阵发性睡眠性血红蛋白尿PNH的诊断指南流式细胞术.docx
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阵发性睡眠性血红蛋白尿PNH的诊断指南流式细胞术
流式细胞术诊断并监测阵发性睡眠性血红蛋白尿症和相关疾病指南
背景：
阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）是一种特殊的获得性克隆性造血干细胞疾病，该疾病是由于PIGA基因体细胞突变，导致连接细胞膜的GPI相关锚蛋白缺失所致。
流式细胞术是检测GPI相关锚蛋白缺失的方法之一，同时也是诊断PNH所必需的检测指标。
然而到目前为止，对于运用流式细胞术检测GPI相关锚蛋白缺失方法还没有标准化、规范化。
方法：
在本论文中，我们将提出一致方案，介绍运用流式细胞术检测PNH的规范程序。
结果：
我们通过临床症状和对数据的分析、结果报告对病例提出综合意见。
但分析中，主要集中在对分析过程的重要性。
本文将区分常规分析（定义为：
缺失细胞占1％或更多）和高灵敏度的分析（缺失细胞仅占小于0.01％的PNH细胞）。
其中如何设计抗体组合和设门对这两种分析都是非常重要的，本文将做详细介绍。
我们将通过对白细胞和红细胞的检测，以及各自的检测优势来讨论并评估PNH患者人群。
我们目前提供的步骤仍需要进一步完善，使其成为高灵敏度的检测技术，包括需要明确：
试剂浓度；PNH克隆细胞在正常人群的发生率（背景），并讨论此技术的缺点，因为此缺陷将可能影响到结果解释。
结论：
本论文可适用于对PNH感兴趣和刚开始建立检测PNH克隆细胞的实验室，使其建立一个比较完善的实验流程；也可用于已开展此检测项目，以提高其该实验室检测技术和报告水平。
背景
阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH）是一种罕见的造血干细胞疾病，该疾病自19世纪初即被确认为一个具有独特临床症状的疾病（1,2）。
在疾病的发展过程中，PNH有三个显着的临床特点，但是这三个特点的个体差异很大（3-5）。
首先，以补体介导的血管内溶血为主要临床表现，包括：
吞咽困难，嗜睡，勃起功能障碍（ED），慢性肾功能衰竭，肺动脉高压，贫血，和血红蛋白尿。
其次，具有形成血栓的倾向，该血栓不仅可发生在四肢，还好发于具有特殊部位，如肝门（Budd-Chiari综合征），脾，肠系膜静脉。
第三，有发展为骨髓造血功能衰竭的潜在风险，所有患者当疾病发展到一定程度都有可能发生，也是疾病发展的终末期，表现为免疫介导的严重的再生障碍性贫血。
关于本病的一个估计发病率仅为每百万个人每年新发病例1.3。
虽然PNH很早就被归为获得性的溶血性贫血，但是它确实影响到所有的血细胞谱系，因此，被认为获得性的造血干细胞疾病，其病理生理机制为X-连锁的PIGA体细胞突变,导致部分或绝对GPI相关锚蛋白缺失。
PNH干细胞被认为是逃避了免疫介导的破坏，而这种免疫介导会破坏正常的骨髓干细胞，从而PNH的干细胞成为细胞生成的主要来源。
CD55—GPI相关锚蛋白的一种（衰变加速因子），其作用为防止C3转换酶在补体级连反应中的形成并增加其不稳定性；CD59（反应性溶血膜抑制物），抑制膜攻击补体复合物的形成，CD55,CD59共同反映了PNH患者的红细胞对补体的敏感性。
因此无论发生急性血管内溶血或是慢性血管内溶血，对于PNH患者来说，CD55,CD59缺失都是较典型的。
而在一些PNH病例，只是GPI抗原部分缺失，这是因为有些类型的PIGA突变，是可以合成一些GPI相关锚蛋白。
通过以上分析，了解了关于PNH的成因及病理学特点，及其与骨髓造血功能衰竭的关系，但是对导致骨髓造血功能衰竭及发生溶血的病理生理机制还不是很明确。
尽管PNH是罕见的，但是合适的筛选和准确的诊断还是非常重要的，因为PNH的是一种慢性疾病，疾病的长期存在，对患者的生活质量及一些患者的生命将产生很大的影响。
在过去几年中，对PNH治疗方案的新发展（9）和一些成功的临床（10）试验，已经极大地改善了患者的生活质量，使溶血性贫血的患者溶血发生率降低，血栓形成风险减小，输血要求减少（10-13），例如人造单克隆抗体，它可以抑制终端的补体蛋白C5（（Eculizumab;AlexionPharmaceuticals,Cheshire,CT）。
这使得PNH的筛查实验和准确的诊断成为临床实验室优先考虑重要工作。
国际PNH的兴趣小组（I-PIG）已经提出关于PNH的分类方案，它包括三个主要类别，涵盖了该疾病主要的临床表现谱（14）：
（1）典型PNH，有溶血和血栓形成倾向患者；
（2）其他主要衰竭，如再生障碍性贫血或骨髓增生异常综合征;（3）亚临床PNH患者，其中有少量PNH的克隆，但没有溶血或血栓形成的临床或实验室证据。
整个分类方案整体目的是提供一个共同的国际术语。
PNH诊断
由于PNH起初被认为是溶血性贫血的一种，因此，最初PNH的检测主要集中检测红细胞相关的实验：
如Ham实验和蔗糖溶血实验。
这两种检测手段都提示红细胞对补体介导的溶血敏感度增加（15–18）。
但二者都不是特异性检测，且操作不方便。
补体敏感性溶血实验的特异性测试，是通过检测不同浓度的补体造成不同程度的溶血来反映;实验表明，与正常细胞相比，PNH细胞在低浓度补体时就可溶解。
（19）。
这个测试也使人们认识到对于某些PNH患者，与正常红细胞（I型）和最异常的PNH型红细胞相比（III型）（20,21），仅有部分细胞对补体介导的溶血敏感（II型），然而，而且这种检测比较费时，也难以标准化，可能会漏诊较少量的异常的PNH细胞（22）。
到目前为止，运用流式细胞术检测GPI相关锚蛋白的缺失已经成为诊断和监测PNH患者主要手段。
但是由于流式细胞检测技术的发展，对其所获得的数据分析是很复杂的，现代流式技术可以同时运用5种荧光素或抗体来标记样本，并且可以很快获取1百万细胞，这种检测技术的进步和其所获得的信息，可以避免少量PNH细胞的漏诊，但遗憾的是对于数据所包含的信息，临床还没能做到充分应用。
如何检测红细胞和白细胞表面GPI相关锚蛋白的缺失，下面会详细描述，以往并没有强调不同实验室间需选用相同的单克隆抗体，其主要原因是由于有些单克隆抗体可以作用于多种不同的GPI相关锚蛋白，它们都可以用来检测PNH克隆细胞。
尤其对于很明显的PNH患者，GPI相关锚蛋白缺失细胞很多。
然而，一些室间质控数据表明，有些抗体的质量比较差，至少在检测GPI相关锚蛋白缺失的能力上可以体现。
例如，虽然CD55和CD59被广泛用于检测粒细胞上PNH克隆细胞，有数据表明，它们也可能无法检测PNH的克隆细胞（24-26）。
此外，这些试剂在检测少量PNH克隆上的差别很大，在敏感度上的分析能力上也较差。
越来越多的数据表明：
检测白细胞GPI相关锚蛋白缺失的最好的试剂含有荧光标记的气单胞菌溶素（aerolysinorFLAER;PinewoodScientificServices,Victoria,BC,Canada）.这是一个与荧光素鳌合形成的无活性的细菌变种衍生物，来自于通道形成蛋白气单胞菌溶素（aerolysin），与其余试剂相比，在检测PNH克隆细胞上，FLAER的灵敏度很高，它还可以与其它单克隆试剂共同使用，检测PNH克隆细胞的GPI相关锚蛋白和非GPI相关锚蛋白。
建立PNH免疫分型检测指南的必要性
为了有效管理PNH患者，PNH的正确诊断是非常重要的。
但是，因为这种疾病较罕见，对于许多实验室，检测频率很低，因此，PNH检测方法差异性很大，（22,29-32）。
最近EQA数据提示：
实验室的数据已经提示漏诊了一些PNH患者，或者在正常人群中也检测出PNH克隆细胞。
为了解决这些问题，PNH工作组在波特兰俄勒冈州举办了2008年临床流式细胞仪协会年度科学会议，在这次会议上，大多数参会者强烈要求发布关于PNH的测试的准则，本论文将回应这些要求。
本论文通过收集资料，讨论，最终达成一致意见，形成以下观点。
针对PNH检测，各实验室已经建立了自己的检测方案，与本文相比，它们所发表的数据明显有局限性。
到目前为止，还没有任何文献报道关于PNH一致的诊断方案，本文作者所提出的诊断方案是有病例依据的，并且同时也说明现存的某些检测方案和试剂与本文所提的相比，明显存在漏洞。
有些方案并不能详尽解释结果，有些方案仅反映简单结果，而本文作者通过病例证明了本文所提出的方案是必需的也是最好的。
我们希望本文方案能尽快得到进一步验证修订，同时本文结尾也提到下一步修订需要考虑的问题，虽然检测方案的可变性很大，我们重点强调此方案符合最基本的诊断原则。
本文将分开阐述对于常规检测和高灵敏度检测的方案。
常规检测即指可以检测出1%的PNH细胞，这样有助于筛查具有溶血和出血倾向的PNH患者和再障患者的少量PNH克隆细胞，亚临床PNH患者。
常规检测方案相对简单，同时其他文献也有相关报道，因此检测准则也没有争议性，其余实验室也很容易按照原则执行。
而对于高灵敏度检测方案，在这里我们定义高敏度方案为可以检测出0.01%或者更小克隆细胞，此方案将受到很大挑战，对于PNH患者及引发相关功能失调患者，主治医生希望检验科能用高敏度检测方案来监测这些患者PNH克隆变化，但是现有文献报道方案是远远不能满足此要求，大家一致认为，高敏度检测方案较复杂，个体差异很大，需要各环节特殊预处理，结果分析报告也很复杂。
通过本文使各实验室建立比较全面高敏度检测方案，提供更多的数据供该领域专家共同商讨疑难问题解决方案，通过PNH检测准则的普及，提高PNH患者的生活质量。
通过流式细胞术数据所提供的信息来监测PNH患者的自然疾病发展过程。
需进行PNH检测的临床症状和体征
由于PNH患者所表现的症状和体征较广泛，有一些体征是很常见的，考虑到它的发病率比较低，因此，对每一位有贫血和血栓形成倾向的病人做PNH检测筛查是不合理的，然而，有些临床症状也足以说明该患者必须进行PNH检测。
尽管仅有少数PNH患者会有血红蛋白尿，但是只要发现有血红蛋白尿的患者都需要进行PNH检测。
抗体介导的溶血性贫血为Coombs实验阳性患者，因此，Coombs实验阴性患者必须作PNH检测，尤其是不存在细胞形态不正常的患者（球形红细胞，裂细胞或病态细胞），或者无明显感染造成溶血性贫血患者，PNH患者会伴随缺铁现象，是由于慢性血管内溶血导致铁随尿液丢失。
血栓形成较常见，约40%PNH患者有形成血栓的倾向，但是部位特殊，比如肝静脉，大脑沟，异常的血栓表现；并且对于伴有血管内溶血，全血细胞减少的血栓患者需要检测PNH细胞，约10%病人有腹痛和吞咽困难，同样，如果没有排除其他疾病引起的以上症状，不建议进行PNH检测。
典型PNH患者会有溶血现象，但是也有一些患者没有溶血现象，因此不能说没有溶血现象的病人就不需要检测PNH细胞。
对于全血细胞减少患者进行PNH细胞检测争议比较大，当然如果病例是青少年，全血细胞减少，有可能是再障，也有可能是由于细胞发育障碍而引起，因此需要检测PNH细胞。
但是如果患者只有贫血表现，需要将引起贫血的其他原因排除掉，还是不能解释贫血原因，才需要检测PNH细胞。
近期，I-PIG建议，凡是再障患者或是MDS（难治性全血细胞减少及多系发育异常）患者，都需要进行高灵敏度的PNH细胞检测，但是还没有规定它的参考值及灵敏度。
更有研究指出，其余类型的MDS患者或者骨髓增殖性疾病患者也应该列入筛查范围。
见表一
需进行PNH检测临床体征
有血红蛋白尿和血浆中血红蛋白升高体征的血管内溶血
不明原因溶血伴有下列情况
缺铁或
腹痛或食管曲张或
血栓形成倾向或
粒细胞减少和（或）血小板减少
Coombs’试验阴性，非裂细胞症，非感染的溶血性贫血
非典型血栓形成特点如：
形成部位特殊
肝静脉（Budd-Chiarisyndrome）
腹腔静脉（入口处，脾脏，内脏）
大脑沟
皮静脉
伴有如上症状的溶血性贫血
不明原因血细胞减少
骨髓衰竭依据：
疑似或确诊再障或血细胞发育障碍贫血
难治性单系发育异常血细胞减少
其他不明病因的血细胞减少
追踪检测
已诊断PNH的患者需要定期监测PNH克隆数目的变化，如果病情稳定，一年监测一次就可以了。
但是如果患者临床或血液学参数发生变化，需要经常监测，这样可以为疾病的恶化或改善提供真实信息。
定期监测对使用eculizumab治疗的病人来说是非常有用的，但是到目前为止还没有要求相隔多长时间进行检测。
如果具有溶血性贫血和血栓形成倾向的诊断为典型的PNH患者，初次检测没有检测出PNH克隆细胞，不需要重新检测。
对于再障患者检测出少量PNH克隆细胞，这时需监测PNH克隆数的变化，因为患者有可能发展为溶血性PNH,也意味着克隆数量增多了，但是RCUD患者还未报道有发展为溶血性PNH可能。
流式细胞术检测PNH
标本准备
首选EDTA抗凝外周血，肝素钠和ACD抗凝也可以接受，不建议采用骨髓标本作检测，因为由于细胞的分化发育会影响GPI相关锚蛋白的表达从而导致结果较难解释。
并且患有MDS的PNH病人结果的解释也比较困难，因为GPI锚蛋白的异常表达跟MDS也相关，尤其CD16表达。
对于PNH检测，标本运输问题不大，冷藏保存7天的标本也可以进行红细胞检测，但是我们还是建议48小时内进行检测，否则红细胞结果的解释将会受到影响。
采集标本放置时间越长，白细胞检测影响将会更大，白细胞内颗粒及抗体表达强弱均会受到影响，使得结果难以判断，所以我们建议标本采集后24-48小时内进行检测。
标本准备
标本来源
外周血（不建议骨髓检测）
抗凝剂
标本量
EDTA;肝素钠，ACD
1-3ml
标本最长保存时间
标本保存温度
裂解液要求
红细胞7天，白细胞48h内检测
24h后，4度保存
白细胞检测时需要，可用商业化溶血素，建议使用氯化铵；红细胞不需溶血素。
常规分析
高灵敏度分析
常规分析细胞群
1%,目标细胞群至少5000
0.01%,目标细胞群至少250000
粒细胞群，单核细胞群（提供确证信息）
红细胞（或者白细胞检测异常的病例必做）
单独检测红细胞意义有限
淋巴细胞不建议检测
红细胞检测
红细胞膜CD55和CD59的缺失，被认为是引起PNH病理生理的主要原因。
CD58也是一个GPI相关的红细胞抗原，但它同时又是跨膜蛋白，因此结果解释较难判断，并且也无数据表明它的检测意义大于CD55和CD59。
红细胞检测目的就是明确鉴定和定量GPI相关锚蛋白缺失数（III型细胞），与正常细胞区别（I型细胞）,或者部分缺失（II型细胞（Fig.1）。
但是单纯检测红细胞表面的缺失蛋白并不能对PNH做出准确判断因为溶血和输血已经完全影响了它的真正数据，因此，需要进一步检测白细胞。
但是红细胞检测也是很重要的，它可以检测出II型细胞PNH患者，同时，通过比较红细胞和白细胞数值，可以给临床提供更多信息。
Figure11例PNH患者红细胞表面CD59表达显示：
I型细胞、II型细胞和III型细胞
标本处理
白细胞检测相比，红细胞检测不需要溶血处理，但要防止红细胞聚集。
标本与抗体孵育后洗涤，超过一次的洗涤可以排除非特异性结合和剩余的荧光素，同时更容易区分II型和III型细胞。
Figure2PNH患者红细胞CD59标记洗涤前后变化。
洗涤前（A），PE荧光素过量或非特异性结合，导致出现II型红细胞而未检测到III型红细胞；洗涤后（B），消除试剂过量或非特异性结合，检测到III型红细胞。
选择抗体：
大多数选择单个标记作为一个克隆检测方案，但也有少数病例会有先天性CD55，CD59缺失。
CD59表达量高，很容易被检出，与其它抗体相比，CD59更容易鉴别II型和III性细胞，不建议用间标。
相比CD59,CD55在红细胞的表达较低，不建议用单一CD55做临床检测，因为不容易发现II型细胞。
如果需要时，一般用PE标记CD55,也有将CD55，CD59用不同的荧光素标记，同一样本管处理，散点图分析。
可以通过减少试剂量来降低红细胞的聚集，但需保证抗体饱和。
Figure3与Figure1相同病例，检测CD55在红细胞上的表达，虽然检测到PNH克隆数相同，但是不能区分II型和III型红细胞。
获取，设门和分析：
一般红细胞用FS和SS（LOG）可以很容易与碎片或血小板区分，获取5000个红细胞既可以满足1%分析，另外也可以用CD235a（,红细胞糖蛋白抗体）来确定红细胞，以准确排除碎片或其他细胞，因为假如目标细胞混有了除红细胞外的其他细胞，容易被误以为是PNH克隆细胞，同时也相当于设置阳性对照，以确保标本与抗体充分混匀。
但也要避免因CD235a与红细胞表面抗原结合时引起红细胞聚集，所以要使用适当浓度的CD235a，使聚集现象降到最小。
一般来讲，FITC荧光素聚集能力要小于PE。
II型细胞的诊断还未标准化，为了避免不同标本表达差异大的问题，最好的解决方案是在同一标本中分辨出II型和III型细胞，又要保证II型细胞不是由于III型细胞洗涤不充分造成的。
I同时,还必须记住:
有输血史患者的标本,GPI相关蛋白表达与正常标本相比,荧光强度较弱，因此,有输血史患者检测结果,不同型细胞群会有重叠部分。
阴性对照的设立包括:
用无抗体标记的细胞去界定III型细胞位置，用GPI表达正常的有抗体标记的细胞的位来界定正常I型细胞，II型细胞位置即为阳性与阴性细胞群之间的位置。
Figure4分别用散点图和直方图显示少量红细胞表面PNH克隆数。
散点图（A）显示：
运用CD235a/CD59双参数很容易区分II型（蓝色）和III型（绿色）红细胞；相同结果用直方图（B）显示：
由于存在大量I型红细胞，导致很难显示II型和III型红细胞。
白细胞检测-常规分析
白细胞是检测PNH克隆大小的最好目标细胞，但是利用淋巴细胞不适合做PNH克隆检测，因为淋巴细胞寿命长，GPI相关锚蛋白表达变异性很大。
单核细胞和粒细胞都是非常好的目标细胞，一般来说这两种细胞检测出的克隆数目是一致的。
分析两种细胞群可以更好地作出诊断
标本准备：
一般来说，做白细胞检测是先染色再裂解RBC，这样不会影响散射光的检测，比较先裂RBC解再染色的方法更容易设门。
各种商业性裂解液都可以使用，但是对于粒细胞较少患者，建议使用氯化铵裂解液。
抗体选择：
以往都认为CD55，CD59作为检测白细胞最好的抗体，但是与其它抗体相比，他们不容易区分阴阳性细胞群。
EQA资料显示，CD55，CD59检测出的克隆数要小于CD16，CD66b。
粒细胞检测有很多抗体，一般多用CD16,CD24,和CD66b。
CD16在嗜酸性粒细胞和骨髓增殖性疾病中的粒细胞上不表达。
除此之外，CD16具有多态性，导致一些CD16克隆号不能识别CD16抗体，因此CD16需与另外试剂搭配共同检测。
CD14是表达在单核细胞上的GPI相关锚蛋白，但是不成熟的单核细胞及树突状细胞也不表达CD14,因此在检测少量克隆细胞数作用有限。
CD48,CD157,也可以检测白细胞，但是意义有限，CD55在单核细胞表达较高，因此也可以检测单核细胞克隆数。
FLAER是与GPI锚蛋白结合最特异的抗体，在GPI锚蛋白缺失的单核细胞和粒细胞上，FLAER检测为阴性，是目前检测PNH克隆细胞最好的试剂。
在早期FLAER研究中，使用干粉试剂，由于其使用时的不方便和不稳定性，导致在常规实验室中应用受限。
而最近已经有液体状这种试剂，它与GPI锚蛋白结合能力上与固态相同，与其余单克隆抗体相比，稳定性和保存要求相同：
要求避光，不能长期暴露高于2-8度环境。
设门和分析：
对于检测粒细胞上GPI锚蛋白缺失，设门很简单：
FSC/SSC或CD45/SSC.单核细胞较少时，需要用到单核细胞系抗体来找出单核细胞，在MDS病例或高灵敏度检测病例中，需要用到系别抗体，使得粒细胞门更精确。
常规检测，目标细胞收集5000-10000，就可以使检测灵敏度达到1%，单核细胞较难，但单核细胞与粒细胞结果一致时，较少量单核细胞即可。
一般来讲，一个门内，最好同时有阴性和阳性2个细胞群，以准确区分阴阳性位置。
因此，对于PNH克隆数目少的病例，需要收集更多的细胞，以找出表达GPI锚蛋白的细胞群，另外对于PNH克隆大的病例，用一个GPI锚蛋白抗体或FLAER以柱状图参数就可以体现阴阳性细胞群，但大多数病例，需要用到2个不同的参数去找阴性目标细胞群。
尤其FLAER的应用，可以找到II型细胞群，一旦找到粒细胞上II型细胞，要注意检测红细胞上的II型细胞群，报告粒细胞克隆数目时，是II型和III型的总和。
Figure5FLAER/CD24显示3例PNH患者，（A）粒细胞上PNH克隆数23.5%；（B）粒细胞上PNH克隆数97%；（C）粒细胞上PNH克隆数60.9%，其中III型为54.8%，II型为6.1%。
高灵敏度分析
流式细胞术技术发展的进步和小概率事件分析方法的增加，使得分析越来越小的克隆细胞群成为可能，只要能获取到足够的目标细胞群。
对于小概率事件，关键要避免假阳性，获取足够多的细胞，通过细胞表型特征和多参数分析可以避免假阳性。
高灵敏度分析一般用于骨髓功能衰竭伴有少量PNH克隆细胞的患者。
再障与PNH相关，PNH一般为再障患者免疫抑制治疗的并发症。
研究表明，在大多数再障患者和不明原因全血细胞减少患者标本中发现PNH克隆细胞，测序法检测PIGA基因也证实这些克隆的存在，另一些MDS患者中也发现PNH细胞，但与典型PNH患者相比，克隆数很少。
需要高灵敏度方法检测和分析。
在健康人群中也可以检测出少量PNH细胞，一项对9个正常案例研究表明，以CD11b设门，检测粒细胞CD55,CD59,每百万细胞中有22个克隆细胞。
随后PCR分析，9个病例中有6个存在PIGA突变，但是这些突变是一过性的，红细胞上约有百万分之八。
检测PNH克隆最小灵敏度还没有明确，通过以往资料提示灵敏度为0.01可以接受，红细胞灵敏度0.005。
红细胞是灵敏度检测最好的目标细胞（细胞数多，抗体表达强），然而红细胞容易聚集，需要CD235a以确定目标红细胞，并且要注意抗体类型和抗体浓度对红细胞聚集的影响。
红细胞一般用CD55和（或CD59）检测，如同时用，可以选择相同或不同荧光素，以确定阴性细胞，即缺失细胞，但是一定要注意红细胞聚集现象。
散点图与柱状图相比，更容易体现小比例细胞群，如果用一种试剂，建议使用CD59PE,容易鉴别正常CD59阳性细胞群，同时CD235aFITC不容易产生红细胞聚集现象，用此方案也更容易找到小于0.01%TypeIII红细胞。
CD55CD59结合使用，可以提高TypeII红细胞的检测率。
可能会将少量CD55，CD59阴性表达的细胞误认为是PNH细胞，导致此假阴性的原因是红细胞碎片，空白对照可以减少这种概率的发生，同时要避免前一管残留的标本影响检测标本，所以最好先做空白对照管，再做实验管，或者在对照管和实验管之间检测一个生理盐水管。
Figure6A，高灵敏度分析正常人群PNH克隆背景表达，FS/SS设门获取1000000个红细胞，CD235a/CD59检测CD59阴性表达红细胞为0.0005%III型红细胞。
箭头所示为红细胞碎片或未标记到的红细胞，虚线箭示聚集的红细胞；B和C分别显示有少量PNH克隆的患者0.06%（B）0.005%（C），其中（B）中含少量II型红细胞。
粒细胞高灵敏度分析时，不能简单使用FSC/SSC或CD45/SSC,因为有可能将其余细胞设到门内，造成假阴性。
因此，粒细胞检测需用系列特异性抗体设门，如：
粒细胞使用CD15，单核细胞使用CD33，CD64。
一般检测少量克隆细胞或恶化程度较高的患者，更需要注意使用多参数设门以保证检测细胞均为目标细胞。
选择一种以上GPI相关锚蛋白检测目标细胞也很重要，尤其是在一群少量细胞表达缺失不止一种抗体，那就可能门内污染了别的细胞群。
FLAER是防止门内出现污染细胞最好的抗体。
假如门内污染了CD24阴性表达的细胞群，那么与FLAER一起使用，双阴性细胞群才是真正PNH克隆细胞群。
单一CD14也不能用来设定单核细胞群，因为树突状细
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