纸色谱法实验报告doc.docx
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纸色谱法实验报告doc
纸色谱法实验报告
篇一:
实验六纸层析法观察转氨基作用实验报告 实验六纸层析法观察转氨基作用 【实验名称】:
纸层析法观察转氨基作用 09救援一班第三大组李岚宇XX222336 室温:
28°
(一)实验目的:
一、学习氨基酸纸层析的大体原理。
二、掌握氨基酸纸层析的操作原理。
(二)实验原理:
转氨基作用是氨基酸代谢进程中的一个重要反映,在转氨酶的催化下,氨基酸的а-酮酸与α-酮基的互换反映称为转氨基作用。
转氨基作用普遍地存在于机体各组织器官中,是体内氨基酸代谢的重要途径。
氨基酸反映时均由专一的转氨酶催化,此酶催化氨基酸的α-氨基转移到另一α-酮基酸上。
各类转氨酶的活性不同,其中肝脏的丙氨酸氨基转移酶(ALT)催化如下反映:
α—酮戊二酸+丙氨酸谷氨酸+丙酮酸 本实验以丙氨酸和α-酮戊二酸为底物,加肝匀浆保温后,用纸层析法检查谷氨酸的出现,以证明转氨基作用。
纸层析属于分派层析。
以滤纸为支持物,滤纸纤维与水亲合力强,水被吸附在滤纸的纤维素的纤维之间形成固定相。
有机溶剂与水不相溶,把预分离物质加到滤纸的一端,使流动溶剂经此向另一端移动,这样物质随着流动相的移动进行持续、动态的不断分派。
由于物质分派系数的不同,而使移动速度就不一样,在固定相中,分派趋势较大的组分,随流动相移动的速度就慢,反之,在流动相分派趋势较大的成份,移动速度快,最终不同的组分彼此分离,物质在纸上移动的速度可以用比值Rf表示:
?
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ALT 物质在必然的溶液中的分派系数是必然的,故比值Rf也相对稳定,因此在同一层析体系中可用Rf值来鉴定被分离的物质。
(三)实验材料与仪器:
试剂:
一、0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液。
二、0.2mol/LNa2HPO4溶液81ml与0.2mol/LNaH2PO4溶液19ml混匀,用蒸馏水稀释20倍。
3、0.1mol/L丙氨酸溶液称取丙氨酸0.891克,先溶于少量0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液中,以1.0NNaOH仔细调至pH7.4后,加磷酸盐缓冲液至100ml。
4、0.1mol/Lα-酮戊二酸称取α-酮戊二酸1.461克,先溶于少量0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液中,以1.0NNaOH仔细调至pH7.4后,加磷酸盐缓冲液至100ml。
五、0.1mol/L谷氨酸溶液称取谷氨酸0.735克,先溶于少量0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液中,以1.0NNaOH仔细调至pH7.4后,加磷酸盐缓冲液至50ml。
六、0.5%茚三酮溶液称取茚三酮0.5克于100ml丙酮中溶解。
7、层析溶剂:
将重蒸过的酚2份和水1份按比例混合后,放入分液漏斗中,震荡,静置24小时后分层,将下部酚层转移到瓶中备用。
仪器:
玻璃匀浆器、10ml试管、培育皿、表面皿、滚水浴锅、37℃恒温水浴箱、9cm圆滤纸、烘箱、手术剪子、分液漏斗。
(四)实验步骤:
一、肝匀浆制备:
取新鲜动物肝0.5克,剪碎后放入匀浆器,加入冷0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液1.0ml,迅速研成匀浆,用上述缓冲液4.5ml混匀备用。
二、酶促反映进程
(1)取离心管两支,编号:
1(测定管)、2(对照管),各加肝匀浆0.5ml。
把对照管放滚水浴中加热10分钟,掏出冷却。
(2)各加0.1mol/L丙氨酸0.5ml,0.1mol/Lα-酮戊二酸0.5ml,0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液 1.5ml,摇匀。
(3)37℃保温,30分钟后掏出,保温完毕。
(4)把测定管放滚水浴中煮10分钟,掏出后冷却,过滤。
3、层析
(1)取圆形滤纸一张(直径9cm)放洁白纸上,以圆点为中心,约1cm为半径,用铅笔画一圆线作为基线,在线上四等份处标清四点编号作为点样原点。
(2)点样:
用四根毛细玻璃管别离进行点样。
把丙氨酸液、谷氨酸液别离点在原点二、4处。
把测定液、对照液别离点在原点一、3处。
注意斑点不宜过大(应在直径0.5cm以下)。
在第一次点样点干后,再在原处一样点第2次。
(3)层析:
先在滤纸圆心处打一小孔(铅笔心粗细),再取滤纸一条卷成捻如灯心状,上端插入滤纸中心孔中,下端剪成须状。
(4)把滤纸平放在上述培育皿上,使纸芯下浸入层析液中,盖上培育皿盖。
可见层析液沿纸芯上升到滤纸中心,渐向周围扩散。
当层析液前缘到离滤纸边缘约1cm时,约25分钟,掏出滤纸,用镊子小心取下纸芯,放入烘箱中烘干。
(5)显色:
将上述滤纸平放在培育皿上,滴0.5%茚三酮的丙酮溶液,使滤纸全数湿润,再放入烘箱干燥,此时可见紫色斑出现,比较色斑的位置,及色泽深浅,计算Rf值,分析是不是发生了转氨基反映。
(五)实验结果记录:
图
(1) (六)实验讨论:
一、从表格
(1)中可以看出,测定管上清液点样出现了两个色斑,按照Rf值的计算也可以看出,测定管中氨基酸发生了转氨基作用,生成的未知物质b为谷氨酸,则未知溶质a为丙氨酸;对照管中因为酶的失活而没有发生转氨基反映,只有丙氨酸,所以色斑只有一个。
二、层析点样时手要洗净,操作中尽可能少量接触滤纸,以避免污染。
3、层析液中含有侵蚀性酚,取历时注意安全,避免溅到皮肤及眼睛。
4、点样点不宜过大,直径小于0.5cm. XX年9月19日篇二:
实验六氨基酸的纸层析法 氨基酸的纸层析法 一.目的 了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方式。
二、原理 以滤纸为支持物的层析法,称为纸层析法。
纸层析所用展层剂大多由水和有机溶剂组成。
展层时,水为静止相,他与滤纸纤维亲和力强;有机溶剂为流动相,它与滤纸纤维亲和力弱。
有机溶剂在滤纸上又下向上移动的,称为上行法;有上向下移动的,称为下行法。
将样品在滤纸上肯定的原点处展层,由于样品中各类氨基酸在两相中不断进行分派,且他们的分离系数各不相同,所以不同的氨基酸随流动相移动的速度也不相同,于是各类氨基酸在滤纸上就彼此分离出来,形成距原点不等的层析点。
在必然条件下(室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等不变),不同的氨基酸有固定的移动速度(Rf值)Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离。
用混合氨基酸做样品时,若是只用一种溶剂展层,由于某些氨基酸的移动速度相同或相近,就不能将它们分开,为此,当用一种溶剂展层后,可将滤纸旋转90度,以第一次所的层析点为原点,在用另一溶剂展层,从而达到分离的目的。
这种方式称为双向层析法。
本实验主要介绍的是单向层析法。
其中混合氨基酸有精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸组成。
三、实验仪器 一、新华滤纸 二、层析缸 3、细线 4、点样管 五、橡皮筋 六、电吹风 7、喷雾器 四、实验试剂 一、混合氨基酸(精氨酸,酪氨酸,苯丙氨酸) 二、展层剂:
正丁醇:
12%氨水:
95%乙醇:
蒸馏水=13:
3:
3:
1(v:
v) 3、0.5%茚三酮—无水丙酮溶液:
0.5g茚三酮溶于100ml无水丙酮,贮于棕色瓶中 五、实验步骤 一、取滤纸剪成20×10厘米的滤纸条一张,在一端打孔,系一根细线,在另一端2~3cm处用铅笔画一横线,中间画一圆点(原点)。
二、取毛细管一支(回收),吸取氨基酸混合液,在原点处点样,样点直径不宜超过5mm,每点一次用吹风机吹干,点2~3次为佳。
3、点样(原文来自:
wWw.xiaOcAofANweN.coM小草范文网:
纸色谱法实验报告)后将滤纸放入层析缸中展层,注意点样线要高于层析液面,滤纸不要贴在层析缸璧上,当展层至另一端1~2cm处时,停止展层(大约2~3小时)。
4、掏出滤纸,用铅笔记下溶剂前沿,然后用热风吹干(或烘箱60℃)烘干。
五、均匀喷上茚三酮—无水丙酮液,注意使溶液不倒流,不中断。
六、用吹风机吹干,观察层析点,肯定其几何中心。
7、量取数值,计算各自的Rf值,与表中标准氨基酸Rf值比较,肯定样品氨基酸种类。
(书上图谱横着看) 六.实验结果 H1=1.0cmH2=4.4cmH3=5.0cmH4=0.99cmH=11.7cm 由此可得 Rf1=0.08547 Rf2=0.37607 Rf3=0.42735 Rf4=0.08461 据此可知,混合氨基酸是由甘氨酸(Gly)和苯丙氨酸(Phy)组成。
七.实验分析 实验中出现了拖尾的现象。
拖尾现象是指展层,显色后在层析分派图上,所看到的某一种氨基酸的分子位移,不是如标准图谱所示的那样,完整地显示在某一名置上,而是形成象笤帚似的那样,前端粗圆而逐渐细小下来,好像拖着一个尾巴。
其图所呈颜色也是由浓渐淡。
图象的出现,是在实验中对影响Rf值的主要因素要求,掌握不够所致。
诸如,物质结构与极性对Rf值的影响,层析溶剂对Rf值的影响,PH对Rf值的影响(溶剂、滤纸和样品的PH值),温度对Rf值的影响,滤纸的质地是不是均匀,薄厚是不是适当,纤维的松紧度是不是适中等对Rf值的影响,展层的方式(上行、下行)对Rf值的影响。
但是在多次实验进程中无论怎佯严格遵循其影响Rf值的主要因素的要求,都仍不可避免地要出现拖尾现象。
此时,这就需要从具体操作规范方面,诸如样品的处置,点样、展层、显色等几个操作程序去考虑思索,经仔细分析,样品的处置是为除去杂质纯化样品,达到层析分 配某氨基酸的情晰显色图像;展层进程是在上述影响Rf值的主要因素要求下进行,使样品达到一个适当的位移,便于在显色后从图象上,区分不一样品的氨基酸;显色是在用配制好的,与水不相混合,并挥发性较快喷雾后迅速吹干的。
更何况显色剂又是含水量极低,不会影响洋品的斑点扩散,那么问题就集中在点样这个操作程序上了。
点样是将被层析分派的几种氨基酸混合液,和为了对如实验结果,而别离配制的几种氨基酸的溶液,用微量点样管或毛细管,或血球计数器将5一j5微升的样品,点在以滤纸为惰性支持物的层析纸上设计好的多点位置中去。
点样后要自然风干,或冷风吹干。
最好不要用加热装置,如吹风机,灯泡之类的热源将其样品点加速干燥。
因为加热装置在学生操作时,一但注意不够,掌握不好,则温度升高必将要使样品破坏,更会使佯品点干的太燥。
正是由于这样,样品点太干燥,使其样品物的分子,牢固地吸牢在层析纸的纤维上。
所以在展层进程中,样品点的每一个物质分子,不能在层析纸上同时起步,而是形成了有先有后,鱼贯而上行或下行的状况,最终使洋品物质的分子,不能同时都集中抵达一个位置。
致使在显色后,实验结果的图象上,观察到的不是一个完整的斑点,而是一个拖着尾巴的斑点。
这就是上述所说的拖尾现象。
纸上分派层析所出现的拖尾现象,究其原因很简单,就是在点样品后,样品点吹的太干燥所致。
样品点不要吹的太干燥,不然,样品物质的分子,会牢吸在层析纸的纤维上,出现拖尾现象”。
影响Rf值的主要因素篇三:
柱色谱分离实验报告 柱色谱分离实验报告