纸色谱法实验报告doc.docx

1、纸色谱法实验报告doc纸色谱法实验报告篇一：实验六 纸层析法观察转氨基作用 实验报告实验六 纸层析法观察转氨基作用【实验名称】：纸层析法观察转氨基作用09救援一班 第三大组 李岚宇 XX222336室温：28（一）实验目的：一、学习氨基酸纸层析的大体原理。二、掌握氨基酸纸层析的操作原理。（二）实验原理：转氨基作用是氨基酸代谢进程中的一个重要反映，在转氨酶的催化下，氨基酸的-酮酸与-酮基的互换反映称为转氨基作用。转氨基作用普遍地存在于机体各组织器官中，是体内氨基酸代谢的重要途径。氨基酸反映时均由专一的转氨酶催化，此酶催化氨基酸的氨基转移到另一酮基酸上。各类转氨酶的活性不同，其中肝脏的丙氨酸氨基转

2、移酶（ALT）催化如下反映：酮戊二酸 + 丙氨酸谷氨酸 + 丙酮酸本实验以丙氨酸和-酮戊二酸为底物，加肝匀浆保温后，用纸层析法检查谷氨酸的出现，以证明转氨基作用。纸层析属于分派层析。以滤纸为支持物，滤纸纤维与水亲合力强，水被吸附在滤纸的纤维素的纤维之间形成固定相。有机溶剂与水不相溶，把预分离物质加到滤纸的一端，使流动溶剂经此向另一端移动，这样物质随着流动相的移动进行持续、动态的不断分派。由于物质分派系数的不同，而使移动速度就不一样，在固定相中，分派趋势较大的组分，随流动相移动的速度就慢，反之，在流动相分派趋势较大的成份，移动速度快，最终不同的组分彼此分离，物质在纸上移动的速度可以用比值Rf表示

3、： ?ALT物质在必然的溶液中的分派系数是必然的，故比值Rf也相对稳定，因此在同一层析体系中可用Rf值来鉴定被分离的物质。（三）实验材料与仪器：试剂：一、0.01mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液。二、0.2mol/L Na2HPO4溶液81ml与0.2mol/L NaH2PO4溶液19ml混匀,用蒸馏水稀释20倍。3、0.1mol/L丙氨酸溶液称取丙氨酸0.891克,先溶于少量0.01mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液中,以1.0 N NaOH仔 细调至pH7.4后, 加磷酸盐缓冲液至100ml。4 、0.1mol/L酮戊二酸称取酮戊二酸1.461克,先溶于少量0.01mol/L pH

4、7.4磷酸盐缓冲液中，以1.0 N NaOH仔细调至pH 7.4 后，加磷酸盐缓冲液至100ml。五、0.1mol/L 谷氨酸溶液称取谷氨酸0.735克,先溶于少量0.01mol/LpH 7.4磷酸盐缓冲液中，以1.0 N NaOH仔细调至pH 7.4 后, 加磷酸盐缓冲液至50 ml。六、0.5%茚三酮溶液称取茚三酮0.5克于100 ml丙酮中溶解。7、层析溶剂：将重蒸过的酚2份和水1份按比例混合后，放入分液漏斗中，震荡，静置24小时后分层，将下部酚层转移到瓶中备用。仪器：玻璃匀浆器、10ml试管、培育皿、表面皿、滚水浴锅、37恒温水浴箱、9cm圆滤纸、烘箱、手术剪子、分液漏斗。（四）实验步

5、骤:一、肝匀浆制备：取新鲜动物肝0.5克,剪碎后放入匀浆器,加入冷0.01mol/LpH 7.4磷酸盐缓冲液1.0 ml,迅速研成匀浆， 用上述缓冲液4.5ml混匀备用。二、 酶促反映进程（1）取离心管两支，编号：1（测定管）、2（对照管），各加肝匀浆0. 5ml。把对照管放滚水浴中加热10分钟，掏出冷却。（2）各加0.1mol/L丙氨酸0.5 ml, 0.1mol/L-酮戊二酸0.5 ml,0.01mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液1.5 ml,摇匀。（3）37保温，30分钟后掏出，保温完毕。（4）把测定管放滚水浴中煮10分钟，掏出后冷却，过滤。3、层析（1）取圆形滤纸一张（直径9cm）放

6、洁白纸上，以圆点为中心，约1 cm为半径,用铅笔画一圆线作为基线,在线上四等份处标清四点编号作为点样原点。（2）点样：用四根毛细玻璃管别离进行点样。把丙氨酸液、谷氨酸液别离点在原点二、4处。把测定液、对照液别离点在原点一、3处。注意斑点不宜过大（应在直径0.5cm以下）。在第一次点样点干后，再在原处一样点第2次。（3）层析：先在滤纸圆心处打一小孔（铅笔心粗细），再取滤纸一条卷成捻如灯心状,上端插入滤纸中心孔中，下端剪成须状。（4）把滤纸平放在上述培育皿上，使纸芯下浸入层析液中，盖上培育皿盖。可见层析液沿纸芯上升到滤纸中心，渐向周围扩散。当层析液前缘到离滤纸边缘约1cm时，约25分钟，掏出滤纸，

7、用镊子小心取下纸芯，放入烘箱中烘干。（5）显色：将上述滤纸平放在培育皿上，滴0.5茚三酮的丙酮溶液，使滤纸全数湿润，再放入烘箱干燥，此时可见紫色斑出现，比较色斑的位置，及色泽深浅，计算Rf值，分析是不是发生了转氨基反映。 （五）实验结果记录： 图（1）（六）实验讨论：一、从表格（1）中可以看出，测定管上清液点样出现了两个色斑，按照Rf值的计算也可以看出，测定管中氨基酸发生了转氨基作用，生成的未知物质b为谷氨酸，则未知溶质a为丙氨酸；对照管中因为酶的失活而没有发生转氨基反映，只有丙氨酸，所以色斑只有一个。二、层析点样时手要洗净，操作中尽可能少量接触滤纸，以避免污染。3、层析液中含有侵蚀性酚，取历

8、时注意安全，避免溅到皮肤及眼睛。4、点样点不宜过大，直径小于0.5cm.XX年9月19日篇二：实验六 氨基酸的纸层析法氨基酸的纸层析法一目的了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方式。二、原理以滤纸为支持物的层析法，称为纸层析法。纸层析所用展层剂大多由水和有机溶剂组成。展层时，水为静止相，他与滤纸纤维亲和力强；有机溶剂为流动相，它与滤纸纤维亲和力弱。有机溶剂在滤纸上又下向上移动的，称为上行法；有上向下移动的，称为下行法。将样品在滤纸上肯定的原点处展层，由于样品中各类氨基酸在两相中不断进行分派，且他们的分离系数各不相同，所以不同的氨基酸随流动相移动的速度也不相同，于是各类氨基酸在滤纸上就彼此分离出来，形

9、成距原点不等的层析点。在必然条件下（室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等不变），不同的氨基酸有固定的移动速度（Rf值）Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离。用混合氨基酸做样品时，若是只用一种溶剂展层，由于某些氨基酸的移动速度相同或相近，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，可将滤纸旋转90度，以第一次所的层析点为原点，在用另一溶剂展层，从而达到分离的目的。这种方式称为双向层析法。本实验主要介绍的是单向层析法。其中混合氨基酸有精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸组成。三、实验仪器一、 新华滤纸二、 层析缸3、 细线4、 点样管五、 橡皮筋六、 电吹风7、 喷雾器四、实验试剂一、 混合

10、氨基酸（精氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸）二、展层剂：正丁醇：12%氨水：95%乙醇：蒸馏水=13：3：3：1（v:v）3、0.5%茚三酮无水丙酮溶液：0.5g茚三酮溶于100ml无水丙酮，贮于棕色瓶中五、实验步骤一、取滤纸剪成2010厘米的滤纸条一张，在一端打孔，系一根细线，在另一端23cm处用铅笔画一横线，中间画一圆点（原点）。二、取毛细管一支(回收)，吸取氨基酸混合液，在原点处点样，样点直径不宜超过5mm,每点一次用吹风机吹干，点23次为佳。3、点样(原文来自：wWw.xiaOcAofANweN.coM 小 草 范 文 网:纸色谱法实验报告)后将滤纸放入层析缸中展层，注意点样线要高于层析液面，滤

11、纸不要贴在层析缸璧上，当展层至另一端12cm处时，停止展层（大约23小时）。4、掏出滤纸，用铅笔记下溶剂前沿，然后用热风吹干（或烘箱60）烘干。五、均匀喷上茚三酮无水丙酮液，注意使溶液不倒流，不中断。六、用吹风机吹干，观察层析点，肯定其几何中心。7、量取数值，计算各自的Rf值，与表中标准氨基酸Rf值比较，肯定样品氨基酸种类。（书上图谱横着看）六实验结果H1=1.0cmH2=4.4cm H3=5.0cm H4=0.99cm H=11.7cm由此可得Rf1=0.08547Rf2=0.37607Rf3=0.42735Rf4=0.08461据此可知，混合氨基酸是由甘氨酸（Gly）和苯丙氨酸（Phy）组

12、成。七实验分析实验中出现了拖尾的现象。拖尾现象是指展层，显色后在层析分派图上，所看到的某一种氨基酸的分子位移，不是如标准图谱所示的那样，完整地显示在某一名置上，而是形成象笤帚似的那样，前端粗圆而逐渐细小下来，好像拖着一个尾巴。其图所呈颜色也是由浓渐淡。图象的出现，是在实验中对影响Rf值的主要因素要求，掌握不够所致。诸如，物质结构与极性对Rf值的影响，层析溶剂对Rf值的影响，PH对Rf值的影响(溶剂、滤纸和样品的PH值)，温度对Rf值的影响，滤纸的质地是不是均匀，薄厚是不是适当，纤维的松紧度是不是适中等对Rf值的影响，展层的方式(上行、下行)对Rf值的影响。但是在多次实验进程中无论怎佯严格遵循其

13、影响Rf值的主要因素的要求，都仍不可避免地要出现拖尾现象。此时，这就需要从具体操作规范方面，诸如样品的处置，点样、展层、显色等几个操作程序去考虑思索，经仔细分析，样品的处置是为除去杂质纯化样品，达到层析分配某氨基酸的情晰显色图像；展层进程是在上述影响Rf值的主要因素要求下进行，使样品达到一个适当的位移，便于在显色后从图象上，区分不一样品的氨基酸；显色是在用配制好的，与水不相混合，并挥发性较快喷雾后迅速吹干的。更何况显色剂又是含水量极低，不会影响洋品的斑点扩散，那么问题就集中在点样这个操作程序上了。点样是将被层析分派的几种氨基酸混合液，和为了对如实验结果，而别离配制的几种氨基酸的溶液，用微量点样

14、管或毛细管，或血球计数器将5一j5微升的样品，点在以滤纸为惰性支持物的层析纸上设计好的多点位置中去。点样后要自然风干，或冷风吹干。最好不要用加热装置，如吹风机，灯泡之类的热源将其样品点加速干燥。因为加热装置在学生操作时，一但注意不够，掌握不好，则温度升高必将要使样品破坏，更会使佯品点干的太燥。正是由于这样，样品点太干燥，使其样品物的分子，牢固地吸牢在层析纸的纤维上。所以在展层进程中，样品点的每一个物质分子，不能在层析纸上同时起步，而是形成了有先有后，鱼贯而上行或下行的状况，最终使洋品物质的分子，不能同时都集中抵达一个位置。致使在显色后，实验结果的图象上，观察到的不是一个完整的斑点，而是一个拖着尾巴的斑点。这就是上述所说的拖尾现象。纸上分派层析所出现的拖尾现象，究其原因很简单，就是在点样品后，样品点吹的太干燥所致。样品点不要吹的太干燥，不然，样品物质的分子，会牢吸在层析纸的纤维上，出现拖尾现象”。影响 Rf值的主要因素篇三：柱色谱分离实验报告柱色谱分离实验报告