性的影响,OD值大小可
间接反映心肌细胞活力高低.分析数据可知HO
组比正常对照组细胞活力降低,说明心肌细胞受到
损伤;不同浓度APAP组较损伤组细胞活力增加,
随浓度增加作用明显.说明APAP能保护HO损
伤的心肌细胞,并有剂量依赖性,见表1.
表1对乙酰氨基酚对H:
02损伤心肌细胞活性
（oD值）的影响（±s,n:
8）
组别MTI"（OD）
正常对照组
H2O2损伤组
H2O2+APAP20i~raol?
L一
H202+APAP60i~raol?
L'
H202+APAP180i~raol?
L'
注:
与正常对照组比较,一P（0.01;与H202损伤组比较,
P（0.01
2.2APAP对培养液中LDH活性,细胞内MDA
含量和SOD活性的影响结果显示,与正常对照组
比较,H2O2组LDH活性和MDA含量明显高于正
常组,SOD活性明显低于正常组,不同浓度APAP
组较损伤组LDH活力和MDA含量有所降低,SOD
活性有所增加,并随浓度增加效果明显,见表2.
7●###
叭
∞
208辽宁医学院2008年6月,29（3）
表2对乙酰氮基酚对H2o2损伤心肌细胞LDH活性,MDA含量,SOD活性的影响（i±,,I=6）
注:
与正常对照组比较,一P<O.O1;与H202损伤组比较,P<O.O1
2.3APAP对H202所致心肌细胞Caspase一3活化
的影响Caspase一3活性定量检测结果显示,与正
常对照组比较,HO组Caspase一3活性明显高于
正常组,不同浓度APAP组较损伤组Caspase一3活
性有所降低,并随浓度增加效果明显,见表3.
表3对乙酰氮基酚抑制H:
O:
所致心肌细胞
Caspase-3活化（i±,n=6）
组别OD值
正常对照组
H2o2损伤组
H2o2+APAP20ttmol?
L
H202+AP^P60ttmol?
L一'
H2o2+AP^P180ttmol?
L一
注:
与正常对照组比较,一P<O.O1;与H202损伤组比较,P
<0.O1
3讨论
APAP像许多镇痛药一样属于酚类,具有天然
的抗氧化作用.APAP的抗氧化作用已得到较多的
体外实验证实"q].本实验研究APAP对H0引
起的心肌细胞损伤是否有保护作用并探讨其机制.
近年来活性氧自由基对心脏的损伤作用已经引
起人们足够的重视.研究表明,在多种病理过程
中,氧自由基及由它引起的脂质过氧化发挥极其重
要的作用,如心肌缺血再灌注时会造成抗氧化保护
机制的改变,同时产生大量的自由基,活性氧自由
基对心脏的损伤作用已引起人们的广泛重视,近期
研究认为自由基导致的细胞凋亡是心肌受损的主要
途径【9—10].氧自由基直接参与心肌细胞凋亡也已
得到证实【l】引.研究发现,高浓度的氧自由基对
细胞的作用是导致坏死,低浓度的氧自由基会导致
细胞凋亡…]..H0是ROS的一种,可以在
细胞外诱导细胞凋亡,UV,离子射线作用细胞后,
细胞内也可产生HO,它作为信使参与细胞内氧
化还原途径,也可致细胞凋亡¨MJ.
细胞凋亡是指在一定的生理或病理条件下,遵
循自身的程序,通过启动内部机制,主要是内源性
DNA内切酶的激活,自己结束其生命的过程.在
整个过程中涉及到一系列特殊基因的表达,随之细
胞发生特征性的形态学和生化变化.Caspsse一3含
有227个氨基酸残基,其编码分子量为32kD,是,
细胞凋亡过程中重要的终末剪切酶,通常以无活性
的酶原形式存在,凋亡信号使其转变成有活性的
酶,在凋亡中所起的作用不可替代.作为凋亡终末
剪切酶,Caspsse一3的激活是细胞凋亡最具有特征
性的分子标志.
本研究通过对培养心肌细胞的培养液中LDH
活性,细胞内MDA含量及SOD活性的测定,表明
20/xmol?
L～,60/xmol?
L和180/xmol?
L的
APAP对H0引起的心肌细胞氧化损伤表现出保护
作用,并随浓度增加作用增强.通过对Caspase一3
活性的检测,表明APAP在该浓度范围内对H0
引起的培养心肌细胞凋亡有保护作用,并随浓度增
加作用增强.
总之,本实验结果表明APAP能减轻H0对
心肌细胞的损伤作用,抑制H0引起的培养心肌
细胞凋亡.其对培养心肌细胞H0损伤的保护作
用可能是通过其本身的抗氧化作用来实现的,但其
确切机制仍有待于进一步的实验研究.
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朋叭m
67卯
钟彩琴,等:
对乙酰氨基酚对心肌细胞HO损伤的保护作用209
（上接第203页）
产生保护作用的机制可能与抑制氧自由基的堆积,
细胞内钙超载,细胞凋亡等有关.
氧自由基堆积所引发的脂质过氧化反应参与了
再灌注损伤.本研究中测定的SOD活性可反映机
体清除氧自由基的能力,MDA含量则反映机体的
脂质过氧化程度.本实验结果显示IPO使.肾组织
SOD活性升高,MDA含量降低,提高了机体的抗
氧化能力,减轻了脂质过氧化程度.IPO在某种意
义上相当于有控制的缓慢间歇性复氧,可以减少突
然复氧时氧自由基的爆发性产生,并刺激细胞内抗
氧化酶和自由基清除剂的释放而发挥其保护作用.
在缺血再灌注过程中,细胞凋亡是早期细胞死
亡的主要原因之一.本研究结果中IPO组肾小管上
皮细胞凋亡率明显下降,提示IPO可通过抑制肾细
胞凋亡减轻.肾IRI.其抗凋亡机制,一方面可能通
过增强SOD活性,清除氧自由基和减轻脂质过氧
化反应抑制细胞凋亡;另一方面可能与增加Bcl一
2蛋白的表达有关.
综上所述,IPO可通过增强.肾组织抗氧化能
力,减少氧自由基的大量堆积,降低细胞凋亡而减
轻.肾脏IRI;而且IPO是在移植术完成后,全面恢
复灌流前实施,时间从容,方法简便,无疑具有一
定的临床应用价值.
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收稿日期:
2008—03—26
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