HeNe激光对9号淡水小球藻生物量及总脂含量积累的影响.docx

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HeNe激光对9号淡水小球藻生物量及总脂含量积累的影响

中国网络大学

ChineseNetworkUniversity

本科毕业设计（论文）

He-Ne激光对9号淡水小球藻生物量及总脂含量积累的影响

院系名称：

网络学院

专业：

学生姓名：

学号：

123456789

指导老师：

中国网络大学教务处制

2018年03月11日

摘要

本文通过研究不同光照时间（0min、1min、2min、4min、8min、12min、16min）的He-Ne激光照射对9号淡水小球藻（Chlorellapyrenoidosa）产生诱变，探究其对9号小球藻生物量以及藻细胞总脂含量的影响。

在此阶段中定期取样测量其吸光度值以换算细胞密度，最后对藻细胞进行总脂含量的测定。

实验结果表明，1min、12min和16min光照时间长度的He-Ne激光对9号小球藻的生物量积累有极其显著的促进作用。

1min、2min、4min和8min光照时间长度的He-Ne激光对9号小球藻总脂含量的积累有显著促进作用。

综合考虑，可对1min的诱导组筛选高产油藻株，为后期的遗传变异稳定性检测打下基础，以期为生物柴油规模化生产的研究提供优质藻种。

关键词：

9号淡水小球藻，生物量，生物柴油，He-Ne激光，总脂量。

Abstract

ThisthesishavestudiedthebiologiceffectsincludingbiomassandlipidcontentoftheChlorellapyrenoidosawhichisirradiatedwithHe-Nelaserofdifferentgradient（0min/1min/2min/4min/8min/12min/16min）.Inthisstage,thenumberofChlorellacellsinnutrientsolutionwascountwiththeplatemethodusingbloodcellcounts.AstandardcurveabouttherelevancebetweenthebiomasandtheODvalueofChlorellacellswouldbedrawn.AndthenutrientsolutionwouldbesampledperiodictomeasuretheODvalueinordertoworkoutthebiomas.AtlastthelipidcontentoftheChlorellawouldbemeasured.TheresultsshowthatthegrowthoftheChlorellaobviouslywasrisingalongwiththetimeoflaserirradiationof1min/12min/16minandthelipidcontentofChlorellawasrisingalongwiththetimeoflaserirradiationof1min/2min/4min/8min.Inconclusionthetimeoflaserirradiationof1mincouldbechosenasthehigh-levellipidmicroalgaefortheresearchofstabilityaboutthegeneticmutationandLarge-scaleproductionofbiodiesel.

Keywords：

Chlorellapyrenoidosa，biomas，biodiesel，He-Nelaser，lipidcontent

目录

摘要I

AbstractII

第一章引言-1-

1.1课题的背景和意义-1-

1.29号小球藻-2-

1.3He-Ne激光器-3-

1.3.1He-Ne激光器的相关参数-3-

1.3.2He-Ne激光器的结构-3-

1.3.3He-Ne激光器的工作原理-4-

第二章材料与方法-8-

2.19号小球藻的培养-8-

2.1.1藻种-8-

2.1.2藻种培养-8-

2.2实验材料-8-

2.2.1药品与试剂-8-

2.2.2仪器-9-

2.3实验方法-9-

2.3.19号小球藻的诱导-9-

2.3.2实验培养条件-9-

2.3.39号小球藻细胞生长标准曲线的测定-10-

2.3.49号小球藻生物量的测定-10-

2.3.59号小球藻藻细胞的收集-10-

2.3.69号小球藻总脂含量的测定-10-

第三章结果与讨论-12-

3.19号小球藻的生长曲线-12-

3.1.19号小球藻细胞形态的观察-12-

3.1.29号小球藻藻细胞生长的测定-12-

3.29号小球藻的总脂含量-17-

3.2.19号小球藻总脂含量的测定-17-

3.2.2对利用9号小球藻进行工业化生产分析结果。

-17-

第四章结论-18-

参考文献-19-

致谢-21-

附录-22-

第一章引言

1.1课题的背景和意义

随着世界经济的发展和人口的急剧膨胀，全球范围内的化石能源储备在迅速减少。

全球的石油需求量以每年1%的速度增长，预计在2050年即本世纪中叶石油资源将会消耗殆尽。

全球的天然气需求量则以每年1.8%的速度递增，占总能源需求量的22%。

煤炭的需求增长量则是最高的，以每年2%的速度增长。

然而，地球上贮存的化石能源是有限的，总会有消耗殆尽的时候，在这种情况下，新型能源的推广显得尤为重要。

生物能源作为一种新型的清洁能源，其本身的开发利用得到了更为广泛的关注。

生物能源是指从生物质得到的能源。

生物质的种类有很多，大体分为植物类和非植物类。

藻类作为数量群庞大的生物质，成为了生物能源载体的研究热点。

可高效转化能量的植物最多只能将接收到的太阳辐射能的10%~12%转化为化学能，而微藻的光能转化效应为20%左右。

美国国家可更新实验室（NREL）通过现代生物技术建成“工程微藻”，即硅藻类的一种“工程小环藻”。

在实验室条件下可使“工程微藻”中脂质含量增加到60％以上，户外生产也可增加到40％以上。

而一般自然状态下微藻的脂质含量为5％-20％。

“工程微藻”中脂质含量的提高主要由于乙酰辅酶A羧化酶（ACC）基因在微藻细胞中的高效表达，在控制脂质积累水平方面起到了重要作用。

目前，正在研究选择合适的分子载体，使ACC基因在细菌、酵母和植物中充分表达，还进一步将修饰的ACC基因引入微藻中以获得更高效表达。

利用“工程微藻”生产柴油具有重要经济意义和生态意义，其优越性在于：

微藻生产能力高、用海水作为天然培养基可节约农业资源；比陆生植物单产油脂高出几十倍：

生产的生物柴油不含硫，燃烧时不排放有毒害气体，排入环境中也可被微生物降解，不污染环境，发展富含油质的微藻或者“工程微藻”是生产生物柴油的一大趋势。

小球藻（Chlorella）是一种绿藻，一般分布在土壤和淡水水域中，有的还以共生体的形式出现在无脊椎动物体内，大多数种的细胞中还有一个蛋白核[1]。

小球藻的遗传差异很大，所以小球藻细胞干重中脂类的含量由4.5%~86%不等。

小球藻细胞中的总脂类经皂化后可分为三个组分：

脂肪酸，难皂化物质和水溶性的皂化产物。

小球藻细胞中脂类含量的增加主要是由于脂肪酸积累的结果。

9号小球藻（Chlorellapyrenoidosa）作为一种淡水小球藻，其不饱和脂肪酸的含量明显高于许多植物[2]。

本实验拟通过测定He-Ne激光对9号小球藻总脂含量的影响来筛选出脂类积累的高产藻株，通过测定He-Ne激光对9号小球藻生物量的影响来筛选可迅速积累生物量的藻株。

1.29号小球藻

9号小球藻属于绿藻门（Chlorella）绿球藻目（Chlorococcales）卵囊藻科（Oocystaceae）。

是一种单细胞蛋白核小球藻，细胞多呈球形，细胞壁薄，色素体呈杯状，几乎充满整个细胞。

9号小球藻具有一个很明显的蛋白核，直径为3至5μm[2]。

小球藻的分布式极为广泛的，在海洋、湖泊、池塘、沟渠、树皮和湿润土壤等环境中都可以生长繁殖。

9号小球藻是一种生长在淡水中的小球藻类，对环境的适应能力之强十分罕见，是微藻大规模培养的主要污染源之一。

1890年小球藻首次由荷兰微生物学家Beijerinck在琼脂平板上成功分离，1919年这种纯培养物被用于实验室研究植物生理学[3、4]。

在20世纪40年代后期，美国、德国、以色列和日本开始了对小球藻规模化培养的研究。

已解决第二次世界大战期间的能源问题和战后饥饿问题[5]。

20世纪60年代，美国及俄罗斯科学家进行了“太空藻类学”研究，以小球藻作为宇宙飞船飞行时的光和气体交换器[6、7]。

1971年Takechi等人以醋酸盐为碳源在池塘中装配环流搅拌器，建立了混养培养方法[8]。

近期对于小球藻的研究则多集中在小球藻的产油研究和营养研究上。

小球藻依据种类的不同，其蛋白质含量为7.3%~88%不等，碳水化合物为5.7%~38%，脂类为4.5%~86%。

小球藻藻细胞中蛋白质的含量与其生长环境有直接关系，如果蛋白核小球藻生长在良好的环境中，其细胞中的蛋白质含量一般高于50%[2]。

Fisher和Burlew分析了蛋白核小球藻的蛋白质样品的氨基酸组成，计算出这种蛋白质的必需氨基酸指数为62[9]。

实验表明蛋白核小球藻的氨基酸指数与面粉、花生等植物处于同一水平。

小球藻细胞中的脂类存在形式主要是脂肪酸，其不饱和脂肪酸的含量明显高于其他植物。

在氮饥饿的生长条件下，蛋白核小球藻在生长过程中可积累最多高大86%的脂类。

1.3He-Ne激光器

1.3.1He-Ne激光器的相关参数

He-Ne激光器其本质为气体激光器，于1960年末研制成功，是全球第二种研制的激光器，由于He-Ne激光器结构简单、使用方便、光束质量好。

成本较低且工作可靠，它也是迄今为止应用最广泛的激光器之一。

He-Ne激光器在可见光和红外光波段有多条发射谱段，本实验采用最强也是应用最为广泛的波长为623.8nm的红光。

除此之外还有543.5nm的绿光、594nm的黄光、612nm的橙色光、1.15μm的近红外辐射和3.39μm的谱线。

红光He-Ne激光器以连续方式工作，具有稳定的低噪声输出，功率可达100mV。

发射线宽主要由Doppler加宽决定，半最大点全宽度（FWHM）的典型值为1.5GHz，其他典型参数如下：

表1典型He-Ne参数

参数

数值

激光波长/nm

632.8

自发辐射系数/s-1

3.4×106

激光上能级寿命/s

1.7×10-7

受激发射截面/m2

3×10-17

自发发射线宽FWHM/Hz

1.5×109

小信号反转粒子数密度/m3

6×1015

1.3.2He-Ne激光器的结构

He-Ne激光器的结构见图2，其结构形式很多，但都是由激光管和激光电源组成。

激光管由放电管、电极和光学谐振腔组成。

放电管通常由毛细管和储气管构成，是产生激光的地方。

放电管中充入一定比例的氦（He）、氖（Ne）气体，当电极加上高压电后，毛细管中的气体开始放电，是氖原子受激发产生粒子数反转。

储气管与毛细管相连，并不发生气体放电，其作用是补偿因慢漏气及管内元件放气或吸附气体造成He、Ne气体比例及总气压发生的变化，延长器件的寿命。

He-Ne激光器的阳极一般用钨棒制成，阴极多用电子发射率高和溅射率小的铝及其合金制作而成。

为了增加电子发射面积和减小阴极溅射，一般都把阴极做成圆筒状，然后用钨棒引到管外。

图1He-Ne激光器的结构

He-Ne激光器由于增益低，谐振腔一般采用平凹式，平面镜为输出镜，透过率约为1%到2%，凹面镜为全反射镜。

He-Ne激光器的结构按谐振腔与放电管的放置方式不同可分为内腔式、外腔式和半内腔式。

按阴极及储气管位置的不同又可分为同轴式、旁轴式和单细管式。

1.3.3He-Ne激光器的工作原理

氦氖激光器中工作物质是氦气和氖气，其中氦气为辅助气体，氖气为工作气体。

产生激光的是氖原子，利用不同能级的受激辐射跃迁将产生不同波长的激光，主要有632.8nm、1.15μm和3.39μm三个波长。

　　He-Ne激光器的能级结构图如图3所示，氦原子有两个亚稳态能级21S0、23S1，它们的寿命分别为5×10-6s和10-4s，能量分别为20.73eV和19.73eV。

两个都是亚稳能级。

He的这两个能级几乎与Ne的2s和3s两个能级分别重合。

He的21S0能级比Ne的3S3仅低0.048eV，He的23S1能级仅比Ne的2S能级仅高0.039eV。

在He-Ne混合气体中进行放电时，在电场中加速获得一定动能的电子与氦原子碰撞，并将氦原子由基态激发到各种激发态中，在它们衰变到基态的过程中，大部分被长寿命的23S1和21S0能级吸收。

通过近共振能量转移，此两能级寿命长容易积累粒子。

因而，在放电管中这两个能级上的氦原子数是比较多的。

这些氦原子的能量又分别与处于2S和3S态的氖原子的能量相近。

处于21S0、23S1能级的氦原子与基态氖原子碰撞后，很容易将能量传递给氖原子，使它们从基态跃迁到2和3

态，这一过程称能量共振转移。

由于氖原子的2P、3P态能级寿命较短，这样氖原子在能级3S－3P、3S－2P、2S－2P间形成粒子数反转分布，从而发射出3.39μm、632.8nm、1.5μm三种波长的激光。

图2He-Ne原子的部分能级图

632.8nm振荡是由3S2到2P4跃迁形成的。

上能级3S2寿命为10-7s。

下能级2P4寿命为1.8×10-8s，比3S2寿命短得多，因而满足反转分布条件。

由于2P4到基态的跃迁是禁戒的，因此，主要通过自发发射衰减到1s上。

1s态是一个亚稳态。

1s上的氖原子与电子碰撞后又会跃迁到激光下能级2P4上，同时还存在自发发射辐射的共振俘获，这两个过程都不利于2P4能级的排空。

1s上的氖原子主要通过与放电管内壁的碰撞而回到基态，这就是所谓的“管壁效应”。

为了增加氖原子与管壁碰撞几率以加强“管壁效应”，尽快使激光下能级抽空以提高反转数，所以，He-Ne激光器的放电管都是用毛细管。

1.15μm振荡是由2S2到2P4跃迁形成的。

对激光上能级2S2的泵浦是通过与氖的23S2的近共振能量转移来实现的。

2S2的寿命为10-7s。

它的下能级与632.8nm跃迁过程所使用的相同，所以，也有赖于管壁效应抽空1s能级，从而抽空2P4能级上的氖原子。

3.39μm振荡是由3S2到3P4形成的。

其上能级与632.8nm振荡时的相同；下能级3P4的寿命为10-8s，下能级与基态间的跃迁是禁戒的，通过自发辐射衰变到1s能级上，因而也是靠管壁效应抽空激光下能级。

上述过程可表示为：

　　　　　　e**+He（11S0）→e*+He*（21S0）

　　　　　　　　e**+He（11S0）→e*+He*（23S0）

　　　　　　　　He*（21S0）+Ne（2P6）→He（21S0）+Ne*（3S）

　　　　　　　　He*（23S1+Ne（2P6）→He（21S0）+Ne*（2S）

　　　　　　　　Ne*（3S）→Ne*（2P）产生波长为632.8nm的激光

　　　　　　　　Ne*（3S）→Ne*（3P）产生波长为3.39μm的激光

　　　　　　　　Ne*（2S）→Ne*（2P）产生波长为1.15μm的激光

从理论上讲，这三种波长的激光都有可能发射，但我们可以采取一些方法去抑制其中的两种，而使我们所需要的一种波长的激光得到输出。

632.8nm（红光）因输出为可见波段的激光，实际应用较广泛[10]。

1.3.4He-Ne激光在生物学方面的应用

He-Ne激光在生物学领域主要作为诱变育种的一种激光诱变方式。

赵萌萌等人利用He-Ne激光诱变钝顶螺旋藻IS，发现经He-Ne激光15min和20min照射后的藻种藻丝形态发生变化，藻丝变短、螺旋变紧密，生长速度明显加快，β胡萝卜素、蛋白质和多糖含量均有较大幅度的增加[11]。

郭爱莲等人利用He-Ne激光对白腐真菌的菌丝体和原生质体进行照射诱变，发现部分经过照射右边的菌株木质素降解率可达3811%和39188%，比出发菌株的33%和39%高出许多[12]。

张建民等人通过He-Ne激光照射诱变小球藻发现在2min随着照射时间的延长，藻细胞的生长繁殖能力明显加强，细胞内叶绿素、蛋白质含量均呈上升趋势[13]。

黄建新等人通过采用He-Ne激光对地衣芽孢杆菌进行激光诱导，分别以10min、20min、30min、40min进行照射处理,结果表明,10min照射对H25菌的芽孢萌发有激活作用,促进其生长速度；0min和30min照射对H25菌株的产酶力有明显的影响，筛选出三株比出发菌株产酶力提高2倍以上,且对啤酒发酵中双乙酰降解作用明显的变异菌株，其中L2206′菌株经传代培养及酯酶同工酶分析,证明发生了稳定的遗传变异[14]。

戴德慧等人采用He-Ne激光诱变红曲霉M9x原生质体，获得一株MonacolinK产量为103.73μg/ml的诱变株M9y，其产量约是出发菌株M9x的4.1倍，经酯酶同工酶分析，其酶带条纹数、迁移率等均发生了明显变化[15]。

张智维等人。

用He-Ne激光作为诱变光源,照射啤酒酵母细胞,在合适的时间和剂量下,得到一株优良菌株。

用该菌株酿造的啤酒,其双乙酰值为0.1253mg/L,比原菌株下降了30%[16]。

朱宏莉等人利用He-Ne激光诱变果胶酶产生菌的菌体细胞,获得了突变株ZH2g,其酶活为出发菌株的1.3倍，用He-Ne激光照射ZH2g的原生质体,从而得到了高产突变株ZH2gA,其酶活为出发菌株的1.6倍[17]。

张建军等人通过He-Ne激光复合诱变选育柠檬酸高产菌，筛选出的高产突变菌株柠檬酸产酸率提高了19.29%，转化率由87.07%到103.86%[18]。

姜岩等人通过利用He-Ne激光诱变热带假丝酵母CT43，发现其降解苯酚的效率显著提高[19]。

目前，利用He-Ne激光主要用在微生物诱变育种方面，在微藻方面应用还很少。

本文初步研究了不同照射时长的He-Ne激光对9号小球藻生物量和总脂含量积累的影响。

结果表明1min、12min和16min照射时间长度的He-Ne激光对9号小球藻生物量的积累有显著的促进作用，2min、4min、8min照射时间长度的He-Ne激光对9号小球藻生物量的积累有抑制作用。

1min照射时间长度的He-Ne激光对9号小球藻总脂含量的积累有明显的促进作用。

第二章材料与方法

2.19号小球藻的培养

2.1.1藻种

9号小球藻原藻种购自中国科学院水生生物研究所

2.1.2藻种培养

在5L的三角瓶中加入3L的液体培养基，接种一定体积的原藻液。

由日光灯提供光照，其光照与黑暗比为12h:

12h，光照强度为1200Lx，其培养温度为23℃恒温培养，每天手动摇瓶3至5次，营养液加盐频率为2周加一次1/4浓度的营养盐，待培养至生长对数期备用。

本实验采用BG11培养基（pH=7.1），其各营养成分浓度如下：

（一）大量元素：

NaNO375g/LK2HPO42g/LMgSO4·7H2O3.75g/L

Na2CO31g/L柠檬酸0.3g/LCaCl2·2H2O1.8g/L

柠檬酸铁铵0.3g/LEDTANa250mg/L

（二）微量金属元素：

H3BO32.86g/LMnCl2·4H2O1.86g/L

ZnSO4·7H2O0.22g/LCuSO4·5H2O80mg/L

Na2MoO4·2H2O0.39g/LCo（NO3）2·6H2O50mg/L

2.2实验材料

2.2.1药品与试剂

蒸馏水、95%乙醇、丙酮、氯仿、甲醇、氮气等

2.2.2仪器

三角瓶（250mL、5L）、饲养瓶（25mL）、比色皿、量筒、胶头滴管、血球计数板、盖玻片、细线、封口膜、pH试纸、玻璃棒、药匙、移液枪、离心管（10mL、50mL）、称量纸、烧杯、试管、研钵、擦镜纸等

氦-氖激光器（北京大学物理系工厂JD-2型）

电子天平（HANGPINGFA1004）

可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司723型）

超声波破碎仪（美国SONICSVC605）

台式低温离心机（HERAEUS）

高压蒸汽灭菌锅

超净工作台（DL—CJ—IN）

普通光学显微镜（SEC—282）

氮吹仪（上海泉岛科贸有限公司QSC—12T）

电热恒温鼓风干燥箱（DGF30/14—IIA）

旋涡混合器（MVS—1）

2.3实验方法

2.3.19号小球藻的诱导

本实验设置了空白、1min、2min、4min、8min、12min、16min七个激光照射时间梯度，每种时间长度设置三个重复。

在超净工作台上将以培养至生长对数期的藻液分装至21个25mL的饲养瓶中，每瓶20mL依次标好各照射时间长度值。

分别将已装有藻液的饲养瓶至于磁力搅拌器上，在转子的搅拌下至于JD-2型氦-氖激光器的照射下，照射参数为：

波长632.8nm，功率40mw。

在照射完毕后同时于超净工作台上接种于300mL的三角瓶中，每瓶200ml的培养液。

2.3.2实验培养条件

淡水小球藻生长的培养温度为23℃，光照与黑暗比为12h:

12h，白天光强约为1200Lx。

培养阶段每天定时摇藻（一日3次），每周加盐一次，一次加入1/4倍数浓度的BG11营养盐。

.

2.3.39号小球藻细胞生长标准曲线的测定

9号小球藻细胞密度的测定采用血球计数板法，取实验用藻原藻种培养液10ml，从中取1ml，加到血球板上，在显微镜下进行计数，然后，从中取4ml测吸光度；将剩余的5ml稀释2倍，从中取1ml进行血球计数板，取4ml测吸光度；同样将剩余的5ml稀释2倍，从中取1ml进行血球计数板，取4ml测吸光度；以此类推，稀释十次，测出数值，然后作出吸光度与细胞密度的关系曲线。

2.3.49号小球藻生物量的测定

从实验组小球藻激光诱导时间开始，每三天测定一次各诱导时长梯度实验组藻细胞的吸光度值。

具体测定方法为：

从每个梯度的三瓶重复中各取出1.5mL的藻液共4.5mL，于540nm的波长下测定其吸光度值。

根据已作出的小球藻吸光度与细胞密度的关系曲线方程换算出小球藻的细胞密度，并记录数据。

2.3.59号小球藻藻细胞的收集

将小球藻藻液转移至50ml的离心管中，配平后，在低温高速离心机中，于8000rpm下离心10min，弃去上清，应尽量弃除上清；将收集好的藻泥于-20℃的冰箱中保存，以备总脂含量的测定。

2.3.69号小球藻总脂含量的测定

（1）处理藻细胞样品

从冰箱中取出用于待测总脂含量的样品，于电热恒温鼓风干燥箱中100℃干燥过夜至恒重，分别测量各实验组干燥粉质量m0，并记录数据。

研磨已称量的干燥粉，并加入等体积的氯仿和甲醇（1:

2，现配现用），注意：

药品有毒，操作时戴上乳胶手套和口罩，实验在通风橱中进行。

（2）超声波破壁

在功率240W，周期1min，破壁15s，间隔5s，3个循环的条件下进行破壁。

破壁过程中需要冰浴保护，防止超声波破壁仪工作中产生的高温对藻细胞